细菌分离培养及药敏试验方法及步骤
大肠埃希氏菌的分离鉴定与药敏试验
大肠埃希氏菌的分离鉴定与药敏试验作者：张鑫来源：《当代畜禽养殖业》 2019年第2期张鑫浙江省湖州市安吉县天荒坪镇畜牧兽医站 313300摘要：大肠埃希氏菌通常被称作大肠杆菌，外文名称（学名）Escherichia coli。
它属于细菌界，变形菌门，V-变形菌纲，肠杆菌目，肠杆菌科，埃希氏菌属，大肠杆菌种。
大肠杆菌主要寄生于人和动物的大肠内，约占肠道菌的1%。
是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。
该菌常引起动物严重腹泻和败血症。
关键词：大肠埃希氏菌；分离鉴定；药敏试验近年来随着集约化养鸡业的迅速发展，大肠杆菌病的流行日趋严重，其不仅使患病的鸡群生长发育受阻，饲料转化率下降，死淘率及屠宰废弃率增加，而且种鸡及产蛋鸡的蛋品质下降，孵化率降低，以及治疗费用增加等等，给养鸡户造成了极大的经济损失。
1 大肠埃希氏菌的主要特点大肠埃希氏菌属于原核生物，具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核，有拟核。
细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。
大肠埃希氏菌属于异养兼性厌氧型。
大肠埃希氏菌和人体在不致病的情况下可认为是互利共生，在致病的情况下可认为是寄生。
大肠埃希氏菌遇到伊红美蓝，菌落呈深紫色，并有金属光泽。
2 大肠埃希氏菌导致的疾病（1）鸡大肠杆菌病引起的急性败血症。
各种日龄的鸡均可发病，病鸡腹泻或呼吸困难。
剖检心脏和肝脏，表面覆盖一层容易剥离的白色纤维素膜(肝周炎、心包炎)，肉鸡大肠杆菌病还容易继发肉鸡腹水症。
（2）雏鸡脐炎。
该病一般是由大肠杆菌和其他细菌混合感染引起，主要发生于刚出壳的雏鸡，多数在出壳后2~3日内死亡。
病雏虚弱，常堆挤在一起，水样腹泻，腹部膨大，脐孔未闭合，呈蓝黑色，有刺激性恶臭味，死亡率在l0%以上。
（3）气囊炎。
病鸡表现为咳嗽和呼吸困难，呈地方性流行，病死率5%~20%，有时可达50%。
还有鸡大肠杆菌病引起的肠炎、蛋鸡输卵管炎、卵黄性腹膜炎、脑炎和全眼球炎等。
分枝杆菌分离培养和药敏试验
分枝杆菌分离培养和药敏试验引言分枝杆菌（Branchiobdella）是一类无脊椎动物寄生虫，常见于淡水环境中。
它们具有扁平的身体和分枝状的触手，因此得名。
分枝杆菌对环境条件非常敏感，因此分离培养和药敏试验对其研究具有重要意义。
分枝杆菌分离培养的方法1.样品采集：在淡水环境中选择活跃的分枝杆菌寄生体作为样品。
2.样品处理：将样品置于理化条件适宜的培养基中，如R2A培养基等。
以适宜的温度和光照条件下培养。
3.分离纯培养：利用无菌技术将分枝杆菌从其他微生物分离出来。
常用方法包括稀释涂布法、均匀涂布法等。
4.单菌种培养：将分离得到的单个分枝杆菌菌落接种到新的培养基上进行单菌种培养。
5.培养基优化：根据菌株特性，优化培养基组成、温度、光照和其他环境条件。
通过观察菌落形态、生长速度等指标，选择适宜的培养条件。
分枝杆菌药敏试验的方法1.制备药敏试验板：选择适宜的培养基，如Mueller-Hinton琼脂、肉汤琼脂等。
将药物分别加入琼脂中，并制备成不同浓度的试验板。
2.培养分枝杆菌：将分枝杆菌菌液均匀涂布在药敏试验板上，培养在适宜的温度下。
3.药敏试验观察：观察菌落的生长情况和抑菌效果。
记录最小抑菌浓度（MIC）。
4.药敏结果解读：根据国际标准或相关研究的参考值，判断分枝杆菌对药物的敏感性和抗药性。
可以根据MIC值进行药物分类，如敏感、中度敏感和耐药。
5.药敏结果分析：根据实验结果，分析分枝杆菌的药物抗性特征，为临床治疗提供参考。
结论分枝杆菌分离培养和药敏试验是研究该虫寄生虫的重要手段。
合理的分离培养方法可以得到纯种菌落，为后续研究和药敏试验提供可靠的基础。
药敏试验能够判断分枝杆菌对药物的敏感性，为临床治疗提供重要参考。
