实验五：ELISA法检查乙肝表面抗原(HBsAg)..
ELISA法HBsAg检测的注意要点
ELISA法HBsAg检测的注意要点室内质控（IQC）是由实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本室常规工作的重复性和精密度，提高本室常规工作中样本检验的一致性，保证每个患者样本验测结果的稳定性。
临床实验室常规HBsAg检验步骤很多，基本上可分为标本收集、实验室测定过程和结果报告及其解释等；规范化的、认真细致的测定过程可以杜绝过失误差，减少随机误差，及时发现系统误差，在室内质控中起着决定性作用。
现将我科HBsAg检测过程中的注意要点报道如下：1 材料与方法1.1主要试剂及设备上海科华生物技术有限公司生产的乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（批号20081217），省临验中心分发的HBSAg室内质控品（正常浓度批号为090040，病理浓度批号为090041），上海安泰生产酶标仪（AT－858）和洗板机（AT－828）。
1.2方法采用单克隆抗－HBS包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗－HBS－HRP，当标本中存在HBSAg时该HBsAg与包被抗－HBS结合并与抗－HBS－HRP结合形成抗－HBS－HBsAg－抗－HBS－HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
2规范化操作及注意要点2.1从冷藏柜中取出的试剂、质控品及待测标本均需室温平衡30分钟。
2.2待测标本、阴阳性对照及质控品应沿反应孔壁加入，不可有气泡。
2.3酶结合物、显色剂、终止液使用前应摇匀，并弃去1￣2滴垂直滴入。
2.4孵育的时间和温度应严格按试剂盒说明书操作。
2.5注意洗涤液不要溢出，防止污染它孔。
2.6洗板机选择洗涤5次程序，洗板后注意拍干。
2.7酶标仪读数时使用双波长（450nm和630nm），先用空白孔校零。
2.8封片不可重复使用。
2.9结果判断须在反应终止后10分钟内完成。
二个不同浓度的质控品随正常工作日患者样本一道，按试剂盒说明书同时检测。
3结果判断样品OD值/阴性对照平均OD值≥2.1为阳性，否则为阴性。
对ELISA方法检测HBSAg结果的分析
对ELISA方法检测HBSAg结果的分析当前国内临床检测乙型肝炎表面抗原(HBSAg)多采用ELISA双抗体夹心法，其基本原理是:1.将抗体包被在载体后作为固相，加入待测标本，使其中的相应抗原通过免疫学反应结合到固相抗体上，洗涤除去未结合的抗原。
2.加入酶结合物与已结合在固相抗体上的抗原反应，并洗涤除去未结合的游离未结合物。
3.加入酶（常用辣根过氧化物酶）的相应底物，固相化的酶催化底物反应生成有色产物。
在一定温度下一定时间后终止反应，显色物的量与在固相上的抗原有关。
该方法检测HBSAg时，影响的因素很多，有内源性物质和外源性物质两大类。
血清是最常见的ELISA标本，大约有40%的人血清标本中含有类风湿因子，补体，嗜异性抗体，嗜靶抗原自身抗体等非特异性物质，对ELISA测定有干扰作用易造成假阳性或假阴性结果，这不是人为因素造成的。
在临床检验工作中，常因标本量多，紧急要求出检验报告，较难逐个分析其内源性的物质，而忽略它的存在。
而工作中，因血样的采集，储存及操作程序等不当所致的外源性物质的干扰，最易影响ELISA的测定结果。
本文对检验工作中经常出现的如标本溶血，标本被细菌污染，标本储存过久，标本凝固不全等因素进行分析。
1.标本溶血由于各种人为因素引起标本溶血，使红细胞溶解细胞内的过氧化物酶进入血浆，并大量吸附于细胞碎片及纤维蛋白原上,从而造成以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，非特异性显色，出现假阳性。
有试验证明溶血标本HBSAg假阳性率达91.7%[1]。
要认真做好标本的保存和处理工作，防止溶血。
2.标本受到污染标本受细菌污染，因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶同样易产生非特异性显色，出现假阳性。
3.标本放置时间在冰箱中保存过久的标本，血清中IGg可聚合成多聚体，AFP可形成二聚体，在ELISA测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。
采血后若不在当天检测，应置于2-8℃冰箱中，若要储存，则置于-20℃低温冰箱内保存。
ELISA法和胶体金免疫层析法检测乙肝表面抗原结果分析
ELISA法和胶体金免疫层析法检测乙肝表面抗原结果分析目的：分别采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和胶体金免疫层析（GICA）法检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg），对比结果，探讨两种方法检测乙肝表面抗原的应用价值。
