细菌分离培养、接种技术及培养方法-精品医学课件

三、实验步骤和方法
2.接种环境：生物安全柜或无菌室等。
目的：避免接种过程中标本中的细菌污染环境及环境中 的细菌污染培养物，细菌(特别是传染性强的病原微生物) 应在特定环境内接种。 3. 接种方法：根据待检标本性质、培养目的和所用培养基的
性质采用不同的接种方法。 (1) 平板划线分离培养法 目的：获取单个菌落。 方法：连续划线分离法和分区划线分离法。
实验步骤和方法
1.接种工具：接种针和接种环，由三部分组成，即环(针)、 金属柄和绝缘柄三部分。环(针)部分以白金丝制成为佳， 因其硬度适宜，易传热散热，火焰灭菌后冷却快，不易 生锈经久耐用，但因其昂贵，通常用300～500W电热 (镍)丝代替。
方法：接种针(环)通常用酒精灯或煤气灯烧灼灭菌。 接种针用于穿刺半固体培养基，接种环用于固体、液体 培养基的细菌接种。
革兰染色法
Gram staining
临床微生物与免疫学检验教研室
一、实验目的
1.掌握细菌涂片制作方法； 2.掌握革兰染色法和细菌的基本形态； 3.了解革兰染色法的临床意义。
二、革兰染色原理
原理
细胞壁学说 等电点学说 化学学说
革兰阳性菌 细胞壁肽聚糖形成网状 结构，乙醇处理时，脱水 引起网状结构孔径变小， 通透性降低，结晶紫-碘 复合物不易脱去
七、临床意义
1.通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类，可 初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。 2.革兰染色除用以鉴定细菌外，病原菌染色性可为临床 选择用药提供了参考，可帮助临床制定有针对性治疗方 案。
具体操作
• 细菌接种（平板、斜面、液体、半固体）。 • 革兰氏染色
实验步骤和方法
(3)液体接种法：
用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体培养基的接 种，观察不同细菌的生长现象和生化反应。
方法：用接种环从平板上挑取细菌菌落，先在液面较 低一侧的试管壁上研磨并沾取少许液体培养基与之 调和，使细菌均匀分布于培养基中。管口灭菌后加 塞，标记，经35℃孵育18～24h，观察并记录细菌 在液体培养基中的生长现象。由于菌种不同，可出 现均匀混浊、沉淀生长或表面生长(形成菌膜)等不 同的生长现象。
细菌分离培养、接种 技术及培养方法
一、实验目的
1.掌握平板、斜面、液体和半固体培养基接种方法。 2. 熟悉接种细菌用具、接种细菌的环境要求和无菌操
作要领。 3. 了解细菌需氧、厌氧和二氧化碳培养方法。
二、实验器材和试剂
1. 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 2. 培养基：液体、半固体、斜面、琼脂平板培养基。 3. 其他：接种环、接种针。 4. 普通孵育箱、磨口玻璃干燥器、厌氧盒。
实验步骤和方法
1)连续划线分离法：①将接种环火焰灭菌，待冷后取标 本少许；②左手持平板，五指固定平皿盖边缘，向外反 转手掌，装有培养基的平板于手掌内用拇指、小指和 无名指固定，并将平板边缘稍微提高呈现30～45度角， 置酒精灯前上方5～6cm；③右手持已取材的接种环， 先在平板一端涂布，然后快速大幅度左右来回以密而 不重的曲线形式作连续划线接种，使整个平板布满曲 线④划线完毕，将平板作好标记，置35℃孵育18-
(5)涂布接种法：在药敏试验课讲解
培养方法
常用细菌培养方法可分为四类，即需氧(普通)、 二氧化碳、微需氧和厌氧培养法。 1 需氧培养法：将已接种细菌的培养基置35℃ 孵育箱18-24h，观察细菌生长情况。一般细 菌孵育18～24h即可出现明显生长，但若标本 中的细菌量少或细菌生长较慢，则需培养3～ 7天，甚至4～8周后才能观察到生长迹象。本 法适用于需氧菌和兼性厌氧菌。
培养方法
2 二氧化碳培养法 (1)二氧化碳孵箱：能自动调节二氧化碳的含量和温度， 使用较为方便。 (2)烛缸法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨 口处涂以凡士林。将接种细菌的培养基放入缸中，点燃 缸内蜡烛，加盖密封。当蜡烛燃烧时会消耗缸内氧气并 产生CO2，随着缸内氧气的逐渐减少，蜡烛会自行熄 灭，此时缸内CO2浓度约为5％左右。 (3)化学法(重碳酸钠一盐酸法)：（自学）
