口服药物吸收模型的研究进展

１．３外翻肠囊法
实验前将大鼠禁食过夜（不禁水），将其麻醉后杀死，通 过腹部切口分离出小肠。用缓冲液冲洗排除内容物，然后翻 转，使黏膜朝外，浆膜朝内，肠一端结扎。另一端接注射器， 注入一定体积的缓冲液，３７℃，５％ｃ０２，充分供氧，孵育，定时 取样１１７ Ｊ。 Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ等－ｔｓ］以氢氧化铝和柠檬酸铝为模型药物，应 用外翻肠囊法研究铝的吸收机制，以及电荷和代谢抑制剂对 吸收的影响。研究发现药物的吸收是被动的细胞旁路扩散 机制，有较多的药物黏附在细胞表面，但有较少的组织转运。 柠檬酸盐减少了吸收一转运比率，但不受电荷的影响。 外翻肠囊法的优点是操作简单易行，在肠外翻模型中测 定的是药物从肠黏膜侧到浆膜侧的透过量，可直接反映药物 在肠黏膜细胞层中的转运过程。但是组织活性较低是它的
了改进【５ Ｊ。Ｐｒｅｇｏ等【６１在Ｃａｃｏ－２细胞和膜分泌型细胞ＨＴ２９．
口服药物吸收的研究方法主要包括体外法、在体法和体 内法等３种。本文主要介绍这３种方法的基本操作及其特 点和应用。
１体外法
１．１
Ｍ６的联合培养下，用共聚焦荧光显微镜研究降钙素壳聚糖 纳米囊的吸收机制。Ｓａｍ等¨Ｊ以膜分泌型肠细胞模型ＨＴ２９． ＭＴＸ．Ｅ１２（Ｅ１２）研究蜂毒肽作为吸收促进剂促进吸收的可能 机制和细胞毒性。 Ｃａｃｏ－２细胞的培养条件已经很成熟，将Ｃａｃｏ．２细胞接种 于含ＤＭＥＭ的培养液中，将培养瓶在３７℃，５％ｃ０２的培养箱 中培养，ＤＭＥＭ的培养液中含有１０％胎牛血清（ＦＢＳ）、１％￡． 谷氨酰胺、ｌ％非必需氨基酸以及抗生素（青霉素、链霉素、庆 大霉素等），常用的培养槽是Ｓｎａｐｗｅｌｌ或ｔｒａｎｓｗｅｌｌ转运培养槽 以及ＭｉｌｌｉｃｅＵ培养槽，实验时一般将１×１０＇一１×１０５个细胞／ ｃｍ２接种于带有微孔的聚碳酸酯膜或聚乙烯膜上，培养时向 顶侧（相当于肠腔侧）和基底侧（相当于浆膜侧）小室分别加 入一定量的培养液，每２ ｄ换液１次，一般在接种２ｌ一２４ ｄ后 使用，也可通过提高接种细胞密度，缩短细胞培养时间【８Ｊ。 在实验前需要对Ｃａｅｏ．２细胞模型进行完整性评价，通过 显微镜观察细胞形态学特点，培养过程中通过定期测定跨上 皮细胞膜电阻（ＴＥＥＲ）、３Ｈ甘露醇的通透量等指标对其进行 评价。跨膜电阻值一般要求大于３５０ ｆ１／ｃｍ２【９］，跨膜电阻越 高说明细胞单层的紧密性越好，ＴＥＥＲ是评价细胞紧密连接 的重要指标，在细胞培养的过程中ＴＥＥＲ与细胞生长时间正 相关，最后达到～个相对恒定的值。用同位素标记的３Ｈ甘露 醇检测膜的通透性，当其转运率小于０．５％时则说明细胞单
单向灌流与在体肠循环灌流的不同之处是插管后并不 与蠕动泵相连接，用缓冲液平衡系统５ ｍｉｎ后，灌注药物溶液 并平衡５ ｍｉｎ．在不同的时间段收集灌流液。从肠腔和血液 中分别取样，以灌流液中药物的消失和血液中药物的出现计 算表观渗透系数。这种方法与在体肠循环灌流相比可以防 止在实验过程中被分析物的化学降解卫］。 Ｅｄｗａｒｄ等－圳利用单向灌流法研究维生素ｃ和叶酸在近 端空肠的吸收，结果表明维生素ｃ和叶酸都能被吸收，同时
ｏｏｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｓｃ ［１１］Ｎｉｃｏｌａｓ
ｆｉａｌ Ｇ，Ｎｏｕａｒａ ｏｆ
Ｒｅｓ Ｔｅｃｈ。２０００，４９：３４６—３５２．
Ｙ，Ｊａｃｑｕｅｓ
Ｆ，ｅｔ
ａ１．Ａｐｉｃａｌ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔａｃｔ
制为被动扩散，符合一级动力学特征。 ２．２单向灌流法
与Ｃａｃｏ．２细胞相比，ＭＤＣＫ细胞具有较高的生长速度和 较低的ＴＥＥＲ值。ｌｒｖｉｎｅ等‘１６Ｊ研究发现被动吸收的药物 ＭＤＣＫ细胞的渗透率与药物的吸收程度具有相关性，ＭＤＣＫ细 胞与Ｃａｃｏ一２细胞具有相似的表观渗透系数（ａｐｐａｒｅｎｔ
ａｂｉｌｉｔｙ ｐｅｒｍｅ．
