微生物挑战性实验方法
(完整word版)微生物挑战性实验方法
微生物挑战性实验方法1.0目的新产品防腐效果的测试2.0 范围公司新产品3.0参考：4 材料与方法4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6]营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等4. 2微生物挑战性实验4. 2. 1受试用微生物测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。
细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。
霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。
实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。
细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。
4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法。
称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。
然后充分混匀, 置于28℃下。
在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。
按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。
此实验用以评判防腐剂的有效与否。
评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。
符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。
化妆品微生物挑战试验
化妆品微生物挑战试验刘树葆臧跃扬桂菊（天津化妆品科学技术研究皖有强公司）摘要：本文参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法，研究了不同产品在相同防腐条件下，微生物挑战试验结果的差异性。
关键词：防腐体系，微生物挑战试验，膏霜，乳液，水剂。
目前，化妆品琳琅满目，产品配方复杂多样，通常包含多种成分，尤其许多化妆品中的营养成分非常适合微生物的生长，而微生物存在于我们生活着的世界的每一个角落，从而为化妆品的生产和保存带来困难。
微生物污染将导致产品在气味、颜色、粘度、性能上都会发生改变。
因此化妆品微生物污染对产品质量、正常使用以及使用者健康来说是一个极大的冒险“’。
为防止微生物污染，就对产品的防腐提出了挑战，所以必须建立很好的防腐体系，以保证产品的安全、稳定性“’，为消费者提供安全和高品质的产品。
评价化妆品质量的～个重要指标就是微生物是否达到化妆品卫生规范的要求，本实验参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法。
’，对相同防腐体系不同功能的膏霜、乳液及水剂产品进行微生物挑战试验，以指导配方师合理添加防腐剂。
１．实验方法ｉ．Ｉ．ＣＴＦＡ推荐的防腐单次挑战试验ＣＴＦＡ推荐的经典的为期２８天的防腐单次挑战实验，是将防腐剂混入配方基质中，然后～次性接入若干种类、～定数量的微生物进行挑战，将样品存放于适当的温度下，定期抽样检测其中残存的微生物，并根据微生物的数量变化情况评价样品的抗菌效果。
１．２试验仪器恒温培养箱：霉菌培养箱：显微镜：灭菌平皿：直径为９ｃｍ；ｐＨ计；高压灭菌锅；酒精灯：锥形烧瓶；量筒：灭菌刻度吸管：ｌＯｍｌ、２ｍｌ、ｉｍｌ；试管。
Ｉ．３．培养基和试剂生理盐水：ＳＣＤＬＰ液体培养基：卵磷脂、吐温８０一营养培养基：乳糖胆盐培养基：蛋白胨水：靛基质试剂：十六烷三甲基溴化铵培养基；绿脓菌素测定用培养基：硝酸盐蛋白胨水培养基：普通琼脂斜面培养基：血琼脂培养基；甘露醇发酵培养基：血浆：孟加拉红培养基。
用微生物挑战性试验考察化妆品防腐剂效果
摘要：为了考察 2010 年化妆品风险监测抽验样品的防腐效果，参考 《中国药典》（2010 年版附录） 对 3 种
化妆品进行菌落计数方法学验证，选取回收率达到 70%以上的 3 种化妆品进行微生物挑战性试验。通过对 3
类化妆品进行挑战性试验研究，结果表明，选择的 3 种化妆品均能通过挑战性试验。通过此次考察，可以
祛斑类 金黄色葡萄球菌 1.5×106
lg6.18 1.4×105 lg5.15
＜10 ＜lg1
＜10 ＜lg1 ＜10 ＜lg1
铜绿假单胞菌 1.6×106
lg6.20 1.4×102 lg2.15
10
lg1
＜10 ＜lg1 ＜10 ＜lg1
大肠埃希菌
2.3×106
lg6.36 1.6×106 lg6.20
2 结果与讨论
2.1 结果 受试的 3 种类型的化妆品在检测时间内细菌和真
菌的防腐能力见表 1。从表 1 结果看，选取的 3 种类 型的化妆品，14 天细菌菌数下降不少于 2.0 lg，14 天～ 28 天细菌菌数未增加；与初始值比，14 天和 28 天真 菌数均未增加，受试的 3 种类型的化妆品均能够通过 挑战性试验。为了考察化妆品的防腐效力，本次试验 所选取的 3 种类型的产品都是经过微生物验证过的， 将 3 种类型的产品按照 《中国药典》 微生物限度检查 方法 （常规法） 进行验证，结果 3 种产品经过验证 后，各验证菌的回收率均能达到 70%，且该 3 种样 品按照化妆品卫生规范 （2007 年版） 方法进行检验 为无菌产品。因此，选择这 3 种样品作为供试品代表 进行研究，通过本次试验初步对 2010 年化妆品风险 监测抽验样品的防腐效果进行了考察，为消费者选择 健康的化妆品提供可靠依据。 2.2 讨论
