实验五 细菌的分离、接种和培养
实验五 微生物的分离、接种及培养法
实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。
2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。
二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。
在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。
三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。
2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。
3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。
四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。
具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。
（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。
（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。
然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。
细菌的分离培养与纯培养实验报告
细菌的分离培养与纯培养实验报告一、实验目的本实验旨在掌握细菌的分离培养方法，了解纯培养的原理及方法，以及熟悉细菌培养基的制备和使用。
二、实验原理1. 细菌分离培养方法细菌分离培养是指将混合菌落中的单一细菌分离出来，使其在无竞争的环境中独立生长。
常用的方法有均匀涂布法、斜坡涂布法和点式涂布法。
2. 纯培养原理及方法纯培养是指将混合菌落中同一种细菌分离出来并进行单独培养。
常用的方法有挑选法和稀释法。
3. 细菌培养基制备与使用细菌培养基是供给微生物生长发育所需营养物质和条件的一种人工环境。
根据不同需求可制备不同类型的细菌培养基，如寒偏好性、厭氧性、选择性、差异性等。
常用的细菌培养基有普通营养琼脂平板、LB 平板等。
三、实验步骤1. 细菌分离培养（1）取一支无菌的铂丝，将其消毒并冷却。
（2）取一份混合菌落，将铂丝在其表面轻轻刮几下，使细菌附着在铂丝上。
（3）将铂丝均匀涂布于琼脂平板上。
（4）重复以上步骤，涂布多个琼脂平板。
（5）将琼脂平板放置于恒温箱中，在适宜的温度下培养。
2. 纯培养（1）取一份混合菌落，在显微镜下观察并挑选出同一种细菌。
（2）取一支无菌的铂丝，在混合菌落表面轻轻刮几下，使细菌附着在铂丝上。
（3）将铂丝均匀涂布于琼脂平板上，并进行单独培养。
3. 细菌培养基制备与使用（1）按照需要制备不同类型的细菌培养基，并进行消毒灭菌处理。
（2）将需要进行分离或纯化的混合菌落均匀涂布于培养基上，进行培养。
四、实验结果1. 细菌分离培养经过适当时间的培养后，可看到琼脂平板上出现单一的细菌菌落。
2. 纯培养经过适当时间的培养后，可看到琼脂平板上只有挑选出的同一种细菌菌落。
3. 细菌培养基制备与使用制备好的细菌培养基可用于分离、纯化和大量繁殖特定细菌。
五、实验注意事项1. 实验器材需消毒并严格无菌操作。
2. 均匀涂布法需注意铂丝在琼脂平板上均匀涂布。
3. 液体培养基需注意摇晃均匀以使细菌均匀分布。
4. 实验结束后要彻底清洗和消毒实验器材和工作台面。
(优选)实验五培养基的使用特点和微生物接种方法
2. 富集培养
富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生 理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特 定微生物的需要。
常用的选择培养基
S.S琼脂（沙门氏菌、志贺氏菌分离用培养基）
组成成分：乳糖、胆盐、柠檬酸铁、柠檬酸纳、煌绿、 中性红、硫代硫酸钠等，强选择性抑制大肠杆菌，分 离沙门菌 煌绿、胆盐、柠檬酸纳抑制非肠道菌 大肠杆菌分解乳糖而产酸，使胆盐析出，菌落中 心浑浊呈深红色，柠檬酸铁可使产生硫化氢的菌 落呈黑色 硫代硫酸钠缓和胆盐对沙门氏菌的有害作用，中 和煌绿、中性红的毒性，使大肠杆菌的红色菌落 更加鲜艳
三糖铁琼脂或克氏双糖铁
三糖铁琼脂含有乳糖、蔗糖、和葡萄糖，蔗糖：区别普
通变形杆菌（＋）、沙门氏菌（-）
克氏双糖铁成分 蛋白胨； 牛肉膏 ； 酵母膏 ；乳糖 ；
葡萄糖； 氯化钠 ； 柠檬酸铁铵 ；硫代硫酸钠 ； 琼脂 ； 酚红为指示剂，黄色为产酸，红色为产碱
观察克氏双糖接种后斜面、底层产酸、产气、产H2S的情 况，通常大肠杆菌斜面不产酸、底层产酸产气、不产H2S
今天的实验
菌种：大肠杆菌、沙门菌、青霉 采用无菌操作进行移植 学会分区划线 所有平皿和试管必须有标记 18－24小时（真菌下周观察）观察试验结
果，描述固体培养和液体培养的细菌培养 特征
步骤
两个人为一组，一个接种大肠杆菌，一个 接种沙门菌
LB液体移植 普通琼脂：分区划线 麦康凯：分区划线 半固体：穿刺 克氏双糖：先穿刺后接种斜面
三、选择培养分离
1. 利用选择平板进行直接分离
高温下培养：分离嗜热细菌； 培养基中不含N：分离固氮菌； 培养基加抗生素：分离抗性菌；
待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制
实验五 高氏一号合成培养基的制备、土壤中放线菌的分离
实验五 高氏一号合成培养基的制备、土壤中放线菌的分离实验目的：掌握配制合成培养基的一般方法。
掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。
实验材料：药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂。
其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。
实验原理：高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。
这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4•3H2O 、MgSO4•7H2O 作为无机盐，FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。
