登革热病例的标本采集和实验室检测共18页文档
登革热诊断与实验室检测
特异性
检测时机
登革热不同诊断方法的可操作性和可信性
直接检测
可操作性
间接检测
病毒分离 核酸检测 NS1检测
可信性
IgM检测
IgG检测
登革病毒结构
细胞间病毒(未成熟)
细胞外病毒(成熟)
包膜糖蛋白
前M
(双体) 基质蛋白
核衣壳蛋白 (C蛋白)
登革病毒基因组结构
结构蛋白
非结构蛋白
登革病毒分离
细胞
昆虫细胞: C6/36、AP61 哺乳动物细胞: Vero、BHK21
YF PRNT 80% 减少 DV抗体用捕获法化学发光
接种17D疫苗后黄热和登革抗体
登革病毒感染后的黄热和登革抗体
检测登革病毒IgM抗体的试剂比较
真核rEIII蛋白MacELISA法检测早期登革病人血清
OD Value
3.5
dengue virus patients sera
3.0
hantan virus patients sera
登革分型实时PCR
登革抗体检测方法
检测IgM MacELISA、免疫层析(ICT)
检测IgG 间接法ELISA、GacELISA、IFA、 免疫层析(ICT)
中和试验 特异性高，可以用于分型
登革病人血清和乙脑交叉反应
乙脑、黄热和登革热的抗体交叉反应
登革病人血清和乙脑交叉反应
黄热病毒中和抗体和登革病毒抗体
NS1为50kD的糖蛋白 以300kD的六聚体形式分泌到血液中
DHF患者血清中NS1明显升高 激活补体 血管内皮细胞功能不全 血管通透性增加
NS1抗原特点及其应用
一、分泌性表达，易于检测 二、出现早，发病或发病前即可检出 三、浓度高，可达50 ug/ml 四、持续时间长，初次感染可持续9-12天 五、大量临床应用验证 六、NS1抗体可能用于血清分型 七、再次感染不易检测，在发病5-7天后很少能检出 八、高浓度NS1患者发病较重 九、可检测蚊子中的NS1抗原，用于监测
登革热实验室检测指南.doc
附件2登革热实验室检测指南一、目的（一）及时发现、诊断病例。
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。
二、检测对象（一）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008）。
（二）伊蚊成蚊和幼虫。
三、样本采集、保存和运输（一）临床标本采集用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1，附表1）。
1.登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液标本5mL。
2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20只。
（三）标本保存、运送标本应-70℃以下保存，血液标本可-20℃以下保存，但不超过1周。
标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，样本运输应遵守国家相关生物安全规定。
四、检测内容（一）实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1。
（二）复核检测1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
4.实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行IgM、IgG 抗体和/或中和抗体检测。
登革热实验室检测指南
登革热实验室检测指南一、目的（-）及时发现、诊断病例。
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。
二、检测对象（-）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008） o（二）伊蚊成蚊和幼虫。
三、样本采集、保存和运输（-）临床标本采集用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1,附表1） o1.登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液标本5mLo2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20 Ro （三）标本保存、运送标本应-70°C以下保存，血液标本可-20°C以下保存，但不超过1周。
标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，样本运输应遵守国家相关生物安全规定。
四、检测内容（-）实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1。
（二）复核检测1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
登革热实验室检测指南
附件2登革热实验室检测指南一、目的（一）及时发现、诊断病例。
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。
二、检测对象（一）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008）。
（二）伊蚊成蚊和幼虫。
三、样本采集、保存和运输（一）临床标本采集用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1，附表1）。
1.登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液标本5mL。
2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20只。
（三）标本保存、运送标本应-70℃以下保存，血液标本可-20℃以下保存，但不超过1周。
标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，样本运输应遵守国家相关生物安全规定。
四、检测内容（一）实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1。
（二）复核检测1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
4.实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行IgM、IgG 抗体和/或中和抗体检测。
登革热检测方法
附件1：免疫荧光法（IFA）检测IgG抗体试验材料：（1）DV1～4型抗原片：DV标准毒株感染C6/36或BHK21细胞制备，低温干燥保存；（2）对照：登革热患者恢复期血清（阳性对照），非登革热患者血清阴性对照）；（3）羊抗人（或兔抗人）IgG荧光素标记抗体；（4）常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文思兰等；（5）荧光显微镜。
检测步骤：（1）用pH7.4，0.02mol/LPBS稀释待检血清，从1：20开始做4倍连续稀释至需要的稀释度。
（2）取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，冷风吹干。
（3）用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟（每次试验设阳、阴性对照）。
（4）用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，冷风吹干。
（5）用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。
（6）荧光显微镜观察结果。
结果判断：细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。
根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4个“＋”。
检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（＞“＋”）最高血清稀释度的倒数表示。