方法：分别采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和胶体金免疫层析（GICA）法检测768份18～65岁人群血清标本，对比乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）检测结果。
结果：胶体金免疫层析法检测出HBsAg阳性标本42份，阳性率5.47%。
ELISA法检测出HBsAg阳性标本46份，阳性率为5.98%，两种方法阳性检出率差异无统计学意义（P>0.05）。
两种方法检测的符合率为97.39%。
胶体金免疫层析法的灵敏度为69.57%，特异度为98.61%。
结论：胶体金免疫层析法操作简便、快速，检测的特异度较高，但其灵敏度有限，有待提高。
标签：酶联免疫吸附试验法；胶体金免疫层析法；乙肝表面抗原乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒（HBV）感染机体后所引起的疾病，是当前严重危害人类身体健康的传染病。
乙型病毒肝炎表面抗原（HBsAg）阳性是感染乙肝病毒的重要指标。
酶联免疫吸附试验（ELISA）法是目前我国检测乙肝HBsAg最为普及的方法，应用时间较早，而胶体金免疫层析法是近年来采用的免疫学检测方法。
本组研究资料采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和胶体金免疫层析（GICA）法对768份18～65岁人群血清进行HBsAg检测，并对比检测结果。
现报告如下：1材料与方法1.1标本来源抽取18～65岁人群血清768份，采集无溶血、无脂浊的静脉血标本3～5ml，室温静置30min后，4000r∕min离心5min，充分分离血清待检。
1.2仪器与试剂乙肝五项胶体金快速检测板由上海科华生物科技有限公司提供，HBsAg试纸条由蓝十字生物药业有限公司提供；ELISA检测试剂由珠海丽珠生物科技有限公司公司提供；TDL-42A低速离心机；Unto-FLiudo全自动酶标洗板机；Unto-2010酶标仪。
利用ELISA法检测乙肝五项操作过程中的几点注意事项
利用ELISA法检测乙肝五项操作过程中的几点注意事项【中图分类号】R512.6+2 【文献标识码】B 【文章编号】1672-5085(2009)13-0236-02目前，临床乙肝五项检测一般采用ELISA法，因为ELISA法是当前灵敏度较高，特异性较好的方法，被临床广泛认可，而且操作非常简单。
但在操作过程中各个环节对检测结果影响较大。
望广大检验工作者引起高度重视，要严格遵守操作规程。
一般涉及标本的采集和保存、试剂的选择和准备、加样、浴温、冲板、显色、比色各步骤。
下面将操作过程中各个环节的注意事项做以下简介：1 标本的采集及保存采血管，优点是既可以预防血液中的气溶胶粒子在空气中传播，对工作人员造成危害，又可以防止标本被污染。
采血过程一定按无菌操作，保证采血顺畅,不要进行剧烈震荡，避免产生溶血现象，因溶血标本或长菌标本会造成假阳性结果。
血液标本采集后要使其充分凝固再分离血清，最好放置1小时，然后再用3000rmp离心15分钟，若当天检测可以放在室温，如果在次日或几天内检测，可分离血清后，放在2-8℃冰箱内保存，用时提前取出，恢复至室温温度时方可检测，如果长时间保存，必须分离血清后置于-20℃低温冰箱内密封保存，用时先置于2-8℃冰箱中使之溶解，然后在室温下使之全溶，方可使用。
2 试剂的选择及准备选择质量优质的试剂盒，严格阅读使用说明书，操作前将试剂在室温平衡30分钟，目的主要是为了保证试剂及反应微孔在后面浴温过程中能够较快达到所要求的温度，稀释洗板液所用蒸馏水或去离子水一定要保证质量，而且要当天用当天配制。
3 加入样本及反应试剂血清或血浆标本一定要分离好，决不能将纤维蛋白原或血球带入反应微孔中，避免出现假阳性或假阴性。
加样器必须经过校准；加样速度不可以太快，加样太快无法保证微量加样器的准确性和均一性；避免加在孔壁上部，加在孔壁上部的非包被区易导致非特异性吸附；避免样本溅出或产生气泡，溅出会对邻近孔造成污染，出现气泡则反应液界面有差异。
人乙肝表面抗原(HBsAg)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使
人乙肝表面抗原（HBsAg）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中乙肝表面抗原（HBsAg）水平。
实验原理：本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）。