放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。
由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。
分离放线菌常用稀释倒平板法。
根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。
如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。
再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。
实验内容：1.高氏一号合成培养基的制备先将可溶性淀粉称好，在小烧杯内用50~100ml水调成糊状，再在另一容器内加入900~950ml热水，将小烧杯内淀粉倒入混匀。
再分别称取其它药品，并加热搅拌使之溶解后，调pH至7.2~7.4，分装，0.1Mpa（15lb/in2）15~30min高压蒸汽灭菌。
2.土壤中放线菌的分离（1）取9套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5）、组别、姓名、操作日期等。
培养微生物五个步骤
培养微生物五个步骤培养微生物是微生物学研究中非常重要的一环，通过培养可以获得大量的微生物，从而进行各种实验和研究。
下面将介绍培养微生物的五个步骤。
第一步：选择培养基培养基是培养微生物的基础，选择合适的培养基对于微生物的生长和繁殖至关重要。
培养基可以分为固体培养基和液体培养基两种形式。
固体培养基通常是用琼脂糖制成的，而液体培养基则是溶解在适当的溶液中。
在选择培养基时需要考虑微生物的类型和所需的生长条件，例如温度、pH值等。
第二步：准备培养基准备培养基时需要按照一定的比例混合各种成分，并加热至溶解。
然后将培养基分装到培养皿或试管中，并进行高温高压灭菌，以杀死其中的微生物和孢子。
灭菌后，将培养基冷却至适宜的温度，使其凝固（固体培养基）或保持液态状态（液体培养基）。
第三步：接种微生物接种微生物是将待培养的微生物转移到培养基中的过程。
接种时需要用无菌的工具（如匀菌针或无菌吸管）取少量微生物液体或菌落，均匀涂抹在培养基表面（固体培养基）或加入培养基中（液体培养基）。
接种后需要注意避免交叉污染，以保证培养的纯度。
第四步：培养微生物培养微生物的过程中需要提供适宜的生长条件，如适宜的温度、湿度和氧气含量。
对于不同的微生物，这些条件可能有所不同。
在培养过程中，需要定期观察和记录微生物的生长情况，如菌落的形状、颜色和大小等。
培养时间的长短也取决于微生物的生长速度。
第五步：分离纯种在培养微生物的过程中，可能存在多种微生物混合生长的情况。
为了得到纯种微生物，需要进行分离。
常用的分离方法有传代分离法、挑选分离法和稀释分离法等。
通过这些方法，可以将不同的微生物分离出来，得到纯种菌株。
总结起来，培养微生物的五个步骤分别是选择培养基、准备培养基、接种微生物、培养微生物和分离纯种。
通过这些步骤，可以获得大量的微生物，为微生物学研究提供了基础条件。
在进行微生物培养时，需要注意无菌操作，以避免外来的污染。
此外，培养条件的选择要根据微生物的需求进行调整，以促进微生物的生长和繁殖。
实验五真菌的分离培养及形态观察
实验五真菌的分离培养及形态观察真菌分离培养应考虑所分离真菌的特性，配制合适的培养基，选择所需的气体环境。
同时, 由于真菌分离材料常污染有大量细菌，所以可在培养基中加入抗菌素并在分离培养过程中严格执行无菌操作。
目的要求1．掌握真菌分离培养方法。
2．认识真菌菌落的特征，比较与细菌菌落有何不同。
3．了解真菌载片培养法。
4．掌握观察真菌的基本方法，并观察其形态特征。
操作步骤—、真菌的分离培养方法（－）平板划线分离法1．取适合真菌的琼脂培养基融化，冷至45℃，注入无菌平皿中，每皿15～20ml，制成平板待用。
2．取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水的试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。
3．将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线(同细菌的划线法)。
4．划线完毕，置温箱中培养2～5d，待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检查，若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。
如有杂菌可从单个菌落中钓少许菌制成悬液，再作划线分离培养，有时需反复多次，才得纯种。
另外，也可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种真菌的纯培养。
（二）稀释分离法1．取盛有无菌水的试管5支（每管9ml），分别标记1、2、3、4、5号。
取样品（如田土等）1g，投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。
2．用1ml灭菌吸管，按无菌操作法，从1号管中吸取1ml悬浮液注入2号管中，并摇匀；同样由2号管取1ml至3号管，依此类推，直至5号管。
注意每稀释一管应更换一支灭菌吸管。
3．用2支无菌吸管分别由4号、5号试管中各取1ml悬液，并分别注入2个灭菌培养皿中，再加入融化后冷至45℃的琼脂培养基约15ml，轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成平板。
然后倒置温箱中培养，2～5d后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。
二．真菌培养性状观察（一）真菌在固体培养基上的生长表现1 .酵母菌菌落：酵母菌在固体培养基上多呈油脂状或蜡脂状，表面光滑、湿润、黏稠，有的表面呈粉粒状、粗糙或皱褶。
细菌的分离培养与移植实验报告
实验五细菌的分离培养与移植[实验目的]1、掌握细菌分离培养及移植的基本要领和方法。
[实验原理]在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。
分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。
在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。
同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。
