基于小波空间特征匹配及表面增强拉曼光谱技术快速检测混合物中的甲氨蝶呤和伏立康唑

基于小波空间特征匹配及表面增强拉曼光谱技术快速检测混合物中的甲氨蝶呤和伏立康唑刘察;臧颖超;曾惠桃;范夏琼;张志敏;卢红梅【摘要】为实现混合物中目标化合物的快速检测,合成了对甲氨蝶呤和伏立康唑具有普适性响应的金纳米复合(AuNPS-PDDA)基底,借助表面增强拉曼光谱技术,结合化学计量学方法,通过连续小波变换将甲氨蝶呤和伏立康唑的光谱信号转换到小波空间,依据小波空间特征匹配分析混合物的拉曼光谱,显著减轻信号中基线变化和随机噪声的影响,成功地识别出混合物中1.0×10-8mol/L甲氨蝶呤和2.86×10-4 mol/L伏立康唑.其中,甲氨蝶呤和伏立康唑的小波特征匹配系数均大于0.96,高于传统的命中质量系数,且采用非负最小二乘法成功实现了两种物质含量比例的确定,实验的组分比例预测值与真实值之间相关性大于0.98.实验结果表明,小波空间特征匹配结合表面增强拉曼光谱技术能有效地识别且半定量混合物中的目标化合物.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2019(038)006【总页数】7页(P668-674)【关键词】表面增强拉曼光谱技术;特征匹配;甲氨蝶呤;伏立康唑【作者】刘察;臧颖超;曾惠桃;范夏琼;张志敏;卢红梅【作者单位】中南大学化学化学工学院,湖南长沙410083;中南大学化学化学工学院,湖南长沙410083;中南大学化学化学工学院,湖南长沙410083;中南大学化学化学工学院,湖南长沙410083;中南大学化学化学工学院,湖南长沙410083;中南大学化学化学工学院,湖南长沙410083【正文语种】中文【中图分类】O657.3;TQ460.72拉曼光谱技术是一种重要的分析检测技术，广泛应用于各种领域，如古文物鉴定、生物蛋白质研究、医药物质检测、食物安全现场检测等[1]。

该技术无需复杂的样本预处理，几乎可以用于任何环境[2]。

拉曼光谱还包含了丰富的物质结构信息，被称为分子的“指纹图谱”[3]。

采用适当的化学计量学方法，可获取隐藏在拉曼光谱中的定性和定量信息，从而实现对待测物质的定性检测和定量分析。

由于常规拉曼散射光强度约为入射光强度的10-6～10-9，这极大限制了拉曼技术的应用和发展。

表面增强拉曼光谱技术(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)利用具有纳米级粗糙度表面的金、银等金属可将拉曼信号放大一百万倍的特性[4-5]，设计了一系列金、银以及复合金属材料基底以显著增强物质拉曼信号[6-7]，使得SERS在分子检测中具有良好的发展前景。

甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)是一种抑制肿瘤细胞生长的抗叶酸类抗肿瘤药，可通过抑制二氢叶酸还原酶而降低四氢叶酸的形成并阻断DNA 的合成，有效抑制滑膜细胞及免疫炎症细胞的增殖，从而起到免疫抑制、抗炎、抗风湿的作用，主要应用于癌症的治疗。

伏立康唑(Voriconazole，VOR)是一种通过抑制真菌中由细胞色素P450介导的14α-甾醇去甲基化，从而抑制麦角甾醇的生物合成的广谱抗真菌药，对人和动物的真菌感染均有治疗作用。

