综合实验1：柠檬酸发酵及产物提取
综合实验1：柠檬酸发酵及产物提取
综合实验1：柠檬酸发酵及产物提取（一）柠檬酸发酵一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羧生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。
但就柠檬酸产生菌而言，由于其顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：2 C6H12O6 +3 O2→2 C6H8O7 +4 H2O国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。
二、实验器材（一）材料1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等（二）主要仪器设备1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等三、操作步骤1．种子培养基制备：马铃薯培养基配方:(1000ml)马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。
3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。
4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，7水合硫酸镁0.025%。
5. 上罐灭菌（操作同实验一）5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、200r/min条件下发酵4天。
6.分别在0，24，48，72，96小时测定一下参数。
四、实验结果1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。
2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。
柠檬酸液态发酵及提取工艺
1.4.2 发酵液预处理
➢ 取细度为60目以上的玉米粉300g装入2000ml烧杯中，加 入1000mL水和7～8个单位α-淀粉酶(高温)/g玉米粉；
➢ 于80℃液化l0min后，继续加热至90℃保温30min，碘检 不变色后，再加热到100℃煮沸(5～l0min)，趁热经过二 层纱布过滤;
➢ 滤液加水冷却并调整糖度至15％～20％和蛋白质含量不超 过4g/L，pH6.0。
总糖及残糖(还原糖) 采用测定：试剂或DNS法， 测上清的总糖。
1.4.5 柠檬酸提取
• 过滤： 加热至65±2℃，3 层纱布过滤， 可用少量75±2℃水洗；
• 离心：3000 r/min，10 min离心去掉菌体 等杂质；
• 水洗：75±2℃水洗至柠檬酸＜1％；
④ 中和
➢ 滤液中除含柠檬酸外，还含可溶性的残糖以及蛋白质、金属离子等杂 质。利用柠檬酸钙难溶于水的特点，与杂质分离；
柠檬酸积累的原因
• Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4↑ • 由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧
化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及 柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。 • 由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累 。 • 随柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，顺乌头酸酶和异 柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出胞外。
用途
➢ 柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被 广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗(洗涤)、建筑等工业部门。
➢ 其中食品和饮料业占56％，清洗(洗涤剂)业占20％，医药和化妆品占11％ ，其他工业占13％。
柠檬酸发酵及产物提取
综合实验：柠檬酸发酵及产物提取（一）柠檬酸发酵一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。