[实验材料]菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌等。
器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)。
培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂平板、酒精灯、接种环。
[实验内容]1、细菌的分离平板划线接种法通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。
若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
可用做分离纯种细菌。
操作方法（三区划线法）：a、右手拿接种环，烧灼冷却后，勾取菌种。
b、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。
划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
c、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
d、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
e、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
平板分区划线法培养后菌落分布情况平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。
实验五 产淀粉酶细菌的分离(一)培养基的制备及常用器皿的准备
综合性实验
实验五 产淀粉酶细菌的分离（一） 培养基的制备及常用器皿的准备
河南工业大学微生物学实验室
一、实验目的及要求
1、学会培养基的制备和常用器皿的准 备方法 2、学会高压蒸汽灭菌及干热灭菌方法
二、实 验 原理
将样品制成菌悬液，80℃ 水
浴处理10分钟。
选择
将菌悬液适当稀释后，在淀粉 平板上进行涂布分离培养；加 入碘液显色后，挑取透明圈直 径较大的菌落。
鉴别
电热鼓风干燥箱（干热灭菌用）
五、 作 业 题
1、高压蒸汽灭菌和干热灭菌各适用于哪 些物品？ 2、两种灭菌技术应注意哪些关键操作？ 3、培养皿等干热灭菌前包扎的目的？
4、培养皿桶1个。
5、1-2ml刻度吸管2支。 6、洗耳球1个、玻璃棒1支。 7、搪瓷量杯1个。 8、量筒1个。
纱布、棉花、棉绳、培养基、天平等在最后一排实验台
四、实验方法和步骤
1、营养琼脂培养基的配制 称量1.2克可溶性淀粉。加少量水加热溶化， 然后加入6.8克营养琼脂，加水至150毫升，煮 沸后倒入250ml容量的三角瓶中，加棉塞灭菌。
四、实验方法和步骤
2、无菌水的制备（稀释用）
取 9ml 蒸馏水于试管（ 18×180mm）中，塞 棉塞，报纸包扎后湿热灭菌。 取 90ml 蒸馏水于 250ml 三角瓶中，塞棉塞， 报纸包扎后湿热灭菌。
手提小型高压蒸汽灭菌
立式高压蒸汽灭菌
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实验五：细菌的分离、接种和培养
一、实验目的：
熟悉从环境（土壤、水体、活性污泥等）中分离培养细菌的方法，掌握以下几种细菌纯培养过程中所涉及的各种技能：
（1）倒平板；
（2）细菌纯种分离：稀释平板分离法和平板划线法；
（3）接种技术：斜面接种技术、稀释平板涂布法等；
（4）无菌操作技术。
并了解不同的微生物在固体培养基中的生长特征。
二、实验原理
在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养。
一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
三、实验试剂与器材
1.牛肉膏蛋白胨培养基；
2.试管、三角烧瓶、培养皿；
3.接种环，土样，酒精灯等。
四、操作步骤
1.每组配牛肉膏蛋白胨培养基200 mL，放在三角瓶中，加热溶解后取5 mL加至试管中，
每人做一支试管。
其配方如下: 牛肉膏3 g、蛋白胨l0g、NaCl 5 g、琼脂15—20 g、水1000 mL、pH 7.4—7.6
2.每组包10个培养皿，待灭菌。
3.将试管、空的培养皿、剩余的培养基以及10 mL蒸馏水放入高压灭菌锅灭菌于121 o C
下20 min。
4.倒平板：在无菌操作台上，将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，并标明培养基的
名称。
5.在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。
贴在距试管口径2-3厘米的
位置。
6.待培养皿和试管中的培养基冷却凝固后，点燃酒精灯。
7.接种。
取接种环：右手拿接种环(如握钢笔一样)、在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。
环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触边壁，使其冷却。
取菌种：待环冷却后轻轻沾取经稀释10倍的土壤悬液-环，然后将接种环移出菌种管，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。
接种：在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环在平板上划线。
划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。
常用的划线方法有下列二种：
(1)用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线
3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次
划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线
和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图A)。
划线完毕后，盖上皿盖，倒
置于37℃温室中培养。
(2)将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线(图B)。
划线完毕后，盖上皿盖，
倒置温室培养。
环灭菌将接种环烧红灭菌。
5.培养1周后观察。
四、注意事项:实验操作过程中无菌操作。
五、思考题
1. 简述无菌操作过程中的注意点。