参考文献： 1. Johnston, D.J. (2000). A new family of Branchiobdellidan (Annelida: Clitellata) ectosymbiontic on freshwater crayfishes: The Evansobdellidae. Proceedings of the Biological Society of Washington, 113(3): 842-850. 2. Erséus, C. (2001). Chapter 25 PhylumAnnelida: Clitellata, Branchiobdellida. In: Animal biodiversity: an outline of higher-level classification and survey of taxonomic richness (ed. by Z.Q. Zhang). pp. 281-282. 3. Erséus, C. (2005). Order Branchiobdellida. In: Annelida: Polychaeta, Myzostomida, Branchiura and Vestimentifera (ed. by J. B. Hutchings, S. P. Nimis, and C. Reish). pp. 97-100.。
幼鹅感染鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及药敏试验
幼鹅感染鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及药敏试验一、引言鸭疫是一种由鸭疫里默氏杆菌引起的急性传染病，主要发生在水禽中，特别是对于幼鸭来说更为致命。
鸭疫病症主要表现为高热、抑郁、呼吸急促、鸭群死亡率极高，对农业生产造成了严重的危害。
对鸭疫病原菌的分离鉴定及药敏试验成为显得尤为重要。
二、分离鉴定1. 样品采集从患有鸭疫的幼鹅体内取样，如肺、脾、肝等内脏组织进行采集。
将样品放入无菌离心管中，冷链运输至实验室。
2. 细菌分离将取样的组织进行匀浆处理，然后用无菌梳子在无菌平板上均匀涂布。
置于37℃培养箱中培养24-48小时，直至出现细菌克隆。
3. 形态特征观察观察克隆菌落的形态特征，里默氏杆菌在培养基上呈现为小、灰白色，透明且呈环形的菌落，细菌呈杆状。
4. 生理生化特性鉴定将分离的细菌进行革兰氏染色，鉴定其为革兰氏阴性菌；进行氧化酶试验、嗜碱性酸加索试验等生化鉴定来确认细菌的特性。
5. 分子生物学鉴定利用PCR技术进行DNA提取和扩增，选择里默氏杆菌特异的引物进行扩增，最后通过测序鉴定其属于里默氏杆菌。
三、药敏试验1. 抗生素选取常见供试的抗生素包括庆大霉素、环丙沙星、卡那霉素、氨苄青霉素、头孢他啶、磺胺类药物等。
2. 药敏试验操作将分离的里默氏杆菌接种于固体培养基上，然后将不同抗生素的药片均匀涂布在培养基上，培养一段时间后观察对抗生素的敏感性。
3. 敏感性判定观察各药片周围是否有抑菌圈，并计算出抑菌圈直径，根据国家卫生部门颁发的药物抗菌圈直径标准来判断药敏性。
4. 结果判定根据药敏试验的结果，选择对里默氏杆菌具有良好疗效的抗生素进行治疗。
四、结语对幼鹅感染鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及药敏试验是鉴定病原体和确定治疗方案的重要手段。
合理的抗生素治疗可以有效控制鸭疫病的传播，保障畜禽养殖业的顺利进行。
希望通过不懈的努力，能够及时发现并有效治疗鸭疫病，保障水禽养殖业的健康发展。
细菌分离培养、接种技术及培养方法-精品医学课件
革兰染色法
Gram staining
临床微生物与免疫学检验教研室
一、实验目的
1.掌握细菌涂片制作方法； 2.掌握革兰染色法和细菌的基本形态； 3.了解革兰染色法的临床意义。
二、革兰染色原理