但就柠檬酸产生菌而言，由于其乌头酸流水作业事酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：2 C6H12O6 +3 O2→2 C6H8O7 +4 H2O国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。
二、实验器材（一）材料1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等（二）主要仪器设备1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等三、操作步骤1．种子培养基制备：马铃薯培养基配方:(1000ml)马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。
3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。
4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁7水0.025%。
5. 上罐灭菌（操作同实验一）5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、500转条件下发酵4天。
6.分别在0,24,48,72,96小时测定一下参数。
四、实验结果1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。
2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。
3．计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。
柠檬酸发酵实验
食品生物工程与设备实验指导书编者：西北农林科技大学食品科学与工程学院二00九年五月《生物工程与设备》综合性实验大纲一、实验课开设目的。
通过综合性实验要求学生掌握发酵的过程及发酵产物的分离提取的方法及一般步骤，增强学生的动手能力，培养工程素养。
二、实验课学时分配。
本课程总学时36，其中讲课27，综合性实验6。
序号实验题目学时1柠檬酸的发酵、提取及精制6合计6三、实验课教材、参考数目1、理论讲授教材梁世中主编,生物工程设备,中国轻工出版社,2002年2月。
2、实验指导书自编实验指导书3、参考书(1)程丽娟,薛泉宏,微生物学实验技术,兴界图书出版公司,2000年4月。
(2)贾世儒主编，生物工艺与工程试验技术，中国轻工业出版社，2002年9月。
四、实验内容及要求实验柠檬酸的发酵、提取及精制(6学时)柠檬酸的发酵一、目的要求了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产方法。
二、基本原理用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等。
本实验以糖为发酵原料，黑曲霉为产生菌。
黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强。
ph1.6～1.7时尚能生长。
且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以在pH2-3为宜。
在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。
挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。
酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等。
若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。
本试验用中和法测定柠檬酸发酵中的总酸。
柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。
三、实验材料1．菌种黑曲霉斜面菌种3支。
2．器材柠檬酸发酵培养液硝酸铵2.0g，KH2P04 1.0g，MgS040.25g，蔗糖150g，lmol／L HCl17ml，水1000ml。
取100ml上述培养液，加入500ml三角瓶中，包扎灭菌。
Deniges试剂(HgO1g溶于20ml0.2L／L H2S04中)；0.1mol／L标准NaOH 0.1mol／L H2S04;酒精灯；滤纸，漏斗；烧杯：200ml，500ml；18X180试管；吸管10ml、5ml，150ml三角瓶；碱滴定管，铁台、蝴蝶夹：酚酞指示剂：200ml 量筒；广泛pH试纸；玻璃棒；牛角勺；布氏漏斗，抽滤纸，抽滤水泵，离心机和离心管，滴管，天平。
柠檬酸的提取工艺
5.影响过滤速度的主要因素
