毛细管电泳法

三、进样与检测
1

进样方法 电动进样
也称电迁移进样. 方法:将毛细管的进样端插入装有试样溶液的 试样管中，试样管中插入电极，与检测端的 缓冲液间施加进样电压，并维持一定时间， 试样溶液在电泳和电渗流作用下进入毛细管， 然后再将试样溶液换成载体缓冲液，电泳即 可进行。
三、进样与检测
1

进样方法 流体动力学进样
2
30
B: Dextran-5,000 (average Mwt: 5000)
40
1.0
1 20
40
C: Dextran-12,000
50 60
10 2
10.00
20.00
30.00
Time (min)
7. 药材中的生物碱成分分析
1 苦参碱 2 槐定碱 3 槐果碱 4 lehmannine 5 sophoramine 6 氧化苦参碱
2）特点: 等电聚焦实际上也是一个试样浓缩过程， 这一过程可用于浓缩试样组分。 具有极高的分辩率，可以分离等电点相差 0.01pH的两种蛋白质. 注意:电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定
5.毛细管电色谱（CEC）

CEC:以电渗流驱动流动相，开管和 填充两种。
比高效液相色谱具有更高的柱效
第三部分 毛细管电泳的应用
放射
10-9－10-11
三、进样与检测
2 检测方法
紫外吸收 检测器
0.0030 AU
PDA - 233nm
9
1
3 5
6 7
8
2
4
0.0000 3.0 4.0 5.0 Minutes 6.0
四、CE的生物样本的预处理

CE生物样品预处理相对简单，因为它无需 考虑柱损坏的问题，几乎所有的生物样品 预处理方法都适用于CE。 一般都要对生物样品进行分离纯化、浓集， 有时还要进行衍生化。 最常用的CE前处理是去除蛋白。
少样品的前处理步骤； D. 可自由选择被分离物质的类型，从而使图谱清晰； E. 前处理过程简单，甚至勿需前处理； F. CE所需样品用量小，可以分析一些难以取得而又 样品量有限的生物样品，如泪液等。
缺点： 但CE仅能实现微量制备，而HPLC可作常量 制备； CE的定量精密度稍低于HPLC，采用电动进 样和外标法定量时定量精密度较差。
也称为虹吸进样、重力进样、压差进样
方法:毛细管进样端插入试样溶液容器，通过 进样端加压，或检测端出口减压，或调节 进样端试样溶液液面大于出口端缓冲液液 面高度，利用虹吸现象，使进样口端与出 口端形成正压差，并维持一定时间，试样 在压差作用下进入毛细管进样端，再把进 样端放回缓冲液液槽中，进行电泳。
三、进样与检测
4.4
F 2
4.5
A 3 4
4.6 4.7
-0.008
5
4.8
6
4.9
7
5.0
AU
3. 四种碱性蛋白的分离
4种碱性蛋白的电泳分离图。A：涂层管；B：未涂层管。 1：细胞色素，2：溶菌酶，3：胰蛋白酶原，4：α-胰凝乳蛋白 酶原
4. DNA、核酸的分离
DNA片段电泳迁移时间图
5.单糖的分离
6. 寡糖图谱
3 . 毛细管凝胶电泳（CGE）
CGE是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种 电泳方式,用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介 质，网状结构，按分子的大小分离。
毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶 电泳的优点 :
a. 电泳峰尖锐，柱效极高 b. 短柱上实现极好的分离 c. 试样容量为10－12g 主要缺点:制备柱较困难，寿命较短
第二部分 分离模式
1 毛细管区带电泳 2 胶束电动色谱 3 毛细管凝胶电泳 4 毛细管等速电泳 5 毛细管等电聚焦 6 毛细管电色谱
1 . 毛细管区带电泳
CZE 也称为毛细管自由溶液区带电泳 毛细管电泳中最基本的操作模式，应用最广泛，是其 它各种操作模式的母体
2. 胶束电动色谱（MECC）
MECC的原理：在电动色谱中引入了表面活 性剂胶束，在电场作用下，毛细管水相可 看作流动相，胶束相可看作“准固定相”， 溶质由其在胶束相和水相中的分配系数不 同，而在不同的时间流出，从而达到了分 离。
已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核 酸、DNA等强有力的工具。例应用CGE分离与 激光诱导荧光检测相结合，用于DNA序列快速 分析。
4.毛细管等电聚焦（CIEF）
1）CIEF的原理: 建立在不同蛋白质或多 肽之间等电点（pI值）差异基础上的分 离方法。 蛋白质的等电点(pI):指蛋白质分子的表 观电荷数为零时的pH值。
第九章 高效毛细管 电泳法
（Capillary Electrophoresis, CE）
沈富兵
教学要求

掌握毛细管电泳法的基本原理 熟悉主要分离模式和毛细管电泳法的优点 了解毛细管电泳法中的预浓缩技术
定义


高效毛细管电泳(High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE)又叫毛细管电泳 (capillary electrophoresis，CE)，指以高压电 场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据 样品中各组分之间淌度（电渗流的大小单 位）和(或)分配行为上的差异而实现分离的 一种液相分离技术。 CE是经典电泳技术和现代微柱分离技术相 结合的产物。
9
1
3
6
5
7
8
2
0.0000 3.0
4Байду номын сангаас
4.0
5.0 Minutes
6.0

1: CL-, 2: NO3- ，3：SO42-， 4：C2O42-，5：苹果酸根，柠檬酸根，6： 醋酸根，乳酸根，7：磷酸根
THE END!

