抗菌药物敏感试验+细菌耐药性检测
细菌对抗菌药物的敏感试验
（3）抗菌药物使用情况的变化会引起细菌耐药 情况的变化，如投入或停用某种抗菌药物常与其 耐药性的消长有关；
（4）抗菌药物使用愈多的区域耐药菌分布愈多；
（5）抗菌药物应用时间越长耐药菌定植的可能 性越大；
（6）抗菌药物剂量越大耐药菌定植或感染的机 会更多；
（7）抗菌药物对自身菌群有影响并有利于耐药 菌生长。
（3）氯霉素乙酰转移酶。此酶为一种胞内 酶，早在1987年，Lyon等就确定此酶由质 粒或染色体或转座子基因编码，主要作用 是使氯霉素类抗生素转化为无抗菌活性的 代谢物。
（4）红霉素酯化酶。此酶是一种体质酶， 由质粒介导，主要作用是水解红霉素及大 环内酯类抗生素结构中的内酯而使之失去 抗菌活性。
地翻译而引起蛋白质合成受阻，从而引
起细菌死亡。
3、破坏胞浆膜的完整性
这类抗菌药主要是一些抗真菌的药物， 如两性霉素B（Amphotericin B），它们 主要能够与细菌细胞胞浆膜上的一些磷 脂成分结合，破坏胞浆膜的完整性，从 而导致细胞的裂解。
4、影响细菌的代谢途径 这类抗菌药的代表就是磺胺类（Sulfonamides）。
三、细菌耐药性产生的机理
细菌的耐药性机理主要有生化机理和基因 机理两个方面：
(一）、生化机理：
1、细菌产生破坏药物结构的酶
这一类的耐药细菌常常可以产生一种或多 种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌 细胞内的药物，使之失去生物活性。这是 引起细菌耐药性的最重要的机制，目前发 现和分离的钝化酶主要有以下4种：
上述概念虽然考虑到了细菌对抗菌药物 的敏感性，但却忽略了药物的剂量、浓 度和机体的耐受性。
从本质上讲：细菌对某种抗菌药物是敏 感还是耐药，常以该抗菌药物的治疗浓 度（抗菌药物通过常用途径和常用剂量 所能达到的血药浓度）与该抗菌药物对 细菌的最小抑菌浓度（MIC）的关系而 定：
细菌耐药性检测方法
细菌耐药性检测方法 Prepared on 22 November 2020细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。
也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。
（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。
（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。
若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。
2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。
临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。
如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。
3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。
检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA 测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对 1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml 的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥цg/ml的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。
细菌耐药性原理-抗菌药物敏感试验kej
但价格较高。
操作方法： 1.挑取16～20h的菌落 2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌液。
3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多 的菌液。棉签在三个方向平均涂抹琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀 分布，最后沿平板内缘涂抹一周。
联合药敏试验的方法
• 棋盘稀释法
• 原理 先测定两药单药时各自的MIC值，再将各种稀释度的两药混合， 测定两药联合时各药的MIC值，比较两药联合时MIC值与其单独MIC 值，计算部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concectration，FIC)， 作为协同、相加、无关和拮抗的判断。
大肠埃希菌 头孢噻肟
浓度 0.5
1
2
4 ug/ml
3.抗菌药物敏感性试验的方法
浓度梯度法（E-Test）药敏试验
E-Test即浓度梯度（多点药物浓度法）琼脂扩散试验。E试纸条背面含 有干化、浓度由高至低连续梯度分布的抗菌药，药物浓度按log2梯度递 减。抗菌药物从具有浓度刻度的塑料试纸条中向琼脂中扩散，在试纸条 周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈，抑 菌圈与试纸条的横向相交处的读数刻度为MIC值。