（1）发酵醪的性质 （2）温度 （3）过滤的推动力 （4）过滤介质
（5）助滤剂
（1）培养基液化不良、发酵质量不佳、
染菌后的发酵醪和被杂菌污染了的 “陈发酵醪”以及醪中悬浮颗粒的大 小、含纤维量的多寡、保持良好的菌 球体或菌球体被破坏都影响过滤速度。 （2）温度对过滤速度影响很大。 （3）柠檬酸发酵醪中的固体颗粒所形 成的滤饼属可压缩性滤饼，注意压力 要逐渐增加，特别开始过滤时。
（2）pH的控制
中和终点pH对柠檬酸 钙的质量有决定性的影响， pH在偏酸 性范围时，柠檬酸钙的质量比偏碱性条 件下纯的多，但溶解度也相应增加，在 接近和达到碱性范围时，发酵醪中固有 的可溶性有机杂质（主要是蛋白质和碳 水化合物），会形成胶黏性物质而析出， 许多弱酸络合物也会变成不溶性化合物， 这些杂质都会混入钙盐沉淀中。因而造 成与因素（1）中所述的同样后果。
V Vh = t(过滤+洗涤+装拆+准备) = 式中
V
∑ t
Vh----生产能力，即每1h平均所得的滤液量（m3） V ----一循环操作（四个阶段）周期所的滤液量（m3） ∑ t----整个循环周期的总时间（h）
过滤机的生产能力主要受过滤速度
所控制。由上式求得的Vh的量，除 以该过滤机的总面积，即该机的平 均过滤速度。
（5）在固体颗粒细小、胶体较多、粘度大 的物料中加助滤剂是提高过滤速度的较好 方法。助滤剂本身必须是颗粒均匀、性质 坚硬、理化性能稳定的不可压缩性物质。 助滤剂可以在过滤机上形成预涂层，作为 过滤介质使用，也可以按一定比例均匀地 混于被滤液中，然后一起被送入过滤机中， 可形成较疏松的滤饼，降低其可压缩性， 使滤液能顺畅通过。过滤结束后被除去。 需要回收利用的滤饼，不能加助滤剂。
柠檬酸提取及鉴定实验方案
柠檬酸的提取及鉴定实验目的学习钙盐沉淀硫酸转溶提取柠檬酸的方法；学习结晶精制柠檬酸的方法实验材料发酵液：黑曲霉玉米粉发酵培养基；仪器：旋转薄膜蒸发仪、水浴锅；其它材料：0.1mol/L NaOH、0.1M H2SO4溶液、固体碳酸钙粉末实验原理钙盐沉淀法的原理碳酸钙（或氢氧化钙）可与发酵液中的柠檬酸发生中和反应，生成难溶性的柠檬酸钙沉淀，柠檬酸钙在80～90度之间溶解度极低，通过过滤（或离心）的方法将其与糖、蛋白质、其他有机酸、无机离子等可溶性杂质分离开。
在柠檬酸钙沉淀物中加入稀硫酸在80～85度之间进行酸解反应，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，硫酸钙在80度左右溶解度极低，趁热过滤（或离心）可将其与柠檬酸分离，获得较纯净的柠檬酸酸解液。
后续工艺：柠檬酸酸解液再进行脱色、阳离子交换层析除去杂质，最后可以通过结晶法获得纯净的柠檬酸晶体。
结晶法的原理原理：通过冷却、挥发溶剂等方法使溶液达到过饱和状态时，具有一定形状和大小的固态粒子可从均匀的溶液中析出，称为结晶。
结晶过程：1、产生晶核；2、晶核成长过饱和度是这两个过程的推动力。
影响晶体质量的因素：1、溶液中杂质少，产品纯度较高；2、冷却结晶时，温度要缓慢降低，防止晶核大量形成，形成粒度不一的晶体；3、控制搅拌速度，结晶初期可搅拌促使晶核产生，晶核成长时降低搅拌速度，防止将长成的晶体打碎。
实验步骤1、黑曲霉玉米粉发酵液八层纱布过滤除去菌体和残渣量筒测量清液体积 V0；2、量取5mL清液、5mL蒸馏水于锥形瓶中，再滴入2～3滴酚酞用0.1M NaOH 溶液滴定，滴定终点为淡红色，30s内不褪色，记下消耗的NaOH 溶液体积V1；M酸（g）＝V1(mL)×0.1(mol/L)×0.001×1/3×210×V0/5M碳酸钙（g）＝M酸×（ V0－5）/V0×1/210×3/2×1003、钙盐沉淀：称取一定质量的碳酸钙粉末，边搅拌边缓慢地加入到剩余的清液（止产生大量的泡沫使溶液溢出），85度反应10min（使柠檬酸钙沉淀下来），趁热抽滤，并用与沉淀体积相当的沸水涤沉淀物2次（除去残糖、蛋白质等可溶性杂质）；4、酸解：VH2SO4（mL）＝M碳酸钙/100/0.1(mol/L)×10001 / 2在沉淀物中加入约等体积的蒸馏水，调匀成浆状，量取一定体积0.1M H2SO4溶液，边搅拌边加入到浆液中，85度反应10min，趁热抽滤，获得清亮的酸解液；5、低压浓缩：将酸解液转入圆底烧瓶中，水浴60～70度，真空度0.08~0.09MPa，浓缩至原体积约1/10；6、冷却结晶：将浓缩液转入烧杯中，于室温下搅拌，待出现晶核，停止搅拌，再移入4度冰箱冷却结晶约15min，抽滤获得柠檬酸晶体，烘干后称重m 柠檬酸。
柠檬酸液态发酵及提取工艺
柠檬酸液态发酵及提取工艺综述摘要:发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。
液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。
