绿色荧光蛋白研究进展
绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用
（４）构建载体方便。由于编码ＧＦＰ的基因序列 很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒， 而不至于使质粒过大影响转化频率。
（５）可直接用于活细胞测定。ＧＦＰ是能在异源 细胞内表达后，能自发产生荧光的蛋白，并且ＧＦＰ 的分子量较小，Ｎ一端和Ｃ一端都能忍受蛋白的融
合，是理想的标记物，可进行活细胞实时定位观察， 更能接近自然真实的状态。如在活细胞中直接观察 蛋白向细胞核、内质网运动的状态，还可实时观察到 外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助荧光显 微镜观察，使研究更为方便。使用激光共聚焦显微 镜，其图像效果更佳，结合现代的计算机软件，可进 行三维显示。
３ ＧＦＰ的应用
ＧＦＰ的应用主要集中在利用其荧光性质的基础 上作为一种标记物。 ３．１ ＧＦＰ在分子生物学上的应用 ３．１．１ ＧＦＰ作为报告基因 报告基因是一种编码
可被检测的蛋白质或酶的ＤＮＡ，如传统的荧光素酶 （ＵⅨ）基因和ｐ一葡萄糖苷酶（ｃｕｓ）基因。ＧＦＰ作 为基因报告可用来检测转基因效率，把ＧＦＰ基因连 接到目的基因的启动子之后，通过测定ＧＦＰ的荧光 强度就可以对该基因的表达水平进行检测。目前， 此方法无论在农杆菌介导或基因枪介导的植物遗传 转化中还是在活细胞、转基因胚胎和动物中都已得 到非常广泛的应用，特别是在活细胞基因表达的时 空成像方面［１５Ｉ。 ３．１．２ ＧＦＰ作为融合标签
２ ＧＦＰ的理化性质。荧光特性及其改进
调控神经元绿色荧光蛋白表达的方法研究
调控神经元绿色荧光蛋白表达的方法研究神经元是神经系统中的基本功能单元，与学习、记忆、判断等高级神经活动密切相关。
绿色荧光蛋白（GFP）是源自于水母的荧光蛋白，已被广泛应用于生物学研究。
神经元中表达GFP可以使其成为标记细胞的有用工具，但如何调控神经元的GFP表达仍然是一个挑战。
本文将探讨调控神经元GFP表达的若干方法。
1. 转基因动物模型制作转基因动物模型是调控神经元GFP表达的一种常见方法。
通常将GFP基因引入到小鼠基因组中，在神经元表达分布区域特异性基因启动子上植入可调控元件，如Tet-on/Tet-off 或Cre-loxP 等，以达到对神经元GFP表达的精确调控。
然而，转基因动物模型不仅需要在制备过程中进行大量的胚胎注射，还需要鉴定基因敲入的成功率和后代的完整性。
此外，转基因动物模型也会配合一些权重和标记物的共表达，如Cre/LoxP，在研究时可能需要注意这些限制条件。
2. 病毒介导的表达病毒介导的表达是另一种调控神经元GFP表达的方法。
用特殊的病毒经过改造后让其植入到神经元细胞上，在特定区域表达GFP。
这种方法的优点是操作简单，且可以实现为时尚短的表达，但是对于验证神经元是否被选择性感染或活性下降必须足够警觉。
而对于病毒的选择，主要有两种类型：慢病毒和腺病病毒。
慢病毒更能维持DNA的稳定性，并且支持大分子细胞途径的转染，但是操作技巧流程有一些复杂。
腺病病毒的成功率更高，较为稳定，优点是可以微调其孵化时间。
其中，核壳型腺病毒的感染能力更强，表达时间更长久。
3. CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9是一种与CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，簇排短回文重复）序列相关的细菌天然免疫系统，可被用来对基因进行编辑。
近年来，CRISPR-Cas9已经成为编辑神经元基因的主要手段，并被应用于调控神经元GFP表达。
绿色荧光蛋白的研究进展
绿色荧光蛋白的研究进展作者：杨慧敏， 李文刚， 吴高锋， 魏娟， 王鑫作者单位：杨慧敏,吴高锋,魏娟,王鑫(河南农业大学,郑州,450002)， 李文刚(郑州牧专,郑州,450011)刊名：中国畜牧兽医英文刊名：CHINA ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE年，卷(期)：2008，35(8)引用次数：1次1.方六荣.陈焕春表达绿色荧光蛋白伪狂犬病病毒转移载体的构建及转移特性[期刊论文]-中国兽医学报 20012.李夏.陈素文.喻达辉绿色荧光蛋白及其在转基因动物研究中的应用[期刊论文]-南方水产 20053.范伟兴.宋建兰表达绿色荧光蛋白伪狂犬病病毒Bartha-K61株TK突变株的构建[期刊论文]-畜牧兽医学报2003(05)4.林爱星.刘小军.陈永福绿色萤光蛋白及其在转基因表达检测中的应用 1997(03)5.岳莉莉.齐义鹏.