显著影响。
主要缺点，因此操作时间不宜过长，不适合研究转运速度较 慢的物质。同时在实验前需要观察药物在肠营养液中的稳
定性。 １．４外翻环法
将大鼠麻醉，分离出小肠，并置于装有３７℃缓冲液的烧 杯中。利用水浴保持缓冲液的温度不变，并充分供氧１５—３０ ｒａｉｎ。分离出空肠。小心的除去黏附的组织。用玻璃棒将其 翻转，暴露出黏膜侧，冲洗，并被分割为若干段，空肠环在足 够的氧和３７℃缓冲液中孵育，并且提供一定速率的搅拌ｌｌ引。 用冰冷的缓冲液冲洗肠环可以终止其对药物的摄取。将 肠环取出，吸干，置于预先过秤的小瓶中称重。消化肠环，分析 药物含量。与外翻肠囊法一样，组织活性是实验的关键。 Ｍｅｎｏｎ等。１９Ｊ利用Ｃａｃｏ．２细胞模型和外翻环法研究头孢 布烯的吸收机制，研究发现在０．２５—１０ ｍｍｏｌ／Ｌ浓度范围内， 头孢布烯主要是经过细胞旁路通道转运，同时也存在主动和
收稿１３期：２００９—０２．２５ 作者简介：冯飞飞．女．硕士研究生，Ｔｅｌ：０５３１．８８３９４３９３；张典瑞． 通信作者．教授．博士生导师，Ｔｅｌ：０５３１．８８３８２０１５，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｄｉａｎ．
ｒｕｉ２００６＠１６３．ｃ∞。
万方数据
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中国生化药物杂志Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ
中国生化药物杂志Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ
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３５ ｌ
口服药物吸收模型的研究进展
冯飞飞，张典瑞 （山东大学药学院药剂教研室，山东济南２５００１２）
要：研究口服药物的吸收机制对于提高药物的生物利用度及研究影响其吸收的因素具有重要意义。此
种，也可能是多种。
肠腔排出，结果会导致药物吸收的减少，血药浓度较低。如 果药物是Ｐ一糖蛋白的底物，它的吸收与Ｐ－糖蛋白有关系【３］。 如Ｍａｅｎｇ等Ｈ Ｊ以Ｐ＿糖蛋白的底物维拉帕米和柔红霉素研究 了Ｐ－糖蛋白介导的小檗碱通过ｃａｃｏ一２细胞的转运。 Ｃａｅｏ－２细胞模型也有它的缺点：与人肠上皮细胞相比缺 少某些药物代谢酶，缺少黏液层，并且细胞培养的时间较长。 近年来有很多研究者针对这些缺陷对Ｃａｃｏ一２细胞模型做出
被动转运。 ２在体法
ＣａｃＯ一２细胞模型是目前国内外认为较好的体外吸收模 型，虽存在一定缺陷，但是它已经成为一种预测药物在人体 小肠吸收以及药物转运机制研究的标准体外筛选工具－１２－１３］。
１．２
ＭＤＣＫ细胞模型 ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ—Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ）细胞系是马丁达比犬肾
上皮细胞，在半透膜培养时分化为带有刷状缘膜的柱状上皮 并形成紧密连接，ＭＤＣＫ野生型细胞具有异质性，主要有 ＭＤＣＫＩ和ＭＤＣＫＩ／２种，其中ＭＤＣＫｌ是较致密的单细胞层， 有较高的ＴＥＥＲ值－“Ｊ。ＭＤＣＫ．ＭＤＲｌ是用人类的ｍｄｒｌ基因 稳定转染ＭＤＣＫ细胞建立的能大量表达Ｐ．ｇＰ的细胞系。可 利用其作为肠道黏膜和血脑屏障药物透过的快速筛选模
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎａｎ ２５００１２，Ｃｈｉｎａ）
口服给药是目前最常见的给药途径，研究口服药物的吸 收机制，尤其对于Ｅｌ服生物利用度较低的药物，研究影响其 吸收的因素，对于改善药物的吸收性质，提高药物的临床疗 效具有重要的意义。 药物经过胃肠道上皮细胞的转运机制共有４种：被动转 运、载体媒介转运、膜动转运和细胞旁路通道转运。药物的 转运是一个非常复杂的过程，某个药物的转运形式可能是１
