成年大鼠心肌细胞分离方法
大鼠成体心肌细胞的分离和培养
大鼠成体心肌细胞的分离和培养王亭忠;席雨涛;吴格如;马爱群【期刊名称】《第四军医大学学报》【年(卷),期】2005(26)17【摘要】目的: 探索稳定的大鼠成体心肌细胞的分离和培养方法. 方法: 应用主动脉逆行生物酶(5 g/L胰蛋白酶及1 g/L胶原酶)灌流法分离大鼠成体心肌细胞,免疫荧光染色法鉴定分离的心肌细胞,比较有无血清培养对心肌细胞的影响. 结果: 心肌细胞的存活率为95%以上;存活细胞呈杆状,形态完整,长宽比约为4～6∶ 1;无血清培养心肌细胞只能存活1 wk,形态不发生改变;而加血清培养心肌细胞可存活2 wk以上,但超微结构发生了改变,且不同血清浓度对成纤维细胞生长具有不同的作用. 结论: 主动脉逆行生物酶(胶原酶和蛋白酶)灌流法是比较理想的心肌细胞分离方法;血清对成体心肌细胞的培养起着重要作用.【总页数】3页(P1544-1546)【作者】王亭忠;席雨涛;吴格如;马爱群【作者单位】西安交通大学第一医院心血管内科,教育部环境与疾病相关基因重点实验室,陕西,西安,710061;西安交通大学第一医院心血管内科,教育部环境与疾病相关基因重点实验室,陕西,西安,710061;西安交通大学第一医院心血管内科,教育部环境与疾病相关基因重点实验室,陕西,西安,710061;西安交通大学第一医院心血管内科,教育部环境与疾病相关基因重点实验室,陕西,西安,710061【正文语种】中文【中图分类】R329.28【相关文献】1.组织块法体外分离培养大鼠脊髓成体神经干细胞 [J], 张辉;张硕;江正;余涛;钟林;尹宗生2.成体大鼠的骨髓间充质干细胞分离和体外培养的初步研究 [J], 何少健;陈维平;邝晓聪3.大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离培养及血管形成体系的建立 [J], 崔丹;王哲;杨向红4.两种分离方法培养成体大鼠骨髓间充质干细胞的比较分析 [J], 高建鹏;龙琼先;张志波;侯宗柳;王辉;余小鸣5.大鼠成体肝卵圆细胞分离培养及诱导分化的初步研究 [J], 金世龙;刘宝华;刘宏鸣;杨俊涛;顾红光;申海军;肖静因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。
因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。
建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。
常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。
3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。
消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。
溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。
由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。
5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。
成年大鼠心肌细胞分离方法
心 肌细 胞不仅 保存 了心 肌结构 和功能上 的某些 特 细胞功 能时就 显示 出其 局 限性 ，我们 根 据 文献 的方 法 点 ，同时去 除 了体 内各 种 限制 因素 的影响 ，作 为实验 工 加 以改进 ，探讨 三种 简单 、快 捷 的成 年 大 鼠心肌 细胞 分 具 ，具 有简 便 、精 确 、重 复性好 等优 点 ，已成 为研究 心肌 离方 法 ，为研 究心肌 细 胞 生理 和 病理 特 性 提 供 了有 用 结构 、代谢 、功 能 、病 理 生 理及 其 机 制 的重 要 工具 。 目 的实 验模 型。 前 乳 鼠心 肌 细胞 的分离 方 法 比较 成 熟 ，但是 由于 未成 １ 材料 与方法 熟 心肌 细胞 和成熟 心肌 细胞 的差异性 使得大 量来 自于 １．１ 酶消化法 未 成熟 心肌 细胞 实验 的 结论 难 以 用 于成 熟心 肌 细胞 。 １。１。１ 动物 健 康雄 性 Ｗｉｓｔｅｒ大 鼠 （２００￣３００ｇ），军 特 别 是近年 来 ，随 着心肌 细胞 电生理 和分 子 生物学 研 事 医学 科学卫 生与环 境 医学 研究 所提供 。 究 的兴起 ，成熟 心肌 细 胞越 来 越 多 的应 用 于心 血 管病 １．１．２ 试 剂 ０．１％胰 蛋 白酶（ＧＩＢＣＯ），０．１ 胶 原 理 生理 的研究 。 目前 分离 成熟 心肌细 胞应用较 多 的是 酶 Ｉ（ＧＩＢＣＯ）（两种 酶 均用 Ｄ－Ｈａｎｋ’Ｓ液 配制 成 ０．１ Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ灌 流 胶 原 酶 消 化 法 ，但 是 它 消 化 下 来 的 的液 体 ，经正 压过 滤除 菌 ，ｐＨ７。２，一 ２Ｏ℃保 存 ）， 是 整个 心脏 的心 肌细 胞 ，如 果我 们 只 想 了解 部分 心 肌 Ｉ）＿Ｈａｎｋ’Ｓ液 （ｇ／Ｌ）（ＮａＣ１ ８．０，ＫＣ１ ０．４，Ｎａ２ ＨＰＯ４ ０．７，