社会胜用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统高效表达绿色荧光蛋白标记的HB Ve抗原[期刊论文]-病毒学报 1998(03)6.Chafee I.Too Y.Euskirchen G Green fluorescent protein as a marker for gene expiree 19947.Fleckenstein J M.Holland J T.Hasty D L Interaction of an outer membrane p rotein ofenterotoxigenic Escherichia coliwith cell surface heparan sulfate proteoglycans 2002(03)8.Galipeau J.Li H.Paquin A Vesicular stamatitis delivery in experimental brain cancer 1999(12)9.Grignani F.Kinsella T.Mencarelli A High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein 1998(01)10.Heim R.Cubitt A B.Tsien R Y Improved green fluorescence 1995(6516)11.Heim S.Freeman R B J.Eulitz C Auditory temporal processing deficit in dyslexia is associated with enhanced sensitivity in the visual modality 2001(03)12.Ikawa M.Kominami K.Yoshimura Y Green fluorescent protein as a maker in transgenic mice 1995bas Y A.Gurskaya N G.Yanushevich Y G Diversity and evolution of the green fluorescent protein family 200214.Loimas S.Toppinen M R.Visakorpi T Human prostate carcinoma cells as targets for herpes simplex virus thymidine kinase-mediated suicide gene therapy 2001(02)15.Ogawa H.Inouye S.Tsuji F Localization,trafficking,and temperature Dependence of the Aequorea GFP in culture dvertebratet 199516.Rasher D C.Eckerd S W W Primary structure of The Aquaria Victoria green fluorescent protein1992(02)17.Valdivia R H.Alexander E H Applications for green fluorescent protein (GFP) in the study of hostpathogen interactions 199618.Wang S.Hazelrigg T Implications for bed mRNA localization from spatial distribution of exuprotein in Drosophila genesis 1994(6479)1.期刊论文罗文新.陈敏.程通.管宝全.李少伟.李少菁.张军.夏宁邵橙色荧光蛋白--绿色荧光蛋白GFPxm的改造-生物工程学报2003,19(1)最近报道了从大型多管水母中分离出新的gfp基因.经大肠杆菌表达并纯化出的绿色荧光蛋白(GFPxm)具有476nm的激发峰和496nm的发射峰,但是只能在低温下成熟的缺点限制了它的应用.这里进一步报道GFPxm的12种突变型.在大肠杆菌中的表达结果表明,有7种突变型在37℃条件下产生高的荧光强度.在25、32和37℃条件下表达6 h,GFPxm16、GFPxm18和GFPxm19的相对荧光强度均高于增强型绿色荧光蛋白(EGFP),而GFPxm16和GFPxm163在42℃高温表达时仍能保持高的荧光强度.这7种突变型中的4种在哺乳动物细胞中已获得良好表达.此外,有6种突变型的荧光光谱红移,目前所达到的最长激发峰为514nm、最长发射峰为525nm.另外有3种突变型具有包括紫外在内的两个激发峰,1种突变型只有单一的紫外激发峰.首次报道具有橙色荧光的突变型OFPxm,它的激发峰为509nm、发射峰为523nm.523nm属于黄绿色,但肉眼看到的蛋白为橙色.OFPxm在高温下可得到高水平表达且很好地成熟,但是因为低的量子产率而荧光强度相对较低.2.学位论文左妍四环素-绿色荧光蛋白生物传感器的构建及活性测定2004将来源于水母的绿色荧光蛋白基因(gfp)和来源于E.coli转座子Tn10的四环素阻遏蛋白基因(tetR)共同构建到E.coli表达载体pET-30a+上,使融合蛋白两部分蛋白间插入不同长度肽联,获得TetR C-端与GFP N-端融合蛋白:TR∷GFP和TR∷GFPs.在E.coli BL21中诱导表达并纯化了两种形式的融合蛋白.TR∷GFP(蛋白间间隔19aa)保留了GFP的荧光特性,即在395nm激发,可以510nm附近有最大发射峰.在四环素存在时,TR∷GFP在400nm-700nm范围内的荧光强度普遍增强,在510nm处增幅最大,由原来1.132增至2.214,增幅为95.6﹪,而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响不大,表明TR∷GFP,能感受外界四环素.TR∷GFPs(蛋白间间隔5aa)具备GFP荧光性质,但不具备感受四环素能力.