抗菌药物的临床实践
剂量 方案
血药浓度/时间
药代动力学 PK
其他组织或体液药 物浓度/时间
感染部位药物 浓度/时间
药理学或 毒副作用
抗菌作用/ 时间
药效动力学 PD
＋ PK：反应体内药物浓度 变化与时间关系
PD：反应抗菌药物在体 外抗菌活性变化过程
MIC MBC PAE MPC
抗菌药物敏感性试验
三、浓度梯度纸条扩散法药敏试验
又称E试验（E test），融合了纸片法操 作简单和稀释法可定量的有点，也适用于慢生 长菌。但成本贵。
药敏纸片换成特制的药敏纸条，培养后读 取细菌停止生长处在纸条上相应的药物浓度指 示值，即为该药物对该试验菌的MIC值。
三、浓度梯度纸条扩散法药敏试验
细菌生长区
E test 塑料
一、β-内酰胺酶的检测
2、超光谱β-内酰胺酶的检测
超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）由革兰氏 阴性杆菌产生，质粒编码，活性可被β-内酰 胺酶抑制剂（如克拉维酸）抑制。包括筛查 试验和确认试验。
ESBLs阳性提示该菌可能对青霉素类、头 孢类和单环抗生素耐药。
临床上需常规检测的细菌包括大肠埃希 菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变 形杆菌。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
（一）常用抗菌药物 β-内酰胺类、糖肽类、氨基苷类、大环
内酯类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类、甲 氧苄氨嘧啶等。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
• β-内酰胺类抗生素（β-lactams）系指 化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗 生素，包括青霉素与头孢菌素，碳青霉烯 类和单环类，以及β-内酰胺酶抑制剂 （克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦）的复方 制剂等。抗菌机制是抑制细菌的细胞壁合 成。
• 此类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适 应证广及临床疗效好的优点。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
青霉素和头孢菌素类的基本结构
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
（二） 抗菌药物的选择原则 1.致病菌的固有耐药特点 革兰氏阴性杆菌对万古霉素均耐药。 革兰氏阳性球菌对氨曲南固有耐药。 2.本地流行株的耐药谱和耐药趋势
实验七++细菌的药敏试验及耐药性检测
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验内容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
抗菌药物敏感性实验及细节耐药检测
抗菌药物敏感性实验与细节耐药性监测来源：查验医学在线2009-4-15 南网编辑2010-7-6一、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感实验(一)纸片琼脂扩散法纸片琼脂扩散法又称Kirby-Bauer实验，是操作最简易、利用最普遍的抗菌药物敏感性实验。
1．实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系，即抑菌圈越大，MIC越小。
2．培育基和抗菌药物纸片(1)培育基：水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton，MH)培育基是CLSI/NCCLS采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏实验标准培育基，pH值为～，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。
琼脂厚度为4mm。
配制琼脂平板当天利用或置塑料密封袋中4℃保留，利用前应将平板置35℃孵育箱孵育，使其表面干燥。
(2)抗菌药物纸片：选择直径为6.35mm，吸水量为20ul的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方式使每片含量达到规定所示。
含药纸片密封贮存2～8℃或-20℃无霜冷冻箱内保留，β-内酰胺类药敏纸片应冷冻贮存，且不超过l周。
利用前将贮存容器移至室温平衡l～2h，避免开启贮存容器时产生冷凝水。
3．细菌接种细菌接种采用直接菌落或细菌液体生长方式。
用麦氏比浊标准的菌液浓度。
校正浓度后的菌液应在15min内接种完毕。
接种步骤如下：①用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂片接种3次，每次旋转60°，最后沿平板内缘涂抹1周；②平板置室温下干燥3～5min，用纸片分离器或无菌镊将含药纸片紧贴于琼脂表面；③置35℃孵育箱孵育16～18h后阅读结果，对甲氧西林和万古霉素药敏感实验结果应孵育24h。