实验步骤和方法
(2)斜面接种法：
主要用于纯菌移种，以进一步鉴定或保存菌种。 方法：以灭菌接种环挑取细菌后伸入斜面培养基，从斜 面底部向上先划一条直线，然后再由底向上作曲线划 线，直至斜面顶部。管口灭菌后标记，经35℃孵育18～ 24h，斜面培养物呈均匀一致的菌苔，如表面不均匀， 表示培养物不纯。
实验步骤和方法
(4)半固体穿刺接种法：用于半固体培养基和KIA培养基 的接种，以保存菌种或观察细菌的动力和生化反应。
方法：用接种针挑取大肠埃希菌和福氏志贺菌培养物， 于半固体培养基的中心处向下垂直穿刺接种，直至试管 底部上方5mm左右(不能穿至试管底)，接种后的接种针 沿原穿刺线退出；管口灭菌后加塞、标记，经35℃18～ 24h，观察结果。有鞭毛的细菌(如大肠埃希菌)能够沿 穿刺线向四周扩散生长，为动力试验阳性；而无鞭毛的 细菌只能够沿穿刺线生长，不能扩散，为动力试验阴性。
• 上述方法适用于奈瑟菌属和布鲁菌属等苛养菌的培养。
3 厌氧菌培养方法：
(1)厌氧罐培养法： 常用的方法有冷触酶法和抽换气法，钢末法等，冷触
酶法，钢末法较为简便安全，抽气换气法比较可靠。
• (2) 厌氧袋或厌氧盒法
• （3）厌氧手套箱法：
厌氧手套箱是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳 仪器之一，它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一 个有机玻璃或塑料薄膜做的透明面板，板上装有两个手 套，可通过手套在箱内操作故名。由手套操作箱及传递 两个主要部分组成，操作箱内有一个小型恒温培养箱。 适应于在厌氧环境中连续进行标本接种，培养和鉴定等 全部工作。除某些脆弱类杆菌和产气荚膜梭菌外，大多 数厌氧菌的初代培养生长较慢，故厌氧培养在37℃至少 应培养48小时。如疑为放线菌应则延长72-96h
⑴初染：加龙胆紫液染色10秒，水洗，甩干； （龙胆紫，乙醇）
⑵媒染：加碘溶液染色10秒，水洗，甩干； （碘，碘化钾）
⑶脱色：加脱色液脱色（10-20）秒，水洗，甩干； （丙酮，乙醇）
⑷复染：加沙黄溶液复染10秒，水洗；（沙黄，乙醇）
五、染色结果观察
G+百度文库
G-
六、影响染色因素
⑴操作因素：涂片太薄或太厚，固定时菌体过分受热以 及脱色时间长短，都会影响染色结果。 ⑵染液因素：所有染液应防止染液蒸发，特别是卢戈碘 液久存或受光作用后失去媒染作用；涂片积水过多改变 浓度，影响染色效果，如脱色用的乙醇以95％为宜，浓 度降低会增强其脱色能力。 ⑶细菌因素：一般以18~24小时的培养物染色效果最好。
革兰阴性菌
细胞壁肽聚糖含量低， 脂类物质含量高，乙醇处 理时，脂类物质溶解，细 胞壁的通透性增加，结晶 紫-碘复合物易脱去
三、实验器材和试剂
1.标本 ：金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的培养物。 2.试剂 ：革兰染液。 3.其他 ：载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、显微镜。
四、操作步骤
1. 细菌涂片制备 ⑴涂片：取洁净载玻片一张，按无菌的方法取1~2环生 理盐水于载玻片上，按无菌的方法各取葡萄球菌和大肠埃 菌 培养物少许，在生理盐水中均匀研磨，涂好的菌膜直径 1cm左右。 ⑵干燥：室温下自然干燥或于酒精火焰半尺高处烘干。 ⑶固定：火焰加热法。目的是杀死细菌，并使菌体与载 玻片粘附牢固，染色时不致于被染液和水冲掉。
2.经典染色步骤 ⑴初染：将结晶紫加于制好的涂片上，染色1min，
用细流水冲洗，甩去积水。 ⑵媒染：加卢戈碘液作用1min，用细流水冲洗，
甩去积水。 ⑶脱色：滴加95％乙醇数滴，摇动玻片，使均匀
脱色30S，用细流水冲洗，甩去积水。 ⑷复染：加稀释石炭酸复红30S，用细流水冲洗，
甩去积水。
3.快速染液的步骤
24h观察结果。
实验步骤和方法
2)分区划线分离法： 用接种环取标本涂布于平板并在1区内作数次密集划线， （1区面积不超过平版的1/4）再在2、3、4区依次划线， 每划完一个区域是否需要对接种环烧灼灭菌视标本中含 菌量多少而定。每一区的划线与上区交叉接触3～4次， 各区线间保持一定距离，如此后一区菌量少于前一区， 逐渐减少直至划线上的细菌呈单个菌分布，生长繁殖成 单个菌落。其操作要领同连续划线分离法。