原理
细胞壁学说 等电点学说 化学学说
革兰阳性菌 细胞壁肽聚糖形成网状 结构，乙醇处理时，脱水 引起网状结构孔径变小， 通透性降低，结晶紫-碘 复合物不易脱去
实验步骤和方法
1)连续划线分离法：①将接种环火焰灭菌，待冷后取标 本少许；②左手持平板，五指固定平皿盖边缘，向外反 转手掌，装有培养基的平板于手掌内用拇指、小指和 无名指固定，并将平板边缘稍微提高呈现30～45度角， 置酒精灯前上方5～6cm；③右手持已取材的接种环， 先在平板一端涂布，然后快速大幅度左右来回以密而 不重的曲线形式作连续划线接种，使整个平板布满曲 线④划线完毕，将平板作好标记，置35℃孵育18-
革兰阴性菌
细胞壁肽聚糖含量低， 脂类物质含量高，乙醇处 理时，脂类物质溶解，细 胞壁的通透性增加，结晶 紫-碘复合物易脱去
三、实验器材和试剂
1.标本 ：金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的培养物。 2.试剂 ：革兰染液。 3.其他 ：载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、显微镜。
四、操作步骤
1. 细菌涂片制备 ⑴涂片：取洁净载玻片一张，按无菌的方法取1~2环生 理盐水于载玻片上，按无菌的方法各取葡萄球菌和大肠埃 菌 培养物少许，在生理盐水中均匀研磨，涂好的菌膜直径 1cm左右。 ⑵干燥：室温下自然干燥或于酒精火焰半尺高处烘干。 ⑶固定：火焰加热法。目的是杀死细菌，并使菌体与载 玻片粘附牢固，染色时不致于被染液和水冲掉。
培养方法
2 二氧化碳培养法 (1)二氧化碳孵箱：能自动调节二氧化碳的含量和温度， 使用较为方便。 (2)烛缸法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨 口处涂以凡士林。将接种细菌的培养基放入缸中，点燃 缸内蜡烛，加盖密封。当蜡烛燃烧时会消耗缸内氧气并 产生CO2，随着缸内氧气的逐渐减少，蜡烛会自行熄 灭，此时缸内CO2浓度约为5％左右。 (3)化学法(重碳酸钠一盐酸法)：（自学）
药敏测试 流程
药敏测试流程
药敏测试是一种用于检测病原体对药物的敏感性的试验，对于指导临床合理用药具有重要意义。
以下是药敏测试的流程：
1. 采集病原体：通过各种方法采集患者的病原体样本，如痰液、尿液、血液、分泌物等。
2. 分离培养：将采集的样本在适当的培养基上进行分离培养，以获得纯化的病原体。
3. 药物敏感试验：将纯化的病原体置于含有不同药物的平板上，观察病原体对药物的敏感性。
4. 结果分析：根据病原体对药物的敏感程度，分析结果并得出结论。
5. 报告发放：将测试结果报告发放给临床医生，以指导临床合理用药。
需要注意的是，药敏测试的具体流程可能因不同的病原体和药物而有所差异。
此外，为了保证测试结果的准确性，需要在实验过程中遵循严格的质量控制和标准化操作。
药敏试验的原理
药敏试验的原理药敏试验原理药敏试验是一种用于确定细菌的抗生素敏感性的检测方法，主要用于指导临床上的抗菌治疗，以提高治疗效果和避免抗生素的滥用。
药敏试验的原理是通过将不同种类的抗生素与细菌进行反应，观察细菌的生长情况，来确定其对抗生素的敏感性或耐药性。
具体步骤包括以下几个方面：1. 培养细菌药敏试验前需要先从患者的样本中分离出目标细菌，并在培养基上进行培养，使其生长到所需的数量。
通常使用的培养基包括莫乃基、大肠杆菌平板以及血琼脂等。
2. 制备药物药敏试验所使用的药物通常是常见的抗生素，如青霉素、头孢菌素、氨基糖苷类等。
这些药物需要提前配置好，以确保其浓度的准确性和稳定性。
3. 稀释药物将药物稀释成不同的浓度，这些浓度范围从最小浓度开始，逐渐递增至最大浓度，通常会制备8个不同的浓度。
4. 加入细菌将药物加入到已经培养好的细菌中，让其在固定时间内进行吸收。
可以采用不同的方案，如将药物加到固定体积的培养基中，或是通过切开莫米德瓶，在其中加入药物溶液来进行。