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的研究对象，分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是进行相关研究的基础工作。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养方法。
1. 大鼠心肌细胞的分离方法：a. 准备消化液：将含有0.1%胰酶和0.05%胰蛋白酶的耗氧培养液(如DMEM/F12)预先加热至37℃。
b. 杀死大鼠：快速杀死大鼠，并立即进行心肌细胞的分离。
c. 开胸取心：通过剖开胸腔，将心脏暴露，并迅速取出。
d. 剪开心脏：用剪刀切开心脏的心室部分，将其放入预先加热的消化液中。
e. 贴壁处理：将心室组织液搅拌均匀，并放置在37℃培养箱中酶解。
每隔10分钟，用吸球轻轻吸取上清液，反复操作3-4次。
2. 大鼠心肌细胞的鉴定方法：a. 形态学观察：用显微镜观察分离得到的心肌细胞的形态，心肌细胞呈长条状，具有明显的纵纹和横纹。
b. 钙离子荧光染色：使用荧光染料如Fluo-4 AM来标记细胞内的钙离子，并观察细胞内钙离子的动态变化。
c. 免疫荧光染色：使用心肌细胞特异性标记物如肌球蛋白进行免疫荧光染色，观察标记物的染色情况。
3. 大鼠心肌细胞的培养方法：a. 培养基准备：将DMEM/F12培养液加入10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素溶液和1%胎牛血清补充物。
b. 细胞接种：将分离得到的心肌细胞加入培养基中，浓度为1 * 10^5 cells/ml，并将细胞悬浮液加入培养皿中。
c. 培养条件：将培养皿放入恒温培养箱中，温度设定为37℃，CO2浓度设定为5%。
d. 培养液更换：一般情况下，每2-3天更换一次培养基，同时可添加适量的生长因子和激素。
e. 心肌细胞传代：当心肌细胞达到80-90%的密度时，可以进行细胞传代。
传代方法与培养方法相似，注意细胞的保持适当的密度。
大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是大鼠心肌细胞研究的关键步骤。
通过合适的操作和条件，可以获得纯度较高的心肌细胞，并进行相关研究。
需要注意的是，心肌细胞的分离和培养过程需要在无菌条件下进行，以避免细菌和其他微生物的污染。
成年大鼠心肌细胞分离方法.
成年大鼠心肌细胞分离方法【摘要】目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。
方法: 分别应用酶消化法（0. 1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。
光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。
结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。
结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。
【关键词】大鼠; 心肌细胞; 细胞分离【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(0.1% trypsin and 0.1% collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedurecryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rod shaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult ratventricular cardiomyocytes can be isolated well with the above methods.【KEY WORDS】 Rat; Cardiomyocytes; Cell Separation心肌细胞不仅保存了心肌结构和功能上的某些特点,同时去除了体内各种限制因素的影响,作为实验工具,具有简便、精确、重复性好等优点,已成为研究心肌结构、代谢、功能、病理生理及其机制的重要工具。
成年大鼠心肌细胞分离方法
成年大鼠心肌细胞分离方法
李淑娟;娄建石
【期刊名称】《神经药理学报》
【年(卷),期】2007(024)001
【摘要】目的:探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法.方法:分别应用酶消化法(0.1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化)、程序冷冻后机械分离法(4℃30min,-20℃30min,-80℃30min,-196℃冻存)、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液.光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞.结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰.结论:三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离.