发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。
国内目前有很多人研究了MgCl2、普鲁兰酶、植酸钠、磷浓度、菌种、木薯原料、纤维素糖化液、玉米粉淀粉混合原料、接种量和碳氮比、溶解氧、发酵罐搅拌系统、尿素、乙醇等添加剂、初始含糖量、温度、pH、发酵时间等等对黑曲霉发酵产酸的影响，从而改良提取工艺。
关键词：柠檬酸液态发酵提取工艺一、前言柠檬酸(citric acid）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid)或2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸(2-hydroxy propane-1，2，3-triearboxylic acid)是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
分子式：C6H8O7（相对分子质量：192.13），无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。
极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大；从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。
柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。
柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。
另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。
它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。
从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法
从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法第２８卷第１期北京工业大学学报２００２年３月ＪＯｕＲＮＡＬｏＦＢ即ＮＧｖｏｌ２８Ｎｏ【ＰＯＬＹＴＥｃ｝Ⅱ、１ｃＬＪＭｖＥＲｓ丌ＹＭａｒ２００２从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法彭跃莲，姚仕仲，纪树兰，马重芳（北京工业大学环境与能源工程学院，北京ｌｏ００２２）摘要：总结了国内外从柠糠酸发酵藏中提取柠檬酸的主要方法，并详细阐述了萃取法，离子交换吸附法．电渗析法和摸法分离的原理、研究进展．优缺点及应用概况．关■词：柠檬酸发酵｛戎；柠檬酸；提取中田分类号：Ｔｓ２０２．３文献标识码：Ａ文章编号：０２５４—００３７（２００２）０ｌ一００４６０６０引言柠檬酸广泛应用于食品、医药、化妆品、洗涤剂、包装、金属清洗、建筑、环保等行业，每年需要几十万ｔ．多年来，世界柠檬酸的年消耗增长速度一直在７，５％左右．过去柠檬酸主要是从柠檬、柑橘、菠萝等果实中提取．现在生产柠糠酸的方法大致有两种：一种是化学合成法，另一种是生物发酵法．其中化学合成法由于原料、产率，污染、经济等问题无法与发酵法相比，发酵法则由于原材料丰富、产量高、成本低而倍受青睐，所以现在以发酵法生产为主．柠檬酸是目前世界上以生物化学方法生产产量最大的有机酸，全球年产量（５０～６０）万ｔ”１．我国是一个柠檬酸的生产大国，１９９５年的产量为１６万ｔ…，１９９９年底达到２０万ｔ，其中８０％以上都出口国外，在国际市场上占有重要地位．柠檬酸发酵液成分复杂，并且因原料和发酵工艺不同而各不相同．除柠檬酸外，还包括苗体、残糖、蛋白质、色素、胶体、有机杂酸、无机盐等多种杂质，总的来说，它们来源于原材料、未消耗的营养盐或发酵的中间副产物．所以从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸是比较困难的．我国独创的薯粉直接深层发酵法工艺处于世界先进水平，且自行开发的黑曲霉菌产酸效率与国外接近．但在提取率、机械化程度和劳动生产率等方面比较落后，因而在国内研究从发酵液中高教、低能耗地提取柠檬酸是一个极有意义的课题．从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法主要有以下几种：钙盐法、萃取法、离子交换吸附法、电渗析法、超滤膜法．下面就这几种方法分别作一个简要介绍．１钙盐法钙盐法是一种传统的从发酵液中提取有机酸的方法，在中国用得最为普遍．