实验三 酵母菌大小和数量测定
实验三 微生物的显微计数和大小测量
微生物的显微计数和大小测量生05 边晔2010030026周四班5-1 同组成员：徐竞实验时间2012年10月25日一、实验目的1)了解血球计数板的构造和使用方法，并掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。
2)学习用显微测微尺测量酵母细胞的大小，对微生物大小有一种直观的认识。
3)学习灭菌技术及注意事项.二、实验原理血球计数板是一块比普通载玻片厚得多的玻璃片，其上由四条平行槽构成的三个平台，中间的平台较宽，其中间又被一短槽隔成两半，每边平台上面各刻有一个方格网，即为此计数板的计数室。
计数室的长宽各为1 mm，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0.1mm3。
计数室有两种规格。
一种是16X25型，共有16个大格，每个大格又分为25个小格。
另一种是25X16型，共有25个大格，每个大格又分成16个小格。
应用血球计数板在显微镜下直接计数微生物细胞的数量，就是先测定若干个方格中的微生物细胞的数量。
再换算成每ml菌液中微生物细胞数量。
微生物大小的测定，需要在显微镜下借助测微尺（包括目镜测微尺和镜台测微尺）完成。
目镜测微尺是一块放入目镜中的圆形玻片，用于测量经显微镜放大后的细胞图像。
目镜测微尺需要先用镜台测微尺进行校正，然后根据微生物细胞相对于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。
三、实验器材实验用具：载玻片、盖片、吸管、擦镜纸、装有蒸馏水的洗瓶。
实验仪器：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、手动计数器;菌种：酿酒酵母四、实验步骤1显微计数1） 200rpm,28 ℃, 36h,培养细菌，稀释20倍分装EP管。
(助教统一完成)2）在加样前，先对计数板的计数室进行镜检若有污物，则需清洗后才能进行计数。
3）震荡摇匀样品后滴加样品4）显微镜计数5） 重复10次实验过程，取其平均值，按公式计算每ml 菌液中所含的酵母菌细胞数。
6） 清洗血球计数板2微生物细胞大小的测定 1) 目镜测微尺校准。
酵母菌形态的观察和显微镜直接计数法
Байду номын сангаас
三.实验步骤: 作业 画图说明你所观察到的酵母菌的形态特 征，并说明死细胞和活细胞分别为什么颜 色。
三.实验步骤:
二．显微镜直接计数法
1. 菌悬液的制备：以无菌水将酿酒酵母制成浓度适 中的菌悬液 2. 镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进 行镜检，若有污物，则需清洗，吹干后才能计数。 3. 加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片， 再用无菌滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小 滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室， 一般计数室均能充满菌液。 注意：取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有 气泡产生。
三.实验步骤:
4. 显微镜计数：加样后静置5分钟，然后将血球 计数板置于显微镜下，先用低倍镜找到计数室， 再用高倍镜进行计数。 在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀 释度再计数。一般样品稀释度要求每个中格内1520个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个 角和中央的一个中格）中的菌液进行计数。 注：位于格上的菌体一般只数上方和右边线上的 （计上不计下，计右不计左）。若遇酵母出芽， 芽体大小与母细胞一样大时，即作为两个菌体计 算。
酵母菌细胞计数的原理:
将菌液放在已知体积的计数室(1mm2×0.1mm)，计数 室薄，因此每个细胞都可以被看到。体积确定，因 此数完所有细胞后就知道单位体积的细胞个数。
三.实验步骤: 一、酵母菌形态的观察 （美蓝浸片的观察）
1. 在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色 液，然后按无菌操作接种环挑取少量酵母菌苔放 染色液中，混合均匀。 2. 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触， 然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。 注意：盖玻片不宜平放，以免产生气泡影响观察 3. 将玻片放置约3分钟后镜检，先用低倍镜观察 后用高倍镜观察酵母菌的形态，并根据颜色区别 死活细胞。
实验三 酵母菌形态及菌落特征的观察及显微镜下血球计数板计数
（一）注意事项
1.熟知血球计数板的计数原理 2.血球计数板计数时酵母菌菌液需稀释到可 计数的浓度
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《工程微生物学》实验教学多媒体课件 15
七、注意事项和问题
（二）问题
1. 将实验结果填入下表中 每个大方格菌数
计数次数 稀释 倍数 菌液浓度 平均值
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五、实验方法及步骤
（一）酵母菌形态及假菌丝的观察 (1) 视菌悬液浓度，加无菌水适当稀释。
(2) 用接种环取酵母菌悬液少许，放在洁净的 载玻片上，于低倍镜下观察酵母菌和假菌丝的形 态。
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二、实验原理
大多数酵母菌形成的菌落与细菌的相似、但较细 菌的菌落大而厚、湿润、粘稠、易被挑起。菌落多呈 乳白色，少数为红色(如红酵母)，酵母菌菌落的颜色、 光泽、质地、表面和边缘特征均为识别时的重要依据。 酵母菌的某些种类在液体培养基中或在人为的不通气 条件下，培养较长时间后，则生长成长形的细胞，且 相互连接并分枝，形成藕节状排列结构，称为假菌丝。 它是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。
微生物大小测定及计数
2、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一菌体大小时，其测定结果是否相同，为什么？