对其中GFP部分定点突变(T203Y),获得发射荧光红移的突变融合蛋白(TR∷GFPsm).在E.coli BL21中诱导表达并纯化了TR∷GFPs和TR∷GFPsm,TR∷GFPsm经395nm激发,在526nm处出现最大发射峰;在四环素存在时,TR∷GFPsm在400nm-700nm范围内荧光强度普遍增强,以526nm处增幅最大,由原来20.33增至41.6,增幅为104.6﹪;而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响幅度较小,表明TR∷GFPsm,能感受外界四环素.用不同浓度的tc滴定TR∷GFPsm,显示4.1218μM的TR∷GFPsm随着tc浓度的增加,荧光强度相应呈指数增长,最终达到饱和.初步说明TR∷GFPsm具有tc生物传感器性质.为了使TetR与四环素结合所产生的构象变化能更好地传递给GFP,将TetR插入到GFP171aa-172aa,构建了GFP与TetR中间融和蛋白GFP()TR,在E.coli BL21中诱导表达,该融合蛋白失去荧光性质.为了获得对四环素更为敏感的传感器,用易错PCR构建了TR∷GFP和TR∷GFPsm突变体库,初步摸索了平板筛选荧光突变体的方法.3.期刊论文左妍.杨克迁四环素-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建及其活性测定-生物工程学报2005,21(1)将来源于水母的绿色荧光蛋白基因(gfp)和来源于E.coli转座子Tn10的四环素阻遏蛋白基因(tetR)共同构建到E.coli表达载体pET-30a+上,获得TetR C-端与GFP N-端融合蛋白.对经诱导表达并纯化后的融合蛋白(TR::GFP)进行荧光发射光谱分析表明,该融合蛋白保留了GFP的荧光特性,即在395 nm激发下,可在510 nn附近有特征发射峰.在加入四环素后,融合蛋白在395 nm激发下,在400 nm～700nm范围内的发射光谱发生明显变化,荧光强度普遍增加,且以510 nm处最大发射峰增幅最大,由原来1.132增至2.214,而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响不大,结果表明该融合蛋白,能感受外界四环素,并产生一定的荧光变化.4.学位论文邹奇大鼠肝卵圆细胞移植对暴发性肝衰的治疗作用及示踪研究2007目的：建立成年大鼠肝卵圆细胞增殖模型，进一步进行卵圆细胞的分离、纯化、鉴定和培养；利用绿色荧光蛋白基因转染和荧光染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)染色两种方法进行标记，比较两种方法标记细胞的可行性；随后选择较优标记方法标记的卵圆细胞移植治疗暴发性肝功能衰竭大鼠，探索卵圆细胞移植治疗暴发性肝衰的可行性及有效性。
基于绿色荧光蛋白标记技术的植物细胞分化研究
基于绿色荧光蛋白标记技术的植物细胞分化研究植物细胞分化是植物生长发育过程中非常重要的一环，它决定了植物的形态、结构和功能，是保证植物正常生长和发育的关键因素。
绿色荧光蛋白标记技术是一种在生物体中检测或观察特定基因表达的有力工具，在植物细胞分化研究中得到了广泛的应用。
本文将从绿色荧光蛋白标记技术的基础知识、应用原理、研究进展等方面综述其在植物细胞分化研究中的应用。
一、绿色荧光蛋白标记技术的基础知识1.1 绿色荧光蛋白的发现和分离1988年，Osamu Shimomura从蓝色发光水母中发现了绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)。
随后，Martin Chalfie发现了GFP的基因序列，并且成功地将其引入小鼠、斑马鱼等模式生物细胞中，使得这些细胞发出了明亮的绿色荧光，开创了GFP应用于生物学领域的新时代。
1.2 GFP的生化特性GFP是一种含有238个氨基酸的蛋白质，其大约490-510纳米的荧光光谱在黄绿光区域。
GFP内部内嵌着一个主要负责荧光产生的色团环结构，称为荧光色团环(fluorescent chromophore)，这个环结构的形成需要一个称为四肽环化酶的酶的作用，它能够将三个氨基酸(Cys-Tyr-Gly)连接成为一个四肽。
GFP的很多特性可通过改变它的核苷酸序列或蛋白质翻译后的修饰来进行调节。
二、绿色荧光蛋白标记技术在植物细胞分化研究中的应用原理2.1 基于突变筛选的植物细胞分化标记技术透过人工诱变或通过遗传突变等方法，可诱发部分植物基因的表达。
将这些基因与GFP合并编码后在自身植物基因组进行定位分析，可以标记该细胞在植物细胞分化过程中所处的位置或时期。
这种标记方法要求依赖性较高，因为研究者需要对某一个特定的基因进行变异和筛选才能得到标记，且标记区域为固定染色体某一地点。
2.2 基于转基因技术的植物细胞分化标记技术另外一种标记细胞分化的技术，是基于转基因技术，将被研究的目标基因与GFP融合编码构建植物转基因体系，作为一个构建植物转基因体系，标记细胞分化的技术来使用。
绿色荧光蛋白
GFP作为标记蛋白的优点
①荧光稳定 ②检测方便 ③无种属特异性，也无有细胞种类和位置的限制 ④GFP对受体细胞基本无毒害 ⑤易于构建载体，不受假阳性干扰 ⑥不需任何反应底物和辅助因子 ⑦可制成永久标本
蓝色荧光蛋白
双突变体Y66H/Y145F能在381nm光的激发下产生445nm 的蓝光，故称BFP。这种蓝光能进一步激发GFP产生绿光， 即发生荧光共振能量转移现象（FRET） 。