【总页数】4页(P6-9)
【作者】李淑娟;娄建石
【作者单位】河北北方学院药理教研室,河北,张家口,075000;天津医科大学药理教研室,天津,300070
【正文语种】中文
【中图分类】R329.33
【相关文献】
1.成年大鼠心肌细胞分离和培养相关研究进展 [J], 陈齐;张英;刘庆;
2.成年大鼠心肌细胞分离方法的改良 [J], 廖华;糜涛;涂志业;陈莉莉;郭小梅
3.Ⅱ型胶原酶加压灌流提高成年大鼠心肌细胞分离效率 [J], 李德;唐兵;杨大春;马
双陶;杨永健
4.成年大鼠心肌细胞分离培养及兴奋-收缩耦联表征 [J], 孙敏;于海奕;张幼怡;吕志珍;高炜;李子健
5.成年SD大鼠心肌细胞分离及其胞内钙离子动态变化测定 [J], 李超彦;肖剑锋;沈建新;王海燕;陈耀文
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成年大鼠心肌细胞分离培养及兴奋-收缩耦联表征
成年大鼠心肌细胞分离培养及兴奋-收缩耦联表征孙敏;于海奕;张幼怡;吕志珍;高炜;李子健【摘要】Objective To compare two separation medium of isolation of adult rat cardiomyocytes , and to observe the characteristics of excitation-contraction coupling of cardiomyocytes .Methods The isolated adult rat heart was hanged on to the Langendorff apparatus for aortic counter-current perfusion and collagenase digestion using two different separation medium.The single cardiomyocytes were cultured and infected with adenovirus . The morphological features of cardiomyocytes were observed with microscope and fluorescent microscope . The shortening-re-lengthening features of sarcomere and the intake-discharge features of calcium were simultaneously recorded by IonOptix equipment .Results 70%rod-shaped with clear-striation adult rat cardiomyocytes could be obtained with the stated two separation medium and cultured in serum-free medium for more than 7 days.GFP could express more than 7 days when the cardiomyocytes were infected with adenovirus .Cardiomyocytes obtained by the first separation medium could not contract with the electrical stimulation, while cardiomyoctyes obtained by the second separation medium could be used for the detection of excitation -contraction coupling .The shortening fraction of sarcomere was11.61%±2.15% and the relaxing time was ( 0.177 ± 0.031) s.The amplitude of calcium transient was 30.79% ±9.74 % and the decaying time of calcium transient was (0.300 ±0.074) s.Conclusion With the stated two separationmedium , adult rat cardiomyocytes can be well isolated , cultured and infected with adenovirus .The second separation medium can be used for the detection of excitation-contraction coupling characteristics .%目的：比较两种细胞分离液分离成年大鼠心肌细胞，进一步表征成年大鼠心室肌细胞兴奋-收缩耦联。
成年大鼠心肌细胞的急性分离方法
成年大鼠心肌细胞的急性分离方法韦丽兰;莫书荣【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2012(016)011【摘要】BACKGROUND: To obtain high survival rate and good activity of the normal single myocardial cells is the basis of myocardialelectrophysiology. It is important to find an experimental method which is close to the normal myocardial cells in morphology,function and structure.OBJECTIVE: To discuss the influence factors during emergent isolation of myocardial cells by using enzymatic method in ratsand to build an emergent isolation method for stable obtaining myocardial cells to provide cells for myocardial electrophysiologyand molecular biology.METHODS: The heart of Sprague-Dawley adult rats was rapidly excised after cervical dislocated and mounted on a Langendorffapparatus for aortic counter-current perfusion. It was perfused retrograde via the aorta for 5 minutes with calcium-free tyrode, andthen perfused with collagenase dissolved in nominally calcium-free tyrode for 20 minutes. Ultimately calcium solution wasperfused for 3 minutes. Then the rat ventricular cells were stored in HK solution.RESULTS AND CONCLUSION: Viability of freshly isolated myocardial cells which were rod-shaped with clear-striation was60%-80%. It is shown that to adjust and control all the factors in the emergent isolation can ensure thequantity and quality ofmyocardial cells.%背景:获得存活率高、活性好的正常单个心肌细胞是心肌电生理研究的基础,寻求一种可以获得在形态、功能和结构上接近于正常心肌细胞的实验方法具有重要意义.目的:探讨酶解法急性分离大鼠心肌细胞过程中的各影响因素,建立一种可以稳定获取高活性心肌细胞的急性分离方法,为心肌细胞电生理研究和分子生物学研究提供细胞.方法:SD 大鼠颈椎脱臼,迅速开胸取心脏,将心脏悬挂于Langendorff 装置上进行主动脉逆流灌流.先用无钙台式液灌流5 min,然后换上酶液灌流消化20 min,最后用终止液灌流3 min 终止反应,将细胞置于HK 液中保存.结果与结论:可获得60%~80%的横纹清晰,透亮的长杆状的心肌细胞.说明调节和控制细胞分离过程中的各影响因素可以保证分离的心肌细胞的数量和质量.【总页数】4页(P1969-1972)【作者】韦丽兰;莫书荣【作者单位】广西医科大学生理教研室,广西壮族自治区,南宁市,530021;广西医科大学生理教研室,广西壮族自治区,南宁市,530021【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.成年大鼠心肌细胞分离方法 [J], 李淑娟;娄建石2.急性分离的成年大鼠心肌细胞在免疫荧光染色中的应用 [J], 陈莹;龚惠;朱依纯3.成年大鼠心肌细胞的急性分离方法 [J], 韦丽兰;莫书荣4.成年大鼠心肌细胞分离方法的改良 [J], 廖华;糜涛;涂志业;陈莉莉;郭小梅5.成年大鼠心肌细胞的急性分离方法探讨 [J], 熊寿贵;余更生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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成年大鼠心肌细胞分离方法
【摘要】目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。
方法: 分别应用酶消化法（0. 1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。
光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。
结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。
结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。
【关键词】大鼠; 心肌细胞; 细胞分离
【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(0.1% trypsin and 0.1% collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedure cryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rod shaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult rat ventricular cardiomyocytes can be
isolated well with the above methods.
