大肠埃希氏菌重点

使用方法


1、 称取本品54.0g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌 加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌 15min。 2、待培养基冷至50～55℃倾注灭菌平皿，待凝固后， 备用。 3、取待检样品划线接种于麦康凯平板。 4、将平板置培养箱于30～35℃培养18～24h。 5、观察结果。在做致泻大肠埃希氏菌检验时，观察结 果不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意不发酵和 迟缓发酵的菌落。 质量控制：大肠埃希菌菌株经36±1℃培养18~24h菌落 特征呈粉红或红，周围有混浊胆盐沉淀圈。
BL培养基


配方（每升）： 胨 20.0g 提供碳氮源 乳糖 5.0g 可发酵的糖类 氯化钠 5.0g 维持均衡的渗透压 磷酸氢二钾4.0g 缓冲剂 磷酸二氢钾1.3g 去氧胆酸钠/牛胆盐0.5g/2.0 g 选择性抑菌剂
使用方法

1、称取本品35.8g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至 完全溶解，分装三角瓶，每瓶100mL，121℃灭菌20min，待冷至 常温后，备用。 2、样品的处理。略。 3、取胆盐乳糖增菌液3份，2份分别加入规定量的供试液，其中一 份加入对照菌50～100个作阳性对照，第三份加入与供试液等量的 稀释液作阴性对照。 4、将三角瓶放入30～35℃恒温培养箱内培养18～24h。必要时可 延长至48h。 5、观察结果。阳性对照应生长良好，阴性对照应无菌生长。
EMB琼脂培养基



配方（每升）： 胨 10.0g 牛肉浸出粉3.0g 氯化钠5.0g 乳糖 10.0g 琼脂 14.0g 曙红钠 0.4g 亚甲蓝0.065g
提供氮源、维生素、氨 基酸和碳源 维持均衡的渗透压 可发酵的糖类 培养基凝固剂 抑菌剂（革兰氏阳性菌） pH指示剂

10ml
样 BL培养基
备料单（快速生化试验）
序号 1 2 3 品名 刻度吸管 试管 MUG培养 基 规格 1ml 中 5ml 数量 3 4 4 分装到试 管中 备注
4
靛基质
——
——
灭菌参数：115℃、20min
操作过程
阴 0.2ml
样 0.2ml
阳 0.2ml
阴
样
阳
本底
培养温度：36±1℃ 培养时间：18~24h 靛基质试验 紫外荧光
IMViC

用来测定菌的生理生化特征的4个实验. I:吲哚试验 M:甲基红试验 V:V.P试验 C:柠檬酸实验 i是为个好读加上去的
吲哚（indole）实验



原理：有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌 等能分解培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质），经 与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚 而呈红色，是为吲哚试验阳性。 ①试验菌用蛋白胨水培养基37℃培养24小时. ②在培养液中加入乙醚1ml(使呈明显的乙醚层)充分 振荡,使吲哚试剂溶于乙醚.静置片刻,待乙醚浮于培养 液上面时沿管壁慢慢加入吲哚试剂10滴.呈玫瑰红的 为阳性,不变色的为阴. (注:加入吲哚试剂后,不可再摇动,否则红色不明显)
麦康凯琼脂培养基



配方（每升） 胨 20.0g 牛胆盐 5.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 14.0g 乳糖 10.0g 中性红 0.03g
碳氮源、维生素和生长因子 抑制革兰氏阳性菌的生长 维持均衡的渗透压 培养基的凝固剂 可发酵的糖类 pH指示剂
细菌发酵乳糖产酸时菌落呈粉红色并在菌落周围出现胆 盐沉淀的浑浊圈。

质量控制：本品质控菌株接种后，于36±1℃培养18～24h，培养 结果肉汤呈混浊。
MUG培养基



配方（每升）： 胰蛋白胨 20.0g 3号胆盐 1.5g 乳糖5.0g 磷酸氢二钾4.0g 磷酸二氢钾 1.5g 氯化钠5.0g MUG0.05g
提供碳氮源 抑制革兰氏阳性菌 可发酵的糖类 缓冲剂 维持均衡的渗透压
使用方法


1、称取本品37.05g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸 至完全溶解，分装于带有小倒管的试管中，115℃高压灭菌20min， 待冷至常温，备用。 2、将总大肠菌群多管发酵法初发酵产酸或产气的管进行大肠埃希 氏菌检测。用烧灼灭菌的金属接种环或无菌棉签将上述试管中液 体接种到EC-MUG肉汤管中。 3、将已接种的EC-MUG管在培养箱或恒温水浴中44.5±0.5℃培 养24h±2h。如使用恒温水浴，在接种30min内进行培养，水浴箱 的液面应高于EC-MUG肉汤液面。 4、观察结果：将培养基管置366nm紫外灯下约5cm处，以未接种 培养物的EC-MUG培养基作空白对照，观察有无蓝白色荧光。空 白对照管应无蓝白色荧光，试验管出现蓝白色荧光为阳性反应。 质量控制：大肠埃希菌菌株接种后于36±1℃培养18~24h，结果 产气，紫外灯下显荧光。
甲基红试验