答：测定结果不相同。因为在不同倍数的目镜下，细菌大小发生变化，而目镜测微尺每格大小不变，所以测定结果不同。
四、仪器和其他用品：载玻片、盖玻片、显微镜、镊子、接种环、血球计数板、显微测微尺、滴管、酒精灯
五、操作步骤：
1、微生物大小的测定
（1）取下显微镜右目镜，将目镜测微尺放在目镜镜筒内的隔板上，然后放上目镜透镜，将目镜装回镜筒。
（2）校正目镜测微尺：在低倍镜下调节焦距，当清晰看到镜台测微尺的刻度后，用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别输出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。
（2）将血球计数板盖上盖玻片，用无菌毛细管吸取少量摇匀的酿酒酵母菌液，滴在盖玻片的一个顶点，待菌液从盖玻片另一对角流出为满。
（3）先在低倍镜下找到计数室，再用高倍镜计数。每小格内的菌数不能超过8个为宜。当每小格内的菌数过多时，适当稀释。
（4）任选5个中格计数（5个中格不可以挨着；酵母菌出芽计1个菌体；计数时，位于边线上的细胞，记上不记下，计左不计右）
（3）用同样的方法在高倍镜下和油镜下进行校正。并计算目镜测微尺每小格所代表的实际长度。
（4）制酵母菌玻片：用接种环取菌在蒸馏水中涂抹，加热干燥，用美兰染色1’30”，流水脱色，自然干燥。
（5）先在低倍镜和高倍镜下找到菌株，再在油镜下测出酵母菌的长度和宽度。重复3次并记下平均值。
2、酵母菌的显微计数
（1）将血球计数板洗净，再用95%乙醇棉球擦洗，自然干燥。
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微生物大小及数量测定
一、实验目的：
实验三 酵母菌大小和数量测定
5. 计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用吸水纸
五、实验结果记录
（一）微生物细胞大小测定 1、目镜测微尺校正：因为镜台测微尺1小格＝10 μm，故 目镜测微尺1小格＝ μm 2、酵母菌大小测定：
菌体 目尺格数 实际直径(μm)
（二）细胞数量测定 总菌数的测定(利用公式计算)。T表示五个中方格中的总菌数； D表示菌液稀释倍数。
不同目镜物镜组合的放大倍数不相同目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正以求出在一定放大倍数下目镜测微尺每小格所代表的相对长度
实验三 酵母菌大小和数量的测定
某些酵母菌的形态
面包酵母
出芽生殖中的啤酒酵母实Fra bibliotek内容实验目的 实验原理 实验材料 实验方法和步骤 实验结果记录 思考题
四、实验方法与步骤：
（一）细胞大小测定 1、对目镜测微尺的校正
镜台测微尺有刻度的一面朝上，置显微镜载物台上 （目镜测微尺已在镜筒中），在高倍镜下进行目镜测微 尺校正。 2、细胞大小的测量
酵母菌悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜 载物台上。调节显微镜光圈，用目镜测微尺测量细胞直 径。
关键：先低倍镜下找大格位置，找到计数 （二）细胞数量测定
9 1mm 0.1mm3 (10-4 ml), 400
0.1mm
小格
中格
如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左 线不数右线，以减少误差。可拍照后从图片上计数。
三 、实验材料
1、菌种： 啤酒酵母菌 2、器材： 显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球 计数板、盖玻片、无菌滴管、吸水纸、擦 镜纸
微生物的大小及数量的测定
微生物试验报告
内沿盖玻片的右上角滴入一小滴(不宜过多)， 使菌液沿两玻片间自行渗入计数室， 勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。 (3)先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。 (4)计数时用 16 中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的 4 个中格(即 100 小格)的酵母菌数。如果是 25 中格计数板。除数上述四格外， 还需数中央 1 中格的酵母菌数(即 80 小格)。由于菌体在计数室中处于不同的空 间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能 数到全部菌体， 防止遗漏。 如菌体位于中格的双线上， 计数时则数上线不数下线， 数左线不数右线，以减少误差。 (5)凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品 重复分数 2-3 次(每次数值不应招差过大，否则应重新操作)，取其平均值，按下 述 公 式 计 算 出 每 毫 升 菌 液 所 含 酵 母 菌 细 胞 数 （ 25 中 格 ）。
关键词
目镜测微尺 物镜测微尺 血球计数板
前言
微生物细胞的大小， 是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之 一， 也让我们对微生物的实际大小有了一个感性的认识。微生物数量的测定在微 生物生长曲线中运用非常重要， 我们从微生物的数量上了解其生长状况，这也能 指导我们的生产工业。
一、 实验目的
1. 了解显微镜测定微生物大小与血球计数板测定微生物数量的原理。 2. 学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术，包括目镜测微尺、镜台测 微尺的校正技术与测定细胞大小的技术。 3. 了解血球计数板的结构，学习并掌握血球计数板计数微生物数量的技术，包 括样品的点样、菌数计数的方法与计算。
1
微生物（2） 镜台测微尺（图 2）
微生物大小的测定及显微镜直接计数法
微生物大小和数量的测定一、目的要求1．学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。
2．增强微生物细胞大小的感性认识。
3．了解血球计数板的构造、明确其计数原理。
4．学习并掌握使用血球计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法。
二、基本原理l.显微测微尺显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。
目镜测微尺（图1）是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格两种。