细菌防腐剂挑战性实验
摘要：对建立化妆品防腐体系的各种要素进行了分析，就国内外有代表性的微生物挑战试验的评价方法进行了比较，提出了符合实践情况并适用于我国化妆品行业的化妆品防腐体系的效能测试方法的评价标准，还为化妆品防腐体系筛选过程的快速判定提供了经验依据。
关键词：化妆品；防腐剂；防腐体系；微生物挑战试验大多数化妆品富含微生物生长所需的养分，环境中的微生物一俟进入，即可迅速繁殖，破坏产品的感官品质，损害消费者的健康。
因此，一个良好的防腐体系，对于化妆品产品来说是必不可少的。
1 化妆品的防腐体系化妆品的防腐体系实际上是由若干种防腐剂（和助剂）按一定比例构建而成。
防腐体系的基本要素是防腐剂，但其效能大小又与其用量和使用对象的剂型（液态、粉状、乳状、膏霜状等）特性、组成（是否含碳水化合物、蛋白质、动植物抽提物等）、pH值、可能污染的微生物种类和数量等密切相关。
1.1化妆品防腐剂早期使用的防腐剂有：尼泊金脂类、苯甲醇、烷基二甲基苄基铵氯化物、对氯间二甲酚、苯氧基乙醇、布罗波尔（Bronopol，2-溴-2-硝基丙烷-1，3-丙二醇）、道维希尔200（Dowicil-200,六亚甲基四胺衍生物）、杰马-115(Germall-115，咪唑烷基脲)、脱氢醋酸、甲醛、山梨酸等。
这些防腐剂至今很多仍在使用。
近期推广商品化的化妆品防腐剂见表1。
至于复配而成的防腐剂商品更是数不胜数。
防腐剂对微生物的最低抑制浓度（cmc）是判断一种防腐剂效果的首先考虑的基本指标，MIC值越小，表明其效力越高。
表2是某些化妆品防腐剂对主要测试微生物的MIC。
表1一些化妆品防腐剂商品及化学成分商品名称化学成分Enxylk400 甲基二溴戊二腈和苯氧乙醇Biopure100 咪唑烷基脲Nipaguard DMDMH 二甲基二羟基乙内酰脲Nipaguard TCC N-（4-氯苯基-N-3，4-二氯苯基）脲Nipacide PX (PCMX) 对氯间二甲苯酚GERMALLⅡ双咪唑烷基脲GERMALL PLUS 双咪唑烷基脲和碘丙炔基氨基甲酸丁酯（IPBC）ALLANTOIN 乙醛双酰脲SUTTOCIDE A 羟甲基甘氨酸钠华科-98、凯松CG、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-2甲基-4-异JX-515、YN-H3 噻唑啉-3-酮GLYDANT 二甲基二羟基乙内酰脲GLYDANT PLUS DMDM和IPBCIRGASAN DP300（玉洁新DP-300）、2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯醚Oletron1.2化妆品的防腐体系的构建1.2.1防腐剂的复配一种万能的防腐剂是不存在的。
微生物侵入试验
容器/密封系统完好性试验—微生物侵入试验概述微生物侵入试验是对最终灭菌容器/密封件系统完好性的挑战性试验。
在验证试验中，取输液瓶灌入培养基并按常规方式封口，灭菌后冷却备用。
此后，将冷却后的输液瓶倒置并将瓶口完全侵没于高浓度运动性菌液中，4小时后取出，培养并检查看是否有挑战性细菌在输液瓶内生长，同时，需作阳性对照试验，确认培养基的促菌生长能力。
试验步骤1、试验样品的制备1.1在生产线上取足够量的输液瓶，灌装SCDM/2（大豆胰蛋白胨肉汤）培养基，在封口机上密封后经最长灭菌程序灭菌。
1.2将每一个冷却的试样倒置，使培养基与输液瓶内表面充分接触，在30-35℃下培养14天。
2、确认培养促菌生长能力——营养性试验2.1所有试样培养14天均不长菌时，随机取20个试样，每个试样内接种0.1ml的铜绿假单胞菌ATCC9027，菌液浓度：10-100CFU/0.1ml。
2.2在30-35℃下培养7天，或培养至所有试样都呈阳性结果。
2.3若7天内，所有接种铜绿假单胞菌的试样中，微生物生长良好，则容器内培养基的促菌生长能力可判为合格。
使用革兰染色和紫外灯下肉汤呈蓝绿色荧光的性质，来鉴定并确认试样容器内生长的菌为接入的铜绿假单细胞。
3、挑战菌悬浮液的制备3.1从铜绿假单胞菌的新鲜斜面上取一整环培养物，分别接入含10ml无菌培养基的试管中，在30-35℃下培养16-18h。
3.2将每管的培养物分别转入含1000ml相同培养基（SCDM/2）的容器内，于30-35℃下培养22-24h。
在培养结束时，能明显见容器内培养基出现浑浊即可。
4、微生物侵入试验操作步骤本试验须在生物安全柜内或其他不影响生产环境的地方进行。
4.1将菌悬液倒入盆中，用金属丝架固定试样输液瓶，将50个试样输液瓶倒置，并浸入菌悬液中持续浸泡约4h。
试样内的无菌培养基应充分接触封口内表面，样品的颈部及封口的外表面应完全浸泡在菌悬液中。
4.2实验开始时取一份菌悬液，平板计数第毫升所含的活菌数。
化妆品防腐效能评价方法
化妆品防腐效能评价方法1．定义微生物挑战性实验：将一定量的微生物加入到化妆品中，每隔一定时间检测微生物增减的数量，以此来判断防腐剂防腐效能的实验方法。
2．仪器设备2.1 生物安全柜2.2 高压蒸汽灭菌器2.3 冰箱2.4 恒温培养箱2.5 均质器2.6天平3.试剂和培养基3.1 0.85%生理盐水3.2 含0.05%吐温80的生理盐水3.3 改良的LETHEEN 肉汤3.4水解大豆琼脂培养基（TSA）3.5萨布罗右旋糖琼脂培养基(SDA)4.实验菌株4.1细菌：金黄色葡萄球菌ATCC6538，大肠杆菌ATCC8739，铜绿色假单胞菌ATCC9027等。
4.2真菌：巴西曲霉ATCC16404，白假丝酵母ATCC10231等。
根据实际情况可增加其他细菌作为测试菌株。