第一部分 基本原理
一、基本装置
毛细管 电极 试样 缓冲液 高压电源
（可高至30KV）
数据处理 检测器 电极 缓冲液
二、基本原理

在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下 以不同的速度定向迁移的现象叫电泳。
二、基本原理
正离子的运动方向和电渗流一致，故 CE所用的石英毛细管柱，在pH＞3时，石 在高电压作用下，双电层中的水合阳 最先流出；中性粒子的电泳速度为 英毛细管壁上的硅羟基在水溶液中发生电 粒子在电解质溶液中的迁移速 离子引起流体整体地朝负极方向移动， 离，产生的SiO-负离子使毛细管壁内表面 “零”，故其迁移速度相当于电渗流 度等于电泳和电渗流(EOF)两 带负电，和溶液接触时相应的缓冲液带正 该现象称为电渗流。 速度；负离子的运动方向和电渗流方 电，形成了双电层。 种速度的矢量和。 向相反，但因电渗流速度一般都大于 电泳流速度，故它将在中性粒子之后 流出，各种粒子因迁移速度不同而实 现分离。


20世纪30－40年代 蒂塞利乌 斯 (A.W.K.Tiselius）建立了移动 界面电泳，将电泳发展成分离技 术 获得1948年诺贝尔化学奖
1981年 J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs实验上和理论上为毛 细管电泳的发展奠定了基础。 上一世纪后二十多年分析化学领域中发展最迅速的分离分 析方法。
5 3
1:APTS-glucose 2:APTS-glucopyranosyl-a-1,6-glucose 3:APTS- glucopyranosyl-a-1,6- glucopyranosyl-a-1,6- glucose
10 14 10 20
Rel. Unit (RU, x1E+01)
2.0
A: Dextran-1,000 (average Mwt: 1000)
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
蛋白质/多肽/氨基酸 糖类/糖蛋白 核酸/核苷酸 天然产物 合成药物 手性物质 无机/有机离子 病毒/细菌 水溶液中的分子间相互作 用
1. 不同分子量蛋白的分离
2. 血红蛋白的检测
0
1 2
EOF
A2 C, E, O S, D, G
0.008 0.008




有机溶剂乙腈在CE的生物样品预处理中， 既可除去蛋白又可释放蛋白结合的药物， 还可提高疏水性药物的溶解度，而且在CE 的电泳中还有在线富集的作用，所以常用 2～3倍体积的乙腈提取生物样品中的药物。 可以用液-液萃取和固相萃取小柱离线纯化、 富集样品，将生物样品中高浓度的无机盐 除去，浓集效率为10～30倍，
7 氧化槐果碱 8 金雀花碱 9 苦豆碱 10 蝙蝠葛碱 11 东莨菪碱
8. 药材中黄酮化合物的分析
对照品 样品
OG：木蝴蝶素A －7－O-葡萄苷酸
B：黄芩素
WG：汉黄芩素－7－O-葡萄苷酸
W：汉黄芩素
BG：黄芩苷
O：木蝴蝶素A
9. 盐酸苯丙醇胺的异构体杂质检测
10. 啤酒中的阴离子分析
0.0030 AU PDA - 233nm
五、CE的预浓缩技术

样品浓缩技术是采用特殊的进样过程将大 体积的样品溶液中的痕量被测物浓缩后进 行分离，从而提高检测灵敏度的一种技术。
等速电泳 电堆积 场放大进样 色谱预浓缩 pH梯度

六、CE的优缺点
优点：
A. CE的分析时间通常不超过30min，比HPLC速度快； B. 柱效要比HPLC高得多； C. 毛细管电泳多采用空管毛细管，容易清洗，可减
二、基本原理

电渗是CE中推动流体前进的驱动力，它使 但在HPLC中，采用的压力驱动方式 整个流体像一个塞子一样以均匀的速度向 使柱中流体呈抛物线型，其中心处速 前运动，使整个流型呈近似扁平型的“塞 式流” ，它使溶质区带在毛细管内原则上 度是平均速度的两倍，导致溶质区带 不会扩张。 本身扩张，引起柱效使其分离效率不 如CE。