HPV-DNA标本处理的标准操作程序1
DNA制片过程
DNA制片过程制片过程1.固定（宫颈标本）医生用宫颈刷刷取标本后，将宫颈刷头取下放入固定液中，使取得的宫颈细胞标本得到及时的固定保存。
2.消化将固定液瓶放于振荡器上振荡半小时，直至粘液被完全消化，标本呈细颗粒状——细胞分散成细胞悬液止。
3.离心宫颈刷取物标本或痰标本消化好的标本液使其细胞均匀分布，另取一支7ml试管，倒入标本液4~5ml，放入离心机中以2500转/分转速离心4分钟。
从离心机中取出后，倒去上清夜。
根据沉淀的标本量加入适量固定液，再用一次性吸管反复抽吸使其混合均匀备用。
浆膜腔积液1）将标本先摇匀，将浆膜腔积液标本倒入一支50ml或15ml刻度离心管，放入离心机中以3000转/分转速离心5分钟。
2）从离心机中取出后，倒入上清液。
（或用一次性滴管吸除上清液，具体操作可视沉淀物性状而定）4.制片宫颈刷取物制片将转头置入离心涂片机（兰丁高科公司）中备好，吸取混匀的标本液加入转头孔中，以1500转/分的速度离心涂片4分钟，制成薄层细胞片1-2张。
细胞片经充分干燥后，经Feulgen-THionin染色，用DNA细胞自动检测分析仪扫描。
浆膜腔积液根据标本的性质，合理选择使用离心涂片机制片或者推片。
染色过程1）将制好的标本片干燥。
2）固定：将标本片置入无水乙醇中固定30分钟，回收无水乙醇。
3）B.S液固定60分钟，回收B.S液。
4）水洗3到5次，尽量控干水分。
5）酸化水解：5N HCL 25摄氏度酸解60分钟。
6）水洗3到5次。
7）DNA染液67分钟（25摄氏度）。
8）水洗6到8次。
9）用漂洗液漂洗3次，第1次1分钟、第2次3分钟、第3次4分钟。
10）水洗3到5次。
11）脱水：分别经95%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、无水乙醇各2分钟。
12）吹干、贴条形码，中性树胶封片。
人乳头瘤病毒(HPV)基因分型检测标准操作规程(PCR-反向斑点杂交法)
人乳头瘤病毒（HPV）基因分型检测标准操作规程1.目的：规范人乳头瘤病毒（HPV）反向点杂交（RDB）基因分型检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围: PCR实验室。
3.职责:3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献:4.1《中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒说明书》4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书5. 内容：5.1 检测方法：PCR-反向斑点杂交法。
5.2 实验原理：选取人乳头瘤病毒（HPV）基因组保守序列为扩增靶序列，设计通用引物和特异型别探针（包括16种中高危型和3种低危型HPV）,将RNA逆转录为cDNA后，利用生物素标记的通用引物对cDNA进行PCR 扩增，得到的产物与固定在膜上的特异型别探针按照碱基互补配对的原理杂交。
若PCR产物和探针完全配对，则膜条上相应探针位置捕获到标有生物素的PCR产物，并和亲和素–辣根过氧化物酶偶联，再与四甲基联苯胺（TMB）反应呈现较强的深蓝色，若与探针不完全配对，则经严格杂交和洗涤后膜条上相应探针位置不能捕获到标有生物素的PCR产物，结果无显色反应或显很淡的背景色。
5.3 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.3.1 标本类型：尿道分泌物、宫颈脱落细胞、疣体细胞等。
5.3.2 标本采集：5.3.2.1 道分泌物：在无菌条件下，用棉拭子伸入尿道内,旋转数周并停留片刻后取出。
5.3.2.2 宫颈脱落细胞:在无菌条件下，用宫颈刷伸入宫颈管内2cm,旋转数周并停留片刻后取出。
5.3.2.3 疣体细胞: 用无菌棉拭子在疣体部位刮取上皮细胞。
5.3.3 标本保存：采集的标本置于盛有1ml生理盐水的小试管中，2～8℃保存。
5.3.4 运送条件：标本长途运送时采用冰壶。
5.3.5 标本拒收标准：污染标本。
HPV-DNA标本处理的标准操作程序1
HPV-DNA标本处理的标准操作程序1一、目的：规范临床分子生物实验室对临床标本的处理，提高检测结果的准确率。
二、适用范围：人乳头状瘤病毒（HPV）基因微阵列分型检测试剂盒。