用纯化的人乙肝表面抗原（HBsAg）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中乙肝表面抗原（HBsAg）相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的乙肝表面抗原（HBsAg）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）的存在与否。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
ELISA法检测血清中HBsAg的结果不确定度分析
ＥＬＩＳＡ法检测血清中ＨＢｓＡｇ的结果不确定度分析目前ELISA法在临床检验中已被广泛应用,具有一定的代表性,而有关ELISA 法检测结果的不确定度评定的应用报道很少。
本文根据JJF1059—1999《测量不确定度评定与表示》[1],通过对典型例子不确定度的分析和量化,建立了ELISA法检测HBsAg结果不确定度的评定程序,通过对检测结果不确定度的评估,对检测结果进行完整地表达,避免或降低了出现假阴性结果的风险。
1 材料与方法1.1 材料试剂为乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法),上海科华生物技术有限公司产品。
设备为Thermo MK3型酶标读数仪。
依据GB15990—1995《乙型病毒性肝炎的诊断标准及处理原则》[2]进行检测。
1.2 方法在板架上放好酶标板条,每孔加入50 μL待测血清或阴、阳性对照,设阴、阳性对照各2孔。
每孔加入酶结合物50 μL,置37℃孵育30 min。
洗板5次后,每孔加显色剂A液、B液各50μL,置37℃孵育15 min。
每孔加入终止液50 μL后,用酶标仪读数,取主波长450 nm,参考波长630 nm读取各孔OD值。
2 结果2.1 被测物数学模型公式:ΔA=S-CO式中:ΔA—结论判定;S—待测血清吸光度值(OD值);CO—临界值(cut-off)=NCx×2.1。
NC—阴性对照OD值;NCx—阴性对照平均OD值;2.1为修正系数。
2.2 结果判定当阴性对照OD均值0.05时以实际OD值计算。
ΔA≥0者为HBsAg阳性,ΔA0.05时以实际OD值计算,见表2。
3 讨论3.1 分析和量化不确定度分量3.1.1 临界值CO的不确定度就是阴性对照平均值(NCx)的不确定度,NCx的不确定度主要由2个分量组成,即:由系统效应引起的阴性对照OD值NC的不确定度和由重复性试验(只有当阴性对照OD值NC大于0.05时)中随机效应rep引起的不确定度。
阴性对照NC代表的是阴性对照在某特定波长下的吸光度值,根据朗伯一比耳定律,吸光度值与吸光系数(a或ε)、液层厚度(b)和阴性样液浓度(C0)成正比,对于某一特定的显色反应来说,吸光系数是个常数。
人乙肝表面抗原(HBsAg)酶联免疫分析(ELISA
人乙肝表面抗原（HBsAg）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中乙肝表面抗原（HBsAg）水平。
实验原理：本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）。
用纯化的人乙肝表面抗原（HBsAg）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中乙肝表面抗原（HBsAg）相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的乙肝表面抗原（HBsAg）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）的存在与否。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙肝病毒表面抗原
xx医科大学附属第五医院 xx
乙肝五项报告单
教学目标
• 掌握ELISA检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的原理
酶联免疫吸附试验
技术简介
• 酶联免疫吸附试验：ELISA • 是一种固相酶免疫分析技术 • 即可检测抗原，又可检测抗体 • 广泛地应用于临床和科研检测 • 反应类型：双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法…
固相载体（聚苯乙烯塑料） E E 酶标记乙肝表面抗体
乙肝表面抗体 血清中待测乙肝表面抗原
底物（底物缓冲液+ 底物液）
水浴箱37℃温育
血清中其他非待测抗原
双抗体夹心法
检测HBsAg反应原理示意图 1、特异性抗体与固相载体结合，形成固相抗体
包被 固相乙肝表面抗体
双抗体夹心法
检测HBsAg反应原理示意图 2、加入待测标本，温育，形成固相抗体-待测抗原复合物
抗原抗体反应具有高度的特异性
酶联免疫吸附试验
如何应用双抗体夹心法检测HBsAg?