5. 观察细菌的生长情况将稀释好的药物加入细菌中后，将其分配到不同的培养基上，通常使用微量进针或是延伸半硬质琼脂板法进行。
然后，将培养基放到恒温箱中进行培养，观察细菌的生长情况和形态。
6. 解读结果并进行分析根据细菌的生长情况来判断其对抗生素的敏感性或耐药性。
根据不同的药物浓度、细菌生长情况和形态，可以简单地确定细菌对药物的敏感性或耐药性。
药敏试验不仅可以指导临床上的抗菌治疗，而且可以在重要疾病爆发时，对于了解不同城市/城镇之间的细菌耐药率变化有帮助。
在药敏试验中，测定细菌对某种药物的敏感性或耐药性的方法有许多种，目前中国临床上主要采用两种常规药敏试验：纸片扩散法和微量进针法。
纸片扩散法纸片扩散法是一种常见的药敏试验方法，主要用于检测各种抗生素对细菌的敏感性。
该方法将已经稀释好的药物加在一个标准莫莫尼格琼脂板上，然后在细菌感染区域中放置一张含有药物的纸片，在培养室中孵化。
细菌的分离、培养及细菌对抗生素的敏感性试验
3、常用的接种方法
① 划线接种 ② 液体接种: ③ 穿刺接种 ④ 涂布接种 ⑤ 三点接种 ⑥ 浇混接种 ⑦ 注射接种
从固体培养基上挑取细菌，接种到 液体培养基中；或者从液体培养物中将 菌液接至液体培养基中，称为液体接种。
3、常用的接种方法
① 划线接种 ② 液体接种 ③ 穿刺接种： ④ 涂布接种 ⑤ 三点接种 ⑥ 浇混接种 ⑦ 注射接种
四、实验内容
1. 平板划线的练习
每人取普通平板1个: ① 练习如何打开平板； ② 练习接种棒的火焰灭菌； ③ 练习挑取单个菌落； ④ 练习分区平板划线。 再取普通平板1个, 4区划线后, 37℃培养, 作为考查内容.
接种环的火焰灭菌
平板分区划线示意图
把接种环上的材料涂在培养基的一侧，一般作3-5 次划线。
5、影响细菌生长的因素
① 营养 ② 水分、pH、渗透压 ③ 温度： ④ 气体环境 ⑤ 培养时间 • 只有处于最适生长温度时，生 长速度才最快，代时最短。 • 病原微生物通常为37℃。
5、影响细菌生长的因素
① 营养 ② 水分、pH、渗透压 ③ 温度 ④ 气体环境： ⑤ 培养时间 有的细菌还需要一定浓度的CO2 • 需氧菌 • 兼性需氧菌 • 厌氧菌 化学去氧 生物去氧 隔绝阻氧 替代驱氧
1、四个概念
① 分离培养： ② 接种 ③ 菌落 ④ 菌苔
就是把病料中的病原微生物分离培 养出来，并获得分离物的单一生长材料, 以进行诊断及有关研究工作。
1、四个概念
① 分离培养 ② 接种: ③ 菌落 ④ 菌苔
将微生物接到适合于它生长繁殖的 人工培养基上或活的生物体内的过程叫 做接种。
1、四个概念
2 1 3 4
2. 琼脂斜面的接种
每人取琼脂斜面1支: ① 练习打开斜面； ② 练习斜面到斜面的接种。
药敏实验的操作规程
药敏实验的操作规程
《药敏实验操作规程》
一、实验目的
本实验旨在测试不同药物对细菌的药敏性，为临床用药提供参考。
二、实验材料
1. 不同种类的药物
2. 革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌培养基
3. 培养皿、消毒酒精、移液器、离心机等常规实验器材
三、实验步骤
1. 将革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌分别分装于培养皿中，均匀涂布于培养基表面。
2. 在分装有不同药物的培养皿上分别滴加一定量的药物液体，确保液体能够均匀覆盖培养基表面。
3. 将处理好的培养皿置于恒温培养箱中，设置合适的温度和时间，培养细菌。
4. 观察培养皿上不同区域的细菌生长情况，记录并比较各种药物对细菌的影响。
四、实验注意事项
1. 操作过程需注意无菌操作，避免外界污染。
2. 按照实验要求使用药物，注意用药量和涂布均匀性。
3. 实验完成后，将培养皿和实验用具进行正确处理，避免对环境造成污染。
五、实验结论
通过对培养皿上不同区域的细菌生长情况观察和分析比较，得出不同药物对细菌的药敏性，并据此提供临床用药建议。