三、职责：由临床分子生物实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：2.1对于宫颈脱落细胞标本，先振荡混匀临床样本10秒，取800l临床样本加入样本管，14000rpm离心5分钟，去上清液（若收集到的有效细胞太少的话，可再次吸取取800l临床样本加入样本管，14000rpm离心5分钟，去上清液）；2.2对于男性标本（棉拭子），先加入1ml生理盐水，充分振荡洗脱细胞，倒出洗脱液，14000rpm离心5分钟，去上清液；2.3对于血液太多的临床标本，可将收集到的细胞用已灭菌的蒸馏水漂洗一次，再离心收集细胞。
3、加入400l溶液Ⅰ(如果出现沉淀应在45℃水浴中预热)，将收集到的细胞振荡混匀，在100℃煮沸15分钟。
4、从沸水中取出样本管，点动离心，开盖，加入400l溶液Ⅱ，混匀后，室温下放置2分钟后，14000rpm离心5分钟，将上清液倒入废液缸，14000rpm离心1分钟，用200μl移液器，轻轻将剩余的上清液吸尽，枪头切勿碰到离心沉淀方向的管壁，以免将DNA吸掉。
5、开盖静置至少2分钟，加入60l溶液Ⅲ充分溶解，静置10分钟。
14000rpm离心1分钟取1l样品做PCR检测,或者贮存-20℃冰箱中备用。
lu08.1液转入HPV样本处理流程图此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题，则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的的人员讨论，以决定是否需要变更本程序。
振荡取制定者吸审核者批准者年月日年月日年月日。
临床标本的采集、验收和处理的标准操作程序
别、年龄、联号、科别、住院号、病区床号、检验项目、标本类型、申请医师、申请日期等项目是否填写完整，认真查对检验申请单号与标本所标记的联号是否一致，做好记录。
对各类样本的查对不符合要求的样本一律退回，并在拒收标本记录本上详细记录。
5.2.2 分类验证：5.2.2.1 一般内容：进入实验室的样本在进行编号、离心前，工作人员应再次认真查对姓名、联号、住院号、病区床号、检验项目等。
对不符合要求者应作记录，并及时通知采样科室，正确及时地补采样，以免延误病人的检测结果报告。
对书写不清楚的申请单，工作人员要及时与病房联系，明确受检者姓名，住院号，性别，年龄，病区床号和检验项目等。
5.2.2.2 按检测项目验证标本：5.2.2.2.1HPV：所需标本类型为宫颈脱落细胞或男性尿生殖道分泌物，注意将宫颈口过多的分泌物去除干净。
5.2.2.2.2耳聋易感基因：所需标本类型为未溶血的血清或血浆，注意血浆标本所用的抗凝剂，一般用EDTA-K2或枸橼酸钠，不可使用肝素。
标本为全血。
5.3 符合拒收条件的不合格病人标本的范围：5.3.1宫颈分泌物（粘液）过多的标本。
5.3.2未正确使用抗凝剂的标本。
5.3.3严重溶血及静脉营养时严重脂血并影响检测结果的血标本。
5.3.4血量不足检验需要量的标本。
5.3.5经查对标本的病人姓名、年龄、性别、及检验号联等不相符者。
5.3.6采集的标本将严重影响检验结果者。
5.4 拒收程序：5.4.1对拒收的不合格标本应登记在不合格标本处置记录本上。
5.4.2 填写不合格标本处置单，并随同申请单送回送检科室。
5.4.3必须电话告之相关科室医生、护士或门诊抽血室。
5.5 各种标本的处理严格按照相关检验项目标准操作程序进行。
HPV SOP - 不带提取
人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒（荧光PCR 法）标准操作流程一、目的：规范实验室操作，正确使用PCR扩增仪进行HPV-DNA扩增分析，以保证实验结果的准确性。
二、适用范围：人乳头状瘤病毒(HPV)基因分型检测试剂盒在扩增仪上进行扩增以及分析。
三、职责：由临床分子生物实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：【检验方法】1. 试剂准备（试剂准备区）a) 从-20℃取出试剂盒，将各试剂融化混匀并短暂离心后备用。
计算需要进行的反应份数n （n=待测样本数+空白对照1份+阳性对照1份）。
b) 取出8个离心管分别标记1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#和8#，分别加入n×10μl 核酸扩增反应液，然后对应每个编号离心管分别加入n×8μl A反应液（1#）、n×8μl B反应液（2#）、n×8μl C反应液（3#）、n×8μl D反应液（4#）、n×8μl E反应液（5#）、n×8μl F反应液（6#）、n×8μl G反应液（7#）、n×8μl H反应液（8#）。
c) 混匀并短暂离心后，依次分装至对应编号PCR八联管中，每管18μl，总共分装n排PCR 反应八联管，1排PCR八联管为1人份。