它是利用柠檬酸钙不溶于水，但能溶于酸的特点，在含柠檬酸的上清液中加入已００、或ｃａ（ＯＨ）：中和，使柠檬酸生成柠檬酸钙沉淀，固液分离后，柠檬酸钙经过洗涤再用硫酸酸解，生成柠檬酸水溶液．再经过脱色、去除阴、阳杂离子后得到提取液进入浓缩、结晶工序得到纯柠檬酸固体产品．我国常用的钙盐法流程如图１所示．图ｌ钙盐法提取柠檬酸的工艺流程收请日期：２０叭－０６．０８．作者简介：彭跃莲（１９６争＿１，女，讲师，博士第１期彭跃莲等：从柠矬酸发酵液中提取柠檬酸的方法４７美国和前苏联的提取流程与我国常用的流程有所差别”１．为了提高产品质量，降低生产成奉，人们对钙盐法进行了很多改进工作．如１９８３年湖北省化学研究所与黄石柠檬酸厂进行了“改性石灰乳代替碳酸钙中和新工艺”试验，获得成功…．这种新工艺明显缩短了中和时间和柠檬酸钙的洗涤时间，中和时无大量气体逸出，改善了劳动条件，提高了设备利用率，并且产品质量稳定．李秀”１还研究了用电石废癌代替碳酸钙作为中和剂，提取效果不亚于石灰．钙盐法因为工艺成熟、设备简单、原材料易得和产品质量稳定等特点而在国内外被广泛使用．但经过这么多年的应用，其缺陷日益显露：一是得到的提取液中柠檬酸质量分数较低，一般低于２０％“１，增大了后续浓缩段的负荷；二是单元操作损失多，总收率低，国内厂家一般在６０％～７５％ｗ“，超过７０％的很少…，对＿以薯于为原料的生产工艺收率耍低（我国主要以薯干为原料）；三是在提取过程中柠檬酸经历了多次相变，消耗化工原料多，固液分离量太，能耗高；四是环境污染严重，产生大量的固体废弃物Ｃ￡Ｉｓｑ，其排放量１．０～２．５ｔ废物／ｔ柠檬酸…’，在环境问题日益突出的今天，这种方法越来越不适应环保的要求．另外还有提取工艺长、工人劳动强度大、工作环境恶劣、提取设备腐蚀严重等缺点．因此，改革现行的柠檬酸提取工艺势在必行，国内外在这方面确实做了大量的工作．并取得了可观的经济效益和环境效益．２萃取法萃取法提取柠檬酸较早采用的是溶剂萃取（ＬＬＥ），这种方法已在国内外工业化，我国在８０年代初就发表了用萃取法提取柠檬酸的研究论文．这种方法能提取浓度在（Ｏ．１～２．０）ｈｎ０１／订的有机酸”１，多级萃取可使葶取效率达到９０％“…．美国第二大的柠檬酸生产厂Ⅶｌｅｓ公司１９８１年采用溶剂萃取法从发酵液中提取柠檬酸．萃取液是４０％三月桂胺和６０％异丁醇，反萃取剂是８０℃热水¨¨．美国的｝Ｉａａｒｎｌａｎ锄ｄ耻ｉｍｅｒ公司和欧洲的陌１ｚｅｒ公司则都采用烷基叔胺萃取”“．目前常研究的萃取剂包括：丁醇、丙酮、磷酸三丁酯“”“、咖ＩＡ，Ｎ，Ⅳ．二烷基酰胺“…、三烷基氧磷““、Ｎ一烷基酰胺”６’和石油亚砜等，但研究得更多的是有机胺”“”。
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综合实验1：柠檬酸发酵及产物提取
（一）柠檬酸发酵
一、实验原理
柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羧生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。
但就柠檬酸产生菌而言，由于其顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：
2 C6H12O6 +
3 O2→2 C6H8O7 +
4 H2O
国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。
二、实验器材
（一）材料
1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等
（二）主要仪器设备
1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等
三、操作步骤
1．种子培养基制备：
马铃薯培养基配方:(1000ml)
马铃薯（去皮）200g
葡萄糖（或蔗糖）20g
琼脂15~25g
水1000ml
自然pH
2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。
3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。
4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，7水合硫酸镁0.025%。
5. 上罐灭菌（操作同实验一）
5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、200r/min条件下发酵4天。
6.分别在0，24，48，72，96小时测定一下参数。
四、实验结果
1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。
2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。