5.实验方法（混合培养法）5.1样品准备：取包装完好的待测化妆品样品2份，在无菌条件下各称取30g于灭菌试剂瓶中，备用。
5.2细菌悬浊液的制备：使用灭菌生理盐水制备测试菌株的菌悬液，浓度均为108cfu/mL。
取每种测试菌株菌悬液等体积混合，备用。
5.3真菌悬浊液的制备：使用灭菌生理盐水制备白色假丝酵母菌悬液，使用含0.05%吐温80的灭菌生理盐水制备巴西曲霉孢子悬液，浓度均为108cfu/mL。
取每种测试菌株菌悬液等体积混合，备用。
5.4菌液接种及样品检测：取上述称量好的化妆品（30g），分别加入0.3mL混合细菌悬浊液和0.3mL混合真菌悬浊液，用旋涡振荡器混合均匀，将样品于室温（22.5+2.5℃）保存。
分别于0、1、7、14、21、28天检测化妆品中的菌落数，即取1g或1mL待测样品加入到9mL改良的LETHEEN肉汤中，充分混匀稀释成适宜的倍数，检测样品中菌落数。
细菌培养推荐采用TSA培养基，36℃±1℃培养48h计数；白色假丝酵母和巴西曲霉培养推荐采用SDA培养基，28℃±2℃培养3-5天计数。
每次检测做两个平行样。
微生物挑战性试验
1.0目的新产品防腐效果的测试2.0 范围公司新产品3.0参考：4 材料与方法4. 1 化妆品中常用的防腐体系[ 6]营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等4. 2 微生物挑战性实验4. 2. 1 受试用微生物测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。
细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。
霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。
实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于 37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。
细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108 个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。
4. 2. 2 一次加菌的28 天微生物挑战试验此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法。
称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。
然后充分混匀, 置于28℃下。
在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g 企业名称杭州国光旅游用品有限公司 Hangzhou Guoguang Touring Commodity Co.,Ltd. 文件编号 SSOP-04 版本/修改号 1.0 文件名称微生物挑战性试验操作规范 Standard Operation Procedure for Hygiene Standard 生效日期 2010/7/1 页 次 第1页 共6页 编写 审核 批 准样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。
微生物挑战法的测试
微生物挑战法的测试近期越来越多的客户关注到药品包装的检测，我们普创工业科技专业做包装检测仪器十余年，目前检测仪器针对不同的项目我们推出不同的质量方案。
国家药监局2023年5月发布了《化学药品注射剂制药质量和疗效一致性评价技术要求》等系列文件，正式启动了化学药品注射剂仿制药质量和疗效一致性评价工作。
同月，国家药监局药审中心发布了《化学药品注射剂包装系统密封性研究技术指南（征求意见稿）》。
明确指出：密封性检查方法优选能检测出产品最大允许泄露限度的确定性方法，如方法灵敏度无法达到产品最大允许泄露限度水平或产品最大允许泄露限度不明确，建议至少采用两种方法（其中一种推荐微生物挑战法）进行密封性研究。
目前针对密封测试仪我们这边有不同的产品推荐：微生物挑战法中，浸入法比气溶胶挑战法更普遍，方法条件更容易达到，有更好的重复性。
侵入式微生物挑战测试针对罐装测试样品，通过培养和外观检查确保样品的无菌性。
此后样品浸入到细菌悬液中预定的时间，过程中可真空暴露设定时间，时间结束后保持样品浸没状态释放真空，然后样品在促生长条件下培养，培养结束确定是否有挑战微生物生长。
替代方案可包括样品暴露于正压或多个真空周期条件，挑战微生物的可见生长证明样品存在泄漏。
浸入微生物挑战依赖于泄漏路径内的液体载体，微生物由载体携带或主动迁移进入样品内并生长。
测试样品同时使用阴性和阳性对照测试方法检测限。
微生物挑战实验中面临诸多挑战，例如：如何选择挑战微生物？如何制备微生物挑战的阳性样品？如何选择合适的验证方法？在灭菌过程中如何防止孔变大或变小？如何确定最大允许泄露限度？细菌侵入测试仪LT-PNP是我们新推出的专门用于无菌药品包装完整性的仪器，通过设置不同压力变化的场景条件，验证特定不同包装容器及密封工艺对微生物的阻隔性能，可广泛应用于：注射剂一致性评价、无菌药品包装封口工艺验证、物理检测方法有效性验证、物理孔径与微生物穿透对应关系研究、注射剂稳定性研究和验证、包装运输、贮存条件挑战测试等。
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微生物挑战性实验方法
1.0目的
新产品防腐效果的测试
2.0 范围
公司新产品
3.0参考：