原理:某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖 产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、 乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下， 当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳 性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸 进一步转化为其他物质（如醇、酮、醚、气体 和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上， 故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。
在酸性条件下产生沉淀，形成紫黑色菌落或具黑色中心 的外围无色透明的菌落。
使用方法


1、称取本品42.5g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加 热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min。 2、待培养基冷至50℃左右，以无菌手续，倾注灭菌平皿， 待凝固后，备用。 3、将供试液划线接种于平板上。 4、将平板翻转，放入恒温培养箱中，30～35℃培养18～ 24h。 5、观察结果。 质量控制：本培养基倾注平皿待冷却后呈紫色，可有细微 沉淀。大肠埃希菌菌株接种后。36±1℃培养18～24h， 培养结果呈黑心，有绿色金属光泽。
柠檬酸实验


柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为 碳的唯一来源。而磷酸二氢铵是氮的唯一来源。有的 细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在 柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸 盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚 蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳 源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。 ①将试验菌培养在柠檬酸盐培养基斜面上37℃培养 24-28小时. ②观察有无细菌生长与培养基颜色变化.如果含有溴 麝香草酚蓝的斜面蓝色者为阳性反应,呈绿色的为阴 性反应;含苯酚红的斜面如果呈红色为阳性反应,呈黄 色为阴性反应.
甲基红试验



M:甲基红试验为肠道细菌的IMViC四类测试中 的M，甲基红为一种酸性指示剂，根据肠道细 菌的糖代谢途径的不同，最终产生酸性产物不 一，PH值有所差异，导致甲基红显示出不同 的颜色，从而用于鉴别肠道细菌。呈现红色为 阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。 ①试验菌用葡萄糖蛋白胨培养基37℃培养24 小时. ②沿管壁加入M.R.(甲基红)试剂3-4滴.红的为 阳性,黄的为阴性.
V.P试验（乙酰甲基甲醇试验）



某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡 萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲 基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧 化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红 色化合物，称V－P（+）反应。 ①试验菌用葡萄糖蛋白胨培养基37℃培养24 小时. ②加入40%KOH 10-20滴,再加入等量α-茶酚, 用力振荡(拔去棉塞)再放入37℃4h后再观察, 仍无色产生为阴.
IMViC的作用

这4个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产 气肠杆菌，多用于水的细菌检查。大肠杆菌虽 非致病菌，但在饮用水中如超过一定数量，则 表示水质受粪便污染。产气肠杆菌也广泛存在 于自然界中，因此检查水时，要将两者分开。
谢谢！！
4
5 6 7
烧杯
量筒 胆盐乳糖培养基 pH7.0无菌氯化 钠-蛋白胨缓冲液
250ml
100ml 100ml 150ml
1
1 3 1 装锥形瓶 装锥形瓶
灭菌参数：121℃、20min
操作过程
1ml 10ml 菌悬液 样品 90ml 10ml 阴 BL培养基 稀释液 培养温度：36℃ 培养时间：18~24h（必要时可延长至48h） 供试液 10ml 阳 BL培养基
备料单（分离培养）
序号 1 品名 EMB或麦 康凯琼脂 培养基 平皿 规格 60ml 数量 1 备注 置皿
2
——
3
灭菌参数：121℃、15min
操作过程
阴
样
阳 接种环（四区划线法）
EMB或麦康凯琼脂培养基
培养温度：36±1℃ 培养时间：18~24h
生化试验中MUG在紫外等下显荧 光的原理

大肠埃希氏菌是指能产生β-半乳糖苷酶分解 ONPG使培养液呈黄色，能产生β-葡萄糖醛酸 酶分解MUG使培养液在波长366nm紫外光下 产生荧光的细菌。
标准

《中国药典》（2010年版）二部 口服给药制剂 细菌总数每1ml不得过100cfu 霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100cfu 大肠埃希菌总数不得检出

备料单（增菌培养）
序号 1 2 3 品名 锥形瓶 刻度吸管 刻度吸管 规格 250ml 10ml 1ml 数量 4 2 1 备注
大肠埃希氏菌药典查

大肠埃希菌（Escherichia coil）即大肠杆菌， 为肠杆菌科埃希菌属的模式种。大肠埃希菌是 人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体 外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受 到人和温血动物粪便的污染，即可能是污染肠 道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外， 还有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人 爆发性腹泻。为了保证人体健康，口服给药制 剂必须检查大肠埃希菌。