2. 加样（1）小心打开PCR八联管盖，每份待测样本核酸溶液、空白对照按照2μl/管依次加入对应编号含有A-H反应体系的PCR八联管中，1排PCR八联管为1人份，阳性对照（A-H组）同样按照2μl/管分别加入对应的A-H反应体系的PCR八联管中，总体积为20μl/管。
（2）盖紧PCR八联管盖，低速短暂离心。
3. PCR扩增检测（核酸扩增区）3.1 将反应管放入荧光PCR 扩增仪进行扩增检测。
4. 结果分析4.1 杭州博日Linegene 9600荧光定量PCR仪：反应结束保存结果，根据分析后图像调节基线的起始循环、终止循环（可以根据实际情况自行调整，起始循环可以在3~15、终止循环可设在5~20，调整空白对照的扩增曲线平直或低于阈值线；也可由仪器进行自动判读，起始循环为3、终止循环为15），点击确定自动获得分析结果，在同一界面的显示区察看结果。
HPV原位杂交检测步骤
HPV原位杂交检测步骤
步骤1：搜集样本
首先，需要从病人体内采集合适的样本。
常用的样本包括宫颈细胞刮片、尿液、唾液、阴道液等，取样前需确保病人不要进行洗涤阴道、尿生
理清洗等活动。
步骤2：样本处理
将采集到的样本进行处理，以获取细胞纤毛。
对于宫颈细胞刮片样本，使用生理盐水或细胞培养液等缓冲溶液进行细胞纤毛的脱落和悬浮。
步骤3：固定细胞
将样本中的细胞固定在载玻片上，通常使用95%的乙醇或乙醚固定细胞。
步骤4：去除细胞膜
通过去除细胞膜，使得封闭DNA在细胞核内。
步骤5：杂交反应
将HPVDNA探针与上述固定的样本进行杂交反应。
该探针通常使用标
记有荧光物质的HPVDNA特异性引物，使其与样本中的HPVDNA发生特异性
的结合。
步骤6：洗涤
对杂交后的载玻片进行洗涤，去除探针杂交过程中的非特异性结合。
步骤7：显微镜观察
使用显微镜观察载玻片上的细胞，看是否有荧光标记。
在有荧光标记的细胞中，说明有HPV感染。
步骤8：结果分析
根据显微镜观察的结果，进行结果的分析和判读。
根据荧光标记的程度和分布情况，可以对HPV感染的类型进行初步的判定。
通常，分析人员需要有经验才能准确判断。
步骤9：结果报告
根据分析结果，写出报告。
报告中应包括所检测的HPV类型、感染程度以及可能的临床推断等信息。
步骤10：质控。
HPV基因分型测定标准操作规程
HPV基因分型测定标准操作规程操作规程文件号：免疫-第4版共6页规程编写者：叶瑾生效日期：2008年08月11日起批准日期：2008年08月06日文件正本保存于：主任办公室保管人：奚经巧文件副本保存于：免疫室保管人：叶瑾检验科主任：(签名)项目主管：(签名)文件执行者签名：1 检验申请1.1具有资格的临床医生根据需要在His医生工作站提交电子检验申请单1.2组合项目申请：HPV基因分型检测。
1.3项目所在菜单：His医生工作站上的“妇科检验”。
2 标本采集和处理2.1 病人的准备2.1.1 月经正常妇女，在月经来潮后10～18天为最佳检查时间；2.1.2 检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物；2.1.3 检查前48小时最好不要行性生活；2.1.4 检查前不进行醋酸或碘液涂抹；2.2 标本采集2.2.1 按医生指示，仰卧于检查床上；2.2.2由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈。
然后使用专用的HPV采样刷置于宫颈口采集标本；（最好在取样前先用棉签擦去宫颈分泌物）2.2.3将专用宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转5圈；2.2.4慢慢取出宫颈刷，将其放入标有病人编号的取样管中，取样管内已加有专用细胞保存液，折断其刷头入管中，拧紧瓶盖。
2.2.5 标本采集后，在电脑终端检验标本采集确认，电脑自动产生标本采集时间。
2.2.6 标本采集及确认后，临床标本要及时运送至检验科。
检验科接收人员Lis接收电脑终端刷取标本条形码接收标本，并记录状态。
对不合格标本应予拒收。
2.2.7 下列标本为不合格标本：1)标本无标识（条形码）；2)无法辨认条形码号；3)标识涂改；4)未采用装有细胞保存液专用管的；5)采样后未及时送检并且未能置4℃冰箱保存的；6)标本采集过程中混入红细胞或分泌物过多的标本；7)标本试管破裂等；2.3 标本采集的注意事项2.3.1 避免采集分泌物过多的标本，最好在取样前先用棉签擦去宫颈分泌物；2.3.2 尽量避免血性样本，若患者宫颈口充血出血，应建议改日采样。
PCR HPVDNA荧光定量检测标准操作程序.pptx