细菌药敏试验及其耐药表型检测课件
药敏试验的分类
纸片扩散法
将抗菌药物纸片贴在接种了待测 菌的琼脂平板上，通过测量抑菌 圈大小来确定细菌对药物的敏感
程度。
稀释法
通过不同浓度的抗菌药物与细菌在 琼脂平板上接触，观察细菌生长情 况，以判断药物的抑菌浓度。
E-test法
将抗菌药物浓度梯度试纸贴在接种 了待测菌的琼脂平板上，根据抑菌 圈边缘与试纸条的交汇点读出最低 抑菌浓度值。
点，是临床常用的药敏试验方法之一。
04
药敏试验的结果解读
结果判读标准
敏感（Susceptible）
01
表示细菌对药物敏感，通常为≤2μg/ml或≤10μg/ml，具体标
准根据药物种类和实验方法而异。
中介（Intermediate）
02
表示细菌对药物中度敏感，通常为2μg/ml＜MIC＜10μg/ml或
某些细菌可以产生酶类，将药物分解 或灭活，从而降低或消除药物的抗菌 作用。
抗菌药物作用靶点的修饰
细菌通过增加或改变靶点蛋白的数量 或修饰状态，降低药物与靶点的结合 能力。
03
药敏试验的方法
纸片扩散法
总结词
一种常用的药敏试验方法
详细描述
纸片扩散法是一种简便、快捷的药敏试验方法，通过将含有一定浓度的抗菌药 物的纸片贴在接种了待测菌的琼脂平板上，观察细菌周围的抑菌圈大小，判断 细菌对药物的敏感程度。
细菌药敏试验及其耐药表型检测课 件
目录
• 细菌药敏试验概述 • 细菌耐药性及耐药表型 • 药敏试验的方法 • 药敏试验的结果解读 • 耐药表型检测的应用 • 展望与未来发展方向
01
细菌药敏试验概述
药敏试验的定义
• 药敏试验：指通过实验室方法检测细菌对抗生素等抗菌药物的敏感程度，为临床医生提供抗菌药物选择依据的过程。
细菌对抗菌药物的敏感试验
•23
•24
•25
第二节 抗菌药物压力
一、抗菌药物压力 是细菌产生耐药的主要源动力。 1985年，著名学者McGowan指出了与医院 内细菌耐药性的出现相关的7个方面： （1）引起医院感染的微生物的耐药性比引 起社会感染的微生物的耐药性更多见； （2）医院中耐药菌株感染者使用的抗菌药 物比敏感株感染或定植者使用的抗菌药 物多；
抑菌商数越小，抑菌效果越差。
•18
三、细菌耐药性检测的常用方式
•19
标准结果判读表
•20
分界点的计算方法
选取一大群同种不同株的细菌做药敏试 验（至少选取100株，包括敏感菌株和耐 药菌株），求出该群细菌中每一菌株对 某抗菌药物的MIC及其相应的抑菌环直 径。因抗菌药物对细菌的MIC与其相应 的抑菌环直径呈负相关关系，据此可绘 制回归直线图。方法如下：
•17
目前，临床上选择抗菌药物，常根据抑菌 商数来选择。
所谓“抑菌商数”（Inhibitory Quotient，简称 IQ），是指某抗菌药物在局部组织或体液 中的浓度除以该药物对感染菌的最小抑菌 浓度所得的商数。即： 局部组织或体液中的药物浓度
IQ =
MIC 抑菌商数越大，抑菌效果越明显；反之，
因此，在使用抗菌药物的过程中，必须加强细菌 对抗菌药物敏感性的实验室监测，为临床上合理 使用抗菌药物提供试验依据。而细菌对抗菌药物 的敏感试验，就是对抗菌药物进行实验室监测的 主要手段之一。
•3
目的： 1、为临床上治疗某个病人选择最佳抗菌
药物，指导临床用药，避免由于用药不 当，导致耐药菌株产生或造成人体伤害 ； 2、进行流行病学调查，了解致病菌的耐 药变迁情况，为医疗行政主管部门的决 策提供依据；
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256
原理：
128
E试条是一条5mm×50mm无孔试剂载体，一面固定有 一系列预先制备的浓度呈连续指数增长的抗菌药物，
8
另一面有判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有15-20个对倍稀释浓度的宽度范围。
016
将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育，围
绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交
第四章 抗菌药物敏感试验
临床微生物学教研室 杨维青
1
主要内容
抗菌药物敏感性概述 抗菌药物敏感性试验方法 全国“细菌耐药监测网”简介
2
敏感和耐药的概念
从本质上讲：细菌对某种抗菌药物是敏感还是耐 药，常以该抗菌药物的治疗浓度与MIC的关系而 定。 常用剂量的抗菌药物通过常 用途径所能达到的血药浓度
10μg 10μg 10μg 10μg
≤11 12-13 ≤ 28 — ≤19 — ≤16 —
≥ 14 ≥ 29 ≥ 20
≥32
≥4 ≥16
≤8
≤0.25 ≤2
14
操作方法 ： 1. 制备M-H琼脂平板，厚度4mm。 2 .制备0.5麦氏比浊管浊度的菌液 （培养16～24h，4~5个菌落）。 3. 菌液均匀涂布于平板。（15分钟接种完毕） 4. 无菌贴标准抗生素纸片于M-H琼脂表面， 5. 经过35℃16～24h孵育。 6. 量取抑菌环直径， 根据CLSI标准，
5
6
CLSI标准 治疗浓度的上限 即表中的 R
治疗浓度
治疗浓度的下限 即表中的 S
耐药
中介耐药 敏感
MIC
7
第一节、抗菌药物敏感性试验方法
需氧和兼性厌氧菌
8
需氧和兼性厌氧菌药敏试验的方法
稀释法 • 肉汤稀释法（试管稀释法） • 琼脂稀释法（平板稀释法）
纸片扩散法（纸片法） E-试验 联合药物敏感试验