【KEY WORDS】 Rat; Cardiomyocytes; Cell Separation
心肌细胞不仅保存了心肌结构和功能上的某些特点,同时去除了体内各种限制因素的影响,作为实验工具,具有简便、精确、重复性好等优点,已成为研究心肌结构、代谢、功能、病理生理及其机制的重要工具。
目前乳鼠心肌细胞的分离方法比较成熟，但是由于未成熟心肌细胞和成熟心肌细胞的差异性使得大量来自于未成熟心肌细胞实验的结论难以用于成熟心肌细胞。
特别是近年来, 随着心肌细胞电生理和分子生物学研究的兴起，成熟心肌细胞越来越多的应用于心血管病理生理的研究。
目前分离成熟心肌细胞应用较多的是Langendorff 灌流胶原酶消化法，但是它消化下来的是整个心脏的心肌细胞，如果我们只想了解部分心肌细胞功能时就显示出其局限性，我们根据文献的方法加以改进，探讨三种简单、快捷的成年大鼠心肌细胞分离方法，为研究心肌细胞生理和病理特性提供了有用的实验模型。
1 材料与方法
1.1 酶消化法
1.1.1 动物健康雄性Wister大鼠（200～300g），军事医学科学卫生与环境医学研究所提供。
1.1.2 试剂 0. 1%胰蛋白酶（GIBCO）, 0. 1%胶原酶Ⅰ(GIBCO) (两种酶均用D Hank s 液配制成0. 1 %的液体,经正压过滤除菌,pH7. 2, - 20 ℃保存)，D Hank s 液（g/L）（NaCl 8.0, KCl 0.4,Na2HPO4 0.7，H2O 0.06, KH2PO4 0.06,NaHCO3 0.35）,用双蒸去离子水配制，pH7.2,
高压蒸气灭菌,4 ℃保存。
培养液[10%DMEM(GIBCO) 干粉,由双蒸去离子水配置液体]正压过滤除菌,pH7. 2～7. 4, - 20 ℃保存。
1.1.3 主要器材光学显微镜(Olympus),超净工作台(苏州净化设备有限公司),FA21045N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)
1.1.4 心肌细胞分离
大鼠用25%乌拉坦（1.0g/kg）腹腔注射麻醉，取适量待测心肌组织（下列操作均除水浴和离心外均在超净工作台内进行）立即放入预冷的D Hank s 液中,冲洗3次。
将心室肌用眼科剪剪成1 mm3 大小组织块,然后加入0. 1 %胰蛋白酶溶液10 ml,37 ℃水浴8min 后,吸取上层混悬液移弃。
再加入0. 1 %胶原酶溶液15ml，37 ℃水浴并用磁力搅拌器搅拌30～40min 后,吸取上层混悬液，放在预冷10%DMEM 中终止反应。
剩余沉淀物再加0. 1%胶原酶溶液15ml，37℃水浴并用磁力搅拌器搅拌30～40min后, 吸取全部液体，终止反应。
混悬液用200目孔径不锈钢网过滤除去未消化组织,在室温下800～1000转/min 离心3～5min，弃上清，沉淀加入培养液2ml,混匀。
1.2 程序冷冻后机械法
1.2.1 动物同上。
1.2.2 试剂DMEM (GIBCO)，Ficoll(Pharmacia) ，Krebs Henseleit 缓冲液（mM）（NaCl 118, KCl4.8, MgSO41.2 ，KH2PO41.2, NaHCO325,Glucose 11，pH7.4），蒸馏水溶解后，经0.22μm滤膜抽滤消毒，备用。
0.1M PBS（mM）（NaCl 138, KCl 2.7, KH2PO41.2,Na2PO4 8.1，pH7.4）, 蒸馏水溶解后，高压蒸汽消毒，备。