2. 适用范围： 1. 适用于进行高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的检验人员。 2. 适合仪器：LightCycler480 型核酸扩增荧光检测仪 3. 方法原理：采用 PCR 方法结合荧光探针的扩增技术 4. 样品要求：宫颈脱落细胞 3. 职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。 4.试剂来源：潮州凯普生物化学有限公司高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测试剂 盒。
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5. 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。 6.将待反应的 PCR 反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在 程序中设定好样孔位置。 7. 按仪器操作规程开始循环。
2. 样本处理(在样本处理区进行)
1. 取宫颈脱落细胞样本 0. 5ml~1ml(如果细胞数量少可以加大体积到 2m1)
2.
13000 转/分钟离心 1 分钟
3. 弃上清，加入 0.5m1 细胞保存液重悬细胞
4.
13000 转/分钟离心 1 分钟，尽量弃干净上清
5. 每样本加入 50ul 细胞裂解液，充分振荡重悬细胞，煮沸 10 分钟。
5. 质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒 6. 标准操作： 1. 试剂准备（在试剂准备区操作） 1.将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（临用前取出，用后立即放回冰箱， 反 复冻融不可超过三次），取出 PCR MIX,室温下避光解冻，上下颠倒混匀后，8000 转/分钟 10s 从试剂盒中取出 DVA 聚合酶，8000 转/分钟 lOs。 2.根据当次实验标本量，取出相应试剂（1 管=17.5ulPCR MIX +0.5ul DVA 聚 合酶）总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为 n (n=标本数+1 空白管对照+1 管阳性对照) 取 PCR 反应管转移至样本制备区。
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HPV-DNA标本处理的标准操作程序
一、目的：
规范临床分子生物实验室对临床标本的处理，提高检测结果的准确率。
二、适用范围：
人乳头状瘤病毒（HPV）基因微阵列分型检测试剂盒。
三、职责：
由临床分子生物实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：
1、将样本及阴性对照品置室温解冻，按习惯将标本编号，按相应数量取出样本管，对应编号。
2、有效细胞的收集：
2.1 对于宫颈脱落细胞标本，先振荡混匀临床样本10秒，取800μl临床样本加入样本管，
14000rpm离心5分钟，去上清液（若收集到的有效细胞太少的话，可再次吸取取800μl临床样
本加入样本管，14000rpm离心5分钟，去上清液）；
2.2 对于男性标本（棉拭子），先加入1ml生理盐水，充分振荡洗脱细胞，倒出洗脱液，14000rpm
离心5分钟，去上清液；
2.3 对于血液太多的临床标本，可将收集到的细胞用已灭菌的蒸馏水漂洗一次，再离心收集
细胞。
3、加入400μl溶液Ⅰ(如果出现沉淀应在45 ℃水浴中预热)，将收集到的细胞振荡混匀，在
100 ℃煮沸15分钟。
4、从沸水中取出样本管，点动离心，开盖，加入400μl溶液Ⅱ，混匀后，室温下放置2分钟后，
14000 rpm离心5分钟，将上清液倒入废液缸，14000rpm离心1分钟，用200μl移液器，轻
轻将剩余的上清液吸尽，枪头切勿碰到离心沉淀方向的管壁，以免将DNA吸掉。
5、开盖静置至少2分钟，加入60μl溶液Ⅲ充分溶解，静置10分钟。
14000rpm离心1分钟取
1μl样品做PCR检测, 或者贮存-20℃冰箱中备用。
HPV样本处理流程图
此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题，则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的的人员讨论，以决定是否需要变更本程序。