六、实验意义
药敏实验的结果对临床治疗中的抗菌药物选择，以及对细菌感染病症的诊断和预防具有重要的指导意义。
以上为《药敏实验操作规程》，希望实验者严格按照规程操作，确保实验结果的准确性和可靠性。
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细菌分离培养方法及操作步骤
无菌取血液或脏器、淋巴结划线接种于鲜血琼脂平板或血清琼脂平面培养基、普通肉汤培养基，37℃恒温培养24 h，观察其生长特性。
目前细菌分离培养的常用方法有平板划线分离法、加热分离法和实验动物分离法。
平板划线接种法
这是目前临床上最常用的分离接种方法。
它可以从被检病料中通过划线可使细菌分离、分散生长而形成单个菌落（有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌），以便挑选可疑菌落作纯培养加以鉴定。
具体操作：
1、右手持接种环，在酒精灯上火焰灭菌；
图1 病料采集图2 接种环灭菌
2、待接种环冷却后，挑取被检料少许，左手持琼脂平板，以食指为支点，用拇指和无名指将平皿揭开一空隙。
大约20℃时，迅速地将接种环轻轻地涂布在培养基的边缘。
3、在涂布处来回移动作曲线形划线接种。
（注意：划线时，以腕力使接种环在琼脂平板表面划动，尽量不要划破培养基，划的线条要密，但不能重复旧线，以免培养物形成菌苔。
）
图3 平板划线接种法
4、划线完毕，合上平皿盖，将琼脂平板倒置，放入37℃温箱内培养18－24小时。
注意：分离培养用的平板培养基应表面干燥，可于临用前置37℃孵育箱内30分钟，这样表面即干燥有利于分离培养，又使培养基预温，对培养某些较娇弱的细菌有利。
细菌药敏试验方法操作步骤
药敏试验是抗菌药使用以前必不可少的一个基本环节，一个正确的药敏结果能够科学的指导养殖户用药，减少抗菌素使用的盲目性，从而减少养殖户损失。
在临床实际生产中具备重要意义。
1、在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。
具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。
然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。
图4 接种环划线
2、以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。
3、添加药物：按不同药液加样，样品加至满而不溢为止。
将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。
图5 添加药物
药敏试验结果：
图6 药敏试验结果
影响药敏结果的因素：
1、培养基:应根据试验菌的营养需要进行配制。
倾注平板时,厚度合适，约56mm，不可太薄,一般90mm直径的培养皿,倾注培养基1820m为宜。
培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质,如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性,胞腺密啶核苷和对氨苯甲酸(PABA)能拮抗磷胺药和TMP的活性
2、细菌接种量:细菌接种量应恒定,如太多,抑菌圈变小,能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
3、药物浓度:药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果,需精硫配制。
商品药应严格按照其推荐治疗量配制。
4、培养时间:一般培养温度和时间为37℃8-18小时,有些抗菌药扩散慢如多粘菌素,可将已放好抗菌药的平板培养基,先置4℃泳箱内2-4小时,使抗菌药预扩散,然后再放37℃温箱中培养,可以推迟细菌的生长,而得到较大的抑菌圈。
温培养箱中培养18-24h后备用。