3．计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。
总反应式：2C6H12O6+3O2→2C6H8O7+4H2O
180 192
理论转化率=192/180=106.7%
（二）生长曲线测定
1. 将烘干的离心管称重，记录重量
2. 取10ml发酵液离心，5000rpm，10min（上清液留作下步用），将试管倒置10min，80℃烘干1h。
3. 称重，计算菌丝体干重。
4. 以时间为横坐标，菌丝体重量为纵坐标作图。
（三）酸度测定——产物生成曲线
试剂: 0.1% 酚酞指示剂, 0.1429M NaOH 溶液
酸度：100ml发酵液中柠檬酸的克数。
酸度的测定方法：取发酵液1ml，加入19ml蒸馏水，以酚酞为指示剂用0.1429M的NaOH 溶液滴定至粉红色，所消耗的NaOH毫升数，即为发酵液酸度。
以时间为横坐标，酸度为纵坐标作图。
（二）还原糖的测定——糖利用曲线
一、实验原理
在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
三、试剂和器材
1、试剂
6.5g DNS溶于200-300ml去离子水，配制2mol/l NaOH 溶液325ml，3. 45g 甘油（丙三醇）三者混合定容至1000ml即可。
葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为2.0mg/ml。
2、材料
发酵液
3、器材
WFJ UV－2000型分光光度计，水浴锅，电炉，试管。
四、操作方法
1、葡萄糖标准曲线制作
水迅速冷却，各加入蒸馏水12.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。
以葡萄糖含量（mg）
为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 蔗糖酸解
取2ml离心后的上清液，置于干净的试管中，加入2ml 2M盐酸摇匀，置于沸水浴中水解25min，使蔗糖水解成单糖。
水解液用2ml 2M NaOH调至中性，全量倒入100ml容量瓶中，定容。
3、样品中含糖量的测定
各加入蒸馏水12.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。
测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。
（如果测量的OD值高于标准曲线的最高值，稀释后重新测量，注意计算稀释率）。
3、结果处理
发酵液含糖量（g/ml）=[(A×N)/1000]*100
A:为由吸光度查标准曲线所得的还原糖的毫克数
N：为稀释倍数。
（三）柠檬酸的提取——柠檬酸钙的制备
一、实验原理
在成熟的柠檬发酵液中大部分是柠檬酸，但还含有部分山芋粉渣、菌丝体以及其它的代谢产物的杂质。
柠檬酸的提取是柠檬酸生产中极为重要的工序，柠檬酸的提取方法有钙盐沉淀法、离子交换法、电渗折法及萃取法等，目前广泛用于国内生产的是钙盐沉淀法，其原理是利用柠檬酸与碳酸钙反应形成不溶性的柠檬酸钙而将柠檬酸从发酵液中分离出来，并利和硫酸酸解从而获得柠檬酸粗液，经活性炭、离子交换树脂的脱色及脱盐，再经浓缩，结晶干燥等精制后获得柠檬酸成品，其中和及酸解反应式如下：中和：2C6H8O7·H2O+3CaCO3→Ca3（C6H5O7）2·4H2O↓+3CO2↑+H2O
酸解：C a3（C6H5O7）2·4H2O+3H2SO4+4H2O→2C6H8O7·H2O +3CaSO4·2H2O↓
本实验以提取柠檬酸钙盐为主。
二、实验器材
（一）实验材料
1．柠檬酸发酵液、轻质碳酸钙（200目）、0.1429N氢氧化钠溶液、1%酚酞指示剂
（二）仪器设备
1．制备式离心分离机、滴定管、烘箱
三、实验步骤
1．发酵液预处理：将成熟的柠檬酸发酵液加热至80℃，保温10~20分钟，趁热进行离心分离，取滤液备用并记录滤液总体积。
2．发酵液总酸的测定：取滤液1ml，加5ml蒸馏水于洁净三角瓶人加入1滴酚酞指示剂用0.1429N NaOH滴定于初显红色为止，记下NaOH的消耗量。
3．中和：将发酵滤液加热至70℃，同时加入发酵液总酸量72%的轻质碳酸钙进行中和至pH 5.8，残酸0.2%~0.3%，并于85℃条件下搅拌并保温30min。
4．离心及洗糖：将中和液趁热离心，倾去上清液后加入滤液总量1/2的80℃热水洗糖，
再次离心所得固体即为柠檬酸钙盐。
5．将所得柠檬酸钙置于干燥洁净的表面皿中，于105℃烘干称重。
四、实验结果
1．计算发酵液中总酸浓度及发酵所得的总酸量。
2．根据所得的钙盐重量计算钙盐提取的提取收率。
3．简述发酵液预处理的意义及洗糖的目的。