临床医疗研究发现：MTX和VOR 两种药物不同比例的混用会对小儿肿瘤患者产生强烈的副作用，并严重损害小儿肿瘤患者的皮肤。

目前拉曼光谱技术可实现对VOR的检测分析。

MTX固体的拉曼光谱图无法获取，实验发现，低功率的激光照射条件下，MTX物质即出现灼烧情况。

在VOR和MTX混合物的拉曼光谱中，VOR的拉曼光谱强度信号极低，难以找到特征拉曼光谱峰进行鉴定分析。

而且2种混合物的拉曼光谱存在重叠峰干扰，无法获得特征光谱而使混合物的定性定量分析困难[8-9]。

针对此问题，可采用化学计量学中的信号预处理算法以增强拉曼光谱分辨率，消除基线效应[10-13]。

Eiler等则提出一种高效算法，通过平滑分析信号，以实现对峰位置的检测[14-15]。

Zhang等基于小波多分辨的优势，提出了小波空间多尺度峰检测方法(Multi-scale peak detection，MSPD)[16]，该方法利用小波空间中的脊线、峰谷、零交叉点等信息进行峰位置估计，并通过调整遗传算法迭代次数和种群个数，得到峰位置和峰宽的最优解[17]。

彭颖等将MSPD方法与SERS技术相结合用于食品中违禁色素检测，得到很好的实验结果[18]。

本文针对MTX和VOX混合物快速定性检测与半定量分析中存在的问题，合成了一种金纳米颗粒复合物(AuNPS-PPDA)作为SERS基底，利用SERS技术可获得MTX和VOX混合物的高质量光谱。

针对SERS光谱重叠的问题，本文提出了小波空间特征匹配(Feature matching in wavelet space,FMWS)方法，通过该方法可显著减轻信号中基线变化和随机噪声的影响，从而实现对混合物中目标物质的识别，及定性和半定量分析。

图1 FMWS算法的流程图Fig.1 The procedure of FMWS1 原理本文提出FMWS算法(见图1)，该方法基于CWT原理进行峰检测，通过综合运用小波空间信息可准确检测特征峰位置，实现对物质的定性检测。

再提取特征峰强、峰面积等信息，基于非负最小二乘算法实现对甲氨喋林和伏立康唑的半定量分析。

1.1 连续小波变换峰检测小波是基于一系列具有连续可微、零均值等特性的函数基础上形成的多尺度信号分析方法，其表达式如下：(1)式中，a为尺度因子，b为平移因子。

可以看成是信号s(t)与小波函数Ψ的卷积，定义如下：(2)采用如下步骤可以利用CWT将SERS光谱转换至小波空间，并提取高质量特征：①小波基的选择：由分析仪器产生的特征峰有较高的局部特征，色谱信号多为高斯峰，光谱信号多为洛伦兹峰，因此本研究选择的墨西哥帽函数具有近似对称、与高斯峰相似的特点，选择墨西哥帽小波作为小波函数；②小波空间中的脊线、峰谷、零交叉点：在二维小波空间中，脊线、峰谷、零交叉点等重要特征参数可以很容易被确定；③峰位置的确定：综合利用脊线、峰谷、零交叉点可确定峰位置、起始点；④脊线阈值：通过脊线最大值设置阈值，去除假峰；⑤峰强与峰面积的提取：通过提取峰强、峰面积等信息，用于后续小波空间特征匹配。

小波系数C为二维矩阵，行和列分别代表尺度因子和平移因子。

将矩阵C分别平移k，k-1，...1以及-k，-(k-1)，...，-1列，分别作为矩阵kC和矩阵-kC。

脊线、峰谷和零交叉点可通过以下的布尔代数方程得到：R=(C>-kC)∧(C>-(k-1()C)...(C>k-1C)∧(C>kC)V=(C<-kC)∧(C<-(k-1)C)...(C<k-1C)∧(C<kC)Z=[sgn(c1)⊕sgn(c0),…sgn(cn)⊕sgn(cn-1)](3)R，V，Z为分别包含脊线、峰谷和零交叉点信息的矩阵。