双抗体夹心法
方法简介
• 是ELISA检测抗原最常用的方法 • 适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原
双抗体夹心法
检测HBsAg三个必要试剂
• 固相化的抗体 • 酶标记的抗原 • 酶反应的底物
双抗体夹心法
反应基本原理
课后思考题
• 试着分析乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）的检测原理？
提示：双抗原夹心法
EE
EE
EE
EE
固相乙肝表面抗体-待测乙肝表面抗原-酶标乙肝表面抗体复合物
双抗体夹心法
检测HBsAg反应原理示意图
6、加底物，固相载体结合的酶催化底物显色
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酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
1.简介
酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,简称ELISA，它 是实验室最常用的检测方法，用酶标记抗原 或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗 体或抗原。 ELISA具有准确性高、检测时间 短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果 便于记录和保存等优点，适合于大批标本的 检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测 以及免疫实验分析等领域。
• 洗涤必须彻底，防止产生假阳性； • 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃等。37℃是实
验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温 度。 • ELISA板放在湿盒内，可在盒底垫湿的纱布，将ELISA板放在 湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速 平衡。温浴的时间要严格控制。
• 1、 • 2、
课后问题
上)，温育
加入酶标抗体， 加入底物，
温育
显色
终止反应，底物显色深浅与待检抗原 量成正比。
利用已知浓度的抗原制成标准品，稀 释为梯度浓度，对其最终OD值与浓 度作标准曲线，那么样品的浓度可以 根据最终的OD值在标准曲线上查出。
实验内容：
双抗体夹心法测定乙肝表面抗原 （HBsAg）——定性定量检测
实验目的
(Enzyme ImmunoAssay,EIA)
• 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。
– 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)
• 特点：
✓ 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 ✓ 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 ✓ 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值
• 分类：
• 1、掌握ELISA（双抗体夹心法）的原理 • 2、熟悉ELISA实验操作方法，并了解其应
用
实验材料
✓ HBsAg酶联免疫分析试剂盒 ✓ HBsAg阳性品，阴性对照品 ✓ 移液枪，枪头 ✓ 湿盒 ✓ 酶标板，酶标仪 ✓ 一次性手套 ✓ 记号笔 ✓ 计时器
实验步骤
结果判定
•定性测定 定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用 “阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作 一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。 根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不 稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。 待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者 为阳性，N为阴性对照孔。
•定量测定：酶标仪测定450nm波长下的OD值，根据标准曲 线计算样品抗原的浓度。
预期结果
• 阳性：显色为黄色 • 阴性：无色
1 23 4
阴性 阴性 阳性 阳性
ELISA注意事项
• 加样应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅 出，避免产生气泡并迅速完成；一个人操作时，一次不宜多 于两块板同时测定。
2、ELISA基本原理
(1).抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持 其免疫学活性。例如：蛋白质分子结构上的疏水基团与聚 苯乙烯表面的疏水基团能产生互作用而吸附。 (2).抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此 种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； (3).酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的 颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的 深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，由此进 行定性或定量分析。
实验五：ELISA法检测乙肝表面 抗原（HBsAg）
主讲人：季煜华 2014年11月
免疫标记技术
1.定义：
将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性 同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过 检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。
2.分类：
✓ 放射免疫测定法：131I，32P ✓ 免疫荧光技术：FITC，PE ✓ 免疫酶测定法：HRP，AP
3、ELISA基本的实验过程
• 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载 体表面，使抗原或抗体固相化；
• 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物， 使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固 定；
• 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使 发生酶促反应而显色。
ELISA的试剂
ELISA中有3个是必要的试剂：免疫吸附剂、标记物和显色剂。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （聚苯乙烯板：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗 原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性） （2）酶标记的抗原或抗体（标记物）； （3）酶作用的底物（显色剂）； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）样品及标准本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液
4、ELISA类别
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂 的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不 同类型的检测方法，主要类型有
双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。Fra bibliotek 双抗体夹心法
间接法
5、操作步骤（以双抗体夹心法ELISA为例）：
清洗
清洗
清洗
用抗体包被固 相载体
加入抗原 Sample(二价以
免疫标记技术
用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免
疫学诊断的敏感性
放射性同位素： 酶：辣根过氧化物酶、 荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄
125I、131I
碱性磷酸酶
绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹
明（红色荧光）
放射免疫检测法（RIA） 酶免疫检测法（EIA） 免疫荧光检测法（IFA）
免疫酶测定法