4 材料与方法
4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6]
营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、
0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等
4. 2微生物挑战性实验
4. 2. 1受试用微生物
测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。
细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。
霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。
实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。
细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。
4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验
此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性
试验检测防腐剂效果的方法。
称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。
然后
充分混匀, 置于28℃下。
在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。
按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。
此实验用以评判防腐剂的有效与否。
评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。
符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。
分析与检测
4. 2. 3重复3 次加菌的微生物挑战试验此方法参照国际CT FA（国际化妆品、香精和洗涤剂协会）推荐的微生物挑战性试验。
称取受试样品30g , 每隔2 周加菌一次( 即实验的第1、3 和5 周) , 每次加细菌量为1 ×106 ～1 ×107个/ g 样品和霉菌1×105个/ g～1×106 个/ g 样品。
在加菌后的0 天、7 天和14 天( 后一次加菌前) 采样分析样品中含菌量, 方法同前。
此方法可将受检样品分为三类:
( 1)防腐效果优良( W) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 01% ( 即≤100 个/ g或ml）样品, 通过测试) 。
( 2)防腐效果尚可( M ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, ( 即≤1000 个/ g 或mL 样品, 通过测试) 。
( 3)防腐效果差( P) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7天或14 天时, 存活菌量>mL样品(不通过测试) 。
5、结果判断
受试样品一次加菌和3 次加菌后, 在检测时间内细菌和霉菌的抗腐能力见表1～4。
根据两种方法评判标准, 将8 种防腐体系的防腐效果评判列于表5 。
从结果看, 两种加菌方法对防腐体系的评判结果基本一致, 三次加菌还可对有效的防腐体系作出程度之区别: 防腐优良( W: We pr eser vative) 和防腐尚可( M :M ar gina preserv ative) 。
此外, 在一次加菌后1～2 周内能将样品中含菌量降低至加入菌量的0. 1%, 可通过3 次加菌实验, 如防腐体系5 和8 对细菌
的防腐力; 但若大于0. 1%, 即使在以后的测试时间内有逐渐下降至0 的趋势, 可能亦很难通过3 次加菌实验,如防腐体系7 对细菌的防腐力。
参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表2所示）(注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC值不同）
2.3 试验用菌液的配置
（1）标准悬液的配制
1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml，此悬液再做3倍稀释。
（2）细菌菌悬液的配制
实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。
将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。
用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3×108cfu/ml）相同为止；
此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1×108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。
（3）霉菌菌悬液的配制
将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190～210，落在此范围内的菌悬液为我们所需的1×108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。