意义：阳性结果，表明曾受到DV感染，＞1：80有诊断参考意义；恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。
附件2：酶联免疫吸附试验（ELISA）检测单份和/或双份血清IgG抗体试验材料：（1）抗原：阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。
阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。
（2）辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；（3）缓冲液：包被液：pH9.6碳酸缓冲液；稀释液：pH7.4PBS（含5%脱脂奶）洗涤液：pH7.4PBS－T（0.05％吐温－20）；（4）显色液：A/B液（5）终止液：4NH2SO4（6）酶标板、酶标仪。
样本的采集、保存及运送
结果判读 原发性登革热的特点是在感染发作后 3-
5 天可检测到 IgM 抗体。继发性感染的特点是最
和
早可于疾病发作后 第 3 天检测到特异性 IgG 抗体
升高。但是，急性继发性诊断的峰值检测窗口是
疾病发作后 6-15 天。
抗
应该结合 IgG 和 IgM 测试线的结果来判读。该试
体
验不是用于单独的 IgG 或 IgM 测试线分析，单独
三 取5微升(吸管第一刻度处)全血标本，垂直 加入金标卡上”加样孔A”内。
四 然后再撕开装有裂解液的铝箔袋，取出袋 内的裂解液管和吸管；并随即用该吸管吸取裂 解液，在“样品孔B”上垂直滴加4滴裂解液。
五 在十五分钟内判读结果。注意：必须在15
分钟内判读结果，如超时判断，结果无效
六 请遵循相关法规，妥善处理样本及废弃材 料。
环状滋养体的数量与构造，有助于疟原虫种 类的鉴别。恶性疟原虫的配子体很易识别， 但在初发时，一般需要在发作八日后才能在 末稍血液中出现，应当注意。
一 撕开铝箔袋，取出袋内金标卡。注意：不要 让袋内材料暴露于高温高湿环境，撕开铝箔袋 后尽快使用。
二 将金标卡平放在台面上；并将病人名字和编 号写在标签上。
（二）伊蚊成蚊和幼虫。
（一）临床标本采集
用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离 血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻 存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场 实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附 件1，附表1）。
1.登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液 标本至少5mL。
2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴 性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1 天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距 第一份血样采集日期间隔在7天以上。
登革热病例报告和标本送检
4、组织做好医务人员的培训和个人防护。
第五页，课件共25页
医疗机构职责
5、采集标本，送指定的登革热检测实验室检验。
6、加强感染性疾病科的建设与管理，做好发热病 人预检分诊工作。
7、组织好防治知识宣传教育。
8、定点收治医院做好药物储备和医务人员合理调 配等组织工作。
病例病报例告报及告病情报告
• 病例报告
登革热为国家乙类管理传染病,必须按照国家传染病 报告要求及时上报疫情
医疗卫生机构，发现疑似、临床诊断及实验室确诊登 革热病例，24小时内网络直报
• 病情报告
重症、重点和有特殊要求病例的病情报告。
第十三页，课件共25页
本院登病革例热报病告例报告要求
• 疑似病例 符合登革热临床表现，有流行病学史（发病前15 天内到过登革热流行区，或居住地有登革热病例 发生），或有白细胞和血小板减少者。 发现疑似病例即可随时通过院内网络上报，同时 送检血标本，由预防保健科根据实验室检查结果 转报国家疫情网。
呼吸二区成立登革热救治小组，由专门联络员每日上报患者病情。重症、重点和有特殊要求的病例及 时报告医务部预防保健科，及时转诊至重点收治医院
登革热病例防蚊隔离期限从发病日起不少于5天，并且热退24小时以上可解除
转回原病区或出院
第二十五页，课件共25页
登革热病例报告和标本送检
第一页，课件共25页
第二页，课件共25页
及及早进早行预预防防控控制制
当登革热疫情发生时，要控制登革热的蔓 延，必须在疑似病例出现后立即进行预防 控制工作，如错失时机或预防控制工作不 到位，导致二代病例发生，感染人数将会 呈现几何级增加，造成疫情迅速蔓延。
第三页，课件共25页
登革热检测方法
附件1：免疫荧光法（IFA）检测IgG抗体 试验材料： （1）DV1～4型抗原片：DV标准毒株感染C6/36或BHK21细胞制备，低温干燥保存； （2）对照：登革热患者恢复期血清（阳性对照），非登革热患者血清阴性对照）； （3）羊抗人（或兔抗人）IgG荧光素标记抗体； （4）常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文思兰等； （5）荧光显微镜。
检测步骤： （1）用pH7.4，0.02mol/LPBS稀释待检血清，从1：20开始做4倍连续稀释至需要的稀释度。
（2）取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，冷风吹干。
（3）用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟（每次试验设阳、阴性对照）。
（4）用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，冷风吹干。
（5）用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。
（6）荧光显微镜观察结果。
结果判断： 细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。
根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4个“＋”。
检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（＞“＋”）最高血清稀释度的倒数表示。
意义： 阳性结果，表明曾受到DV感染，＞1：80有诊断参考意义； 恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。
附件2：酶联免疫吸附试验（ELISA） 检测单份和/或双份血清IgG抗体 试验材料： （1）抗原： 阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。
阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。
（2）辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体； （3）缓冲液： 包被液：pH9.6碳酸缓冲液； 稀释液：pH7.4PBS（含5%脱脂奶） 洗涤液：pH7.4PBS－T（0.05％吐温－20）； （4）显色液：A/B液 （5）终止液：4NH2SO4 （6）酶标板、酶标仪。
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登革热病例的标本采集和实验室检测
41、俯仰终宇宙，不乐复何如。 42、夏日长抱饥，寒夜无被眠。 43、不戚戚于贫贱，不汲汲于富贵。 44、欲言无予和，挥杯劝孤影。 45、盛年不重来，一日难再晨。及时 当勉励 ，岁月 不待人 。
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