万方数据
中国生化药物杂志Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２００９年第３０卷第５期
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天然和合成维生素Ｃ的吸收并没有明显区别，合成叶酸和水 的吸收成正相关。
３体内法
［８］查龙应，许梓荣，王敏奇．Ｃａｃｏ．２细胞模型及其在营养素小肠吸 收机理研究中的应用［Ｊ］．动物营养学报，２００６，１８（３）：２１５—２２２． ［９］陈秀峰，黄洁丽，马骏．呋塞米在Ｃａｃｏ－２细胞单层模型中的跨膜 转运研究［Ｊ］．临床药学，２００８，１８（２）：５９．６１． ［１０］Ｅｈｕｄ
ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）。
细胞模型现已被广泛作为研究口服药物吸收的初步筛 选方法，但是对于同一种药物，表观渗透系数受多种因素的 影响，如培养条件，细胞接种密度，传代次数，转运实验中缓 冲液的组成和ｐＨ值以及温度等。因此可以通过建立相同的 细非试验因素的干扰。
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层紧密性比较好，能进行转运和吸收实验Ｌ８ Ｊ。 显微镜下可看到细胞生长均匀，边界清晰，表明形成了 紧密的单层细胞。利用透射电子显微镜，可观察到微绒毛和 细胞连接处的完整性［１０］。Ｃａｃｏ一２细胞有分化的细胞和未分 化的细胞之分，分化的细胞表面微绒毛较多，有绒毛刷的作 用，而未分化的细胞绒毛稀少而且分散．并且发现绒毛密度 与转运速率具有较好的正相关性－１１】。 如果药物具有细胞毒性，需要进行细胞毒性试验。陈秀 峰等引通过ＭＴＴ法考察呋塞米对细胞活性和增殖的影响情 况，存活率达到９８％以上可认为该药物浓度对细胞生长没有
Ｃａｅｏ－２细胞模型 Ｃａｃｏ－２细胞来源于人体肠腺癌细胞，和人小肠上皮细胞
的结构和功能类似，在常规的细胞培养条件下就能分化成肠 细胞样细胞，是药动学研究中应用广泛的肠吸收模型。它的 应用主要包括：①研究药物在小肠的吸收、转运和代谢机制； ②研究口服药物吸收促进剂的机制和毒性；③研究药物的相 互作用；④研究药物在小肠中的稳定性；⑤用于新药通透性 的高通量筛选；⑥研究药物与食物的相互作用；⑦在评价结 构修饰药物吸收效果中的应用…。如Ｔｅｒｕｋｏ等怛Ｊ利用Ｃａｅｏ－ ２细胞模型研究甘草皂苷和癸酸合用引起的吸收增强效应的 机制，研究发现可能与蛋白激酶Ｃ细胞的信号通道有关。 Ｃａｃｏ－２细胞有药物代谢酶，能表达Ｐ．糖蛋白，能用于研 究Ｐ－糖蛋白对药物肠道吸收的影响，存在于肠上皮细胞刷状 缘膜中的Ｐ＿糖蛋白能将药物从浆膜侧回泵至黏膜侧而进入
型－１５‘。
在体法主要包括在体肠道灌流法，肠道血管灌流法和肠 肝血管灌流法以及慢性在体肠道分离环法等瑚Ｊ，其中以在 体肠道灌流法最为常用。在体肠道灌流法主要包括在体肠 循环灌流和单向灌流法。肠道血管灌流法和肠肝血管灌流 法操作复杂，技术难度较大。在体法的优点是能保证肠道神 经以及内分泌输入的完好无损，同时也保证了血液和淋巴的 正常供应。缺点是技术难度较大，干扰因素较多。 ２．１在体肠循环灌流 将实验前禁食１２ ｈ的大鼠麻醉后固定，沿腹中线剪开腹 腔，对需要考察的部位，两端插管后结扎，用生理盐水（３７℃） 将肠道内容物冲洗干净，排尽生理盐水。将肠管两端的玻璃 管与蠕动泵的胶管相连，形成回路，开动蠕动泵。由于在实 验过程中水分的吸收会影响灌流液体积，以吸收很少的标示 物（如酚红）来标示灌流液体积的变化。 分别测定零时间药物和标示物质量浓度，向锥形瓶中补 加相同体积的空白循环液。然后在不同时间段取样并补加 空白循环液。据标示物质量浓度计算供试液体积，据每一时 间段药物质量浓度和供试液体积的变化计算肠循环液中的 药物剩余量。２１｜。 张颖等。２１］利用紫外分光光度法和ＨＰＬＣ法，以在体肠循 环灌流为模型，研究汉防己甲素的吸收机制，发现其吸收机