取出R中的列计算元素和，如果列求和为0，则这一列没有脊线，如果列求和大于0，则这列中可能有脊线。

然后从小尺度系数到大尺度系数增加行值,从初始位置扫描矩阵R。

重复提取过程，直至矩阵R最后一行元素值全为0，则说明列中的脊线已经提取完全。

若小波系数大于0，则为单峰。

小波系数小于0，则可能为重叠峰。

搜索矩阵V，Z进行双向搜索。

遇到非0值时，作为峰的起止点，将搜索过程中非0值的列保存。

在原始信号中，最大值列和最小值列分别对应峰的起止点，其间的最大值列对应峰的位置。

1.2 小波空间特征匹配HQI是一种正向光谱检索方法，它以参考物光谱与未知光谱的匹配系数的大小，决定是否有特征物质存在。

其HQI值越大，说明未知光谱与参考物光谱的相似度越高。

该方法主要适用于纯物质光谱分析，而对混合物光谱，杂峰存在下的未知光谱的匹配则不稳健，其HQI值易受杂峰因素的干扰。

FMWS算法则不受该因素限制，在检索未知光谱时，只选取对应特征峰强信息进行匹配，而自动忽略其他杂峰、重叠峰的干扰。

其FMWS越接近于1，则说明未知光谱与参考物光谱越接近。

(4)HL，HU∩L为向量，HU∩L为参考物光谱L与未知物对应的特征峰光谱U。

HL，i 为参考物光谱第i特征峰的特征匹配系数，HU∩L为参考物光谱L与未知物光谱U 的第i特征匹配系数。

1.3 非负最小二乘半定量算法本文研究的混合物光谱，y即为混合物光谱，X为矩阵，矩阵的列代表未知化合物。

b为未知化合物在混合物中占比的向量。

通过设置阈值可以消除杂质峰谱的干扰，用非负最小二乘算法可以实现对未知混合物组分的半定量分析。

统一混合物与光谱库中可能存在组分的拉曼光谱积分时间，近似计算出混合物的比例。

其表达式如下：min‖y-Xb‖≥0,bi≥0(5)式中的非负最小二乘问题可等价于如下二次规划问题：(6)式中，Q=XTX，c=-XTy。

本文基于Lawson和Hanson[19]提出的有效集非负最小二乘方法对混合物中的组分进行半定量分析。

2 实验部分2.1 材料与仪器氯金酸(HAuCl4·3H2O)、柠檬酸钠，聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)、MTX、VOR(分析纯，上海Sigma-Aldrich公司);实验所用超纯水(18.25 MΩ·cm)均来自Milli-Q净水系统(Bedford,MA,USA)。

实验中未特别指明，均在室温下进行。

B&W Tek i-Raman拉曼光谱仪(B&W Tek Inc.,Newark,DE,USA)，激发光源波长为785 nm，激光功率为30 mW;拉曼位移范围为222～2 478 cm-1;Tescan MIRA 3 XMU SEM(Tescan USA Inc.,Cranberry Township,PA,USA)获取金纳米的微观形貌图。

2.2 金纳米颗粒的制备金纳米粒子采用经典的柠檬酸钠还原氯金酸方法制备[20]：将1mL HAuCl4(1 mmol/L)快速加入已煮沸的50 mL 1%柠檬酸钠溶液中，在100 ℃条件下，磁力搅拌反应20 min，当混合溶液从浅黄色逐渐变为明亮的鲜红色后，停止反应，将混合液自然冷却并倒入用锡纸密封的锥形瓶中，完成50 nm的金纳米(AuNPS)制备[21]。

同样条件下，将0.6 mL HAuCl4(1 mmol/L)快速加入已煮沸的50mL 1% 柠檬酸钠溶液中，自然冷却即得尺寸为70 nm的金纳米(AuNPS)。

2.3 AuNPS-PDDA纳米复合材料的制备将1 mL PDDA与9 mL水置于烧杯中超声处理5 min，使其充分混合后，再量取30 mL AuNPS溶液至烧杯中。

40 mL混合液在8 000 r/min转速离心机下离心15 min，移除上清液，得到2 mL AuNPS-PDDA。

2.4 MTX和VOR混合物的快速SERS检测100 μL不同浓度的MTX和VOR样品与100 μL AuNPS-PDDA混合超声处理10 min,每次用移液枪移取10 μL混合液缓慢均匀滴于硅胶板上检测，每1批次滴5个样品做平行检测，光谱采集的时间为30 s，即得到MTX和VOR混合物的表面增强拉曼光谱图。