测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。
因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定大放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。
镜台测微尺全长1mm，等分为100格，每格0.01mm。
用于校正目镜测微尺每小格的长度.目镜测微尺每格长度（μm）=两重合线间镜台测微尺格数×10两重合线间目镜测微尺格数2.表示方法球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。
如金黄色葡萄球菌直径约为0.8µm，枯草芽孢杆菌大小为0.7~0.8×2~3µm。
图1：目镜测微尺和镜台测微尺3．显微直接计数法：将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板或Hawksley计数板。
三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
酵母菌大小的测定及计数实验流程
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两重合线间目镜测微尺格数
用同样的方法可对高倍镜和油镜进行校正
2、显微直接计数法 （血球计数板）
血球计数板的构造
0.1毫米
a.平面图(中间平台分为两半，各刻有一个方格网)
b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙)
1mm/20格
A.25中格*16 小格计数板
1/400mm2
个 数 小 室 格 ，每 。，每个 体个方 积大格 为格网 边个 长大 格 B.16中格*25 小格计数板 ， 计中 数间 室大 共高格 为 血球计数板计数网的分区和分格 计
吸干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。
5. 计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用吸水纸
五、实验结果记录
（一）微生物细胞大小测定 1、目镜测微尺校正：因为镜台测微尺1小格＝10 μm，故 目镜测微尺1小格＝ μm 2、酵母菌大小测定：
菌体 目尺格数 实际直径(μm)
（二）细胞数量测定 总菌数的测定(利用公式计算)。T表示五个中方格中的总菌数； D表示菌液稀释倍数。
实验三 酵母菌大小和数量的测定
某些酵母菌的形态
面包酵母
Байду номын сангаас出芽生殖中的啤酒酵母
实验内容
实验目的 实验原理 实验材料 实验方法和步骤 实验结果记录 思考题
一、实验目的：
1.学习使用目镜测微尺和镜台测微尺在显微镜下测 定微生物大小的方法； 2.学习使用血球记数板测定微生物数量的方 法
六、思考题
1、使用显微测微尺为什么要进行校正？ 2、为何用血球计数板可测得总菌值？
七、注意事项
1、取样时先要摇匀菌液，加样时技术室不 可有气泡产生。
2、活细胞是透明的，因此在进行显微计数 观察时适当减低视野亮度，以增大反差。 3、校正目镜测微尺时，光线不易过强，否 则难以找到镜台测微尺的刻度。
目镜测微尺的校正： 在低倍镜下，看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜 测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，寻找两条完全 重合的刻度线，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和小方 格的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长10µ m，所以由下列公 式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。
两重合线间镜台测微尺格数×10 目镜测微尺每格长度（μm）=
9 1mm 0.1mm3 (10-4 ml), 400
0.1mm
小格
中格
如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左 线不数右线，以减少误差。可拍照后从图片上计数。
三 、实验材料
1、菌种： 啤酒酵母菌 2、器材： 显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球 计数板、盖玻片、无菌滴管、吸水纸、擦 镜纸
二、实验原理：
1、测微尺的构造及测定原理：
目镜测微尺是一块具有刻度的圆形玻片。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻 片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。 不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样， 因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一 定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
四、实验方法与步骤：
（一）细胞大小测定 1、对目镜测微尺的校正
镜台测微尺有刻度的一面朝上，置显微镜载物台上 （目镜测微尺已在镜筒中），在高倍镜下进行目镜测微 尺校正。 2、细胞大小的测量
酵母菌悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜 载物台上。调节显微镜光圈，用目镜测微尺测量细胞直 径。
关键：先低倍镜下找大格位置，找到计数 （二）细胞数量测定
1.
2. 3. 4.
室之后将其转入视野中心，再换高倍镜找 中格，并观察和计数。
取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。 取酵母菌稀释液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴， 使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。 静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央 计数室。 在高倍镜下计数：随机计数五个中格的菌数，然后求得 每个中格的平均值。乘上16(或25)就得出一大格中的 总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。