报告细菌对该抗生素敏感、 耐药、中介。
15
操作方法 ：
1. 将在约56℃恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm 的平板，其厚度 4mm。
16
2.无菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5个菌落。
17
3. 将菌置于无菌生理盐水中，校正其浊度于 0.5麦氏比浊管浊度的菌液。
1.5×108CFU /ml
3
血药浓度与MIC之间的关系
上限 下限
耐药 中介耐药
敏感
4
敏感和耐药的概念
抗菌药物的治疗浓度与MIC的关系：
若MIC小于治疗浓度， 则为“敏感”（Sensitive , S ），推荐使用。
若MIC大于治疗浓度， 则为“耐药”（ Resistant , R ）；
若MIC介于治疗浓度的上下限之间， 则为“中度耐药”（ Intermediate , I ）或中度敏 感
药物敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到 抑制，形成抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌 对药物的敏感程度。 二者呈正相关。
11
抑菌圈边缘的药物浓度 与 MIC
12
抑菌圈的大小与MIC： 二者呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
lgMIC
50 40 30 20 10
0 0
氨苄青霉素对肠杆菌科的抑菌试验
32
两种药物的联合使用的效果
增强作用：两种抗生素联用的效果大于它们单
独使用时的效果之和； 20％～25％
相加作用：它们联用时的效果等于单用两种抗
生素效果之和； 60％～70％
无关作用：两种抗生素联用的效果，仅相当于 其中一种具有较强作用的抗生素的效果；
拮抗作用：两种抗生素联用时的效果反而小于
18
4.用无菌棉签浸入细菌悬 液中，将拭子在试管上壁 轻轻挤压以挤去过多的菌 液。棉签在三个方向均匀 抹琼脂表面（每次转60℃） 使菌液均匀分布，最后沿 平板内缘涂抹一周。
19
5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置 3~10分钟后贴上标准抗生素纸片。
20
6.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼 脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中
点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的MIC。
依照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。
26
有菌生长区 无菌生长区
27
椭圆形细菌 生长抑制区
256 128
8
判读抑菌浓度
（MIC ug/ml)
016
28
E test 法特点
优点 连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好 （相关系数为0.9）.可测MIC。 操作简单，影响因素少，稳定性高。
缺点：E试条较昂贵; 不适用于生长缓慢的苛养菌。
31
四、联合药物敏感试验
联合药物意义
用于病原菌尚未确定的急、重症感染的经验治 疗,以扩大病原治疗的覆盖面
治疗多种细菌所引起的混合感染 对于某些耐药菌可取得协同抗菌作用 减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生 避免药物达到毒性剂量。
系列1
5
10
15
20
Diameter（mm）
13
纸片法药敏试验抑菌圈直径与结果解释的标准
抗菌药物与细菌 纸片含量 抑菌圈直径：mm 相应MIC μg/ml 耐药 中介度 敏感 耐药 敏感
丁胺卡那霉素 氨苄青霉素
测肠பைடு நூலகம்菌 测葡萄球菌 测嗜血杆菌 测肠球菌
30μg ≤14 15-16 ≥ 17 ≥32 ≤16
各抗菌纸片中心距离应大于24mm， 纸片距平板内缘应大于15mm。↘ ↗ 9cm的平板贴6个
培养时间 ↗ 质控菌株
23
24
纸片扩散法的特点
根据抑菌圈的直径，依照CLSI标准，作出敏感、 耐药、和中介的判断。为‘‘ 定性”结果。
CLSI推荐的最简单的药敏试验。
25
三、E试验法（浓度梯度法）
心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
21
7.经过35℃16～24h孵育。 8.取抑菌环直径， 根据CLSI标准，报告细菌对 该抗生素敏感、耐药、中介。
22
纸片扩散法质量控制
抑菌圈直径？
培养基：M-H平板厚度，4 mm
↗↘
细菌悬液：0.5麦氏标准的细菌浓度 ↗ ↘
药敏纸片的质量
9
稀释法的特点
定量的药敏试验，测定MIC、MBC。 方法比较繁琐，手工操作一般不作为常规试验，
常用于调查罕见耐药。 自动微生物鉴定药敏分析系统采用微量稀释法
检测MIC。
10
二、纸片扩散法（disc diffusion test) 原理（：Kirby-Bauer法）
将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平 板上。抗菌药物向琼脂四周扩散形成递减的梯度 浓度。