绿色荧光蛋白变异体的发色基团结构
EBFP：增强蓝色荧光蛋白；ECFP：增强蓝绿色荧光蛋白 EGFP：增强绿色荧光蛋白；EYFP：增强黄色荧光蛋白
绿色荧光蛋白的发光基团
Model of the fluorophore and its environment superposed on the MAD-phased electron density map at 2.2 Å resolution. The clear definition throughout the map allowed the chain to be traced and side chains to be well placed. The density for Ser65, Tyr66 and Gly67 is quite consistent with the dehydrotyrosine - imidazolidone structure proposed for the fluorophore. Many of the side chains adjacent to the fluorophore are labeled.
绿色荧光蛋白的应用及其最新研究进展
绿色荧光蛋白的应用及其最新研究进展一、关键词：绿色萤光蛋白、酵母双杂交系统、流式细胞仪、下修村、马丁·查尔菲、钱永健二、背景2008年10月8日，三位美国科学家——伍兹霍尔海洋生物学实验室（Woods Hole Marine Biological Laboratory, MBL）的Osamu Shimomura、哥伦比亚大学（Columbia University）的Martin Chalfie以及加州大学圣地亚哥分校（University of California, San Diego）的钱永健（Roger Y onchien Tsien），因在研究和发现绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）方面做出突出贡献而获得诺贝尔化学奖。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）最早由日裔科学家下村修于1962年在水母（Aequorea victoria ）中发现。
而后马丁·查尔菲则证明了GFP在作为多种生物学现象发光遗传标记方面的应用价值。
钱永健阐明了GFP发光的机制，并且发现了除绿色之外可用于标记的其它颜色。
他对细胞生物学和神经生物学领域的贡献具有划时代的意义。
他的多色荧光蛋白标记技术让科学家能够用不同颜色对多个蛋白和细胞进行标记，从而实现了同时对多个生物学过程进行追踪。
现在，三位科学家的研究成果已经作为标记工具在生物科学中得到广泛应用。
三、GFP的主要性能GFP在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin 的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。
GFP的激发光谱在400nm 附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。
发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰。
在Aequorea victoria 中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，由238个氨基酸残基组成，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb。
绿色荧光蛋白在生物科研中的应用与发展
绿色荧光蛋白在生物科研中的应用与发展绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是一种广泛用于生物科研的工具蛋白，它源自于一种发光生物——海葵。
GFP具有自发的荧光特性，能够发出绿色的荧光信号，并且能够与其他蛋白质一起被观察、追踪。
GFP的发现与利用，为生命科学领域带来了一场革命，被广泛应用于光遗传学、分子标记、细胞成像等多个领域。
在本文中，我们将介绍GFP的应用及其在生物科研中的发展情况。
一、GFP的发现与基本原理1992年，日本科学家下村脩祐在对海葵的研究中，发现有一种名为GFP的蛋白质，它能够在紫外光的照射下自发发出绿色荧光。
1994年，美国生物学家马丁·查尔芬（Martin Chalfie）和罗杰·钱（Roger Tsien）证实了GFP的自发荧光特性，并通过转基因技术成功将GFP导入到非常规高等生物体系中，开创了GFP的应用前景。
GFP的发光原理与其他荧光染料不同，它并不需要诱导剂的作用或化学反应的参与。
GFP的分子结构由238个氨基酸组成，可以自行折叠成一个波浪形的结构，其中蛋白“心脏”的中心是一个色团，称为色素环（chromophore），这个环的结构与化学状态有机会决定了GFP发射绿光荧光的特性。
GFP的发光特性具有“自发、可重复、非侵入性、可监测、可定量化、标记靶点准确”的优点，成为生物科学研究中广泛使用的荧光标记分子。
二、GFP在光遗传学的应用光遗传学是指应用光敏感蛋白和分子工程技术对生物活动进行精准控制和实时监测的技术。
GFP在光遗传学研究中被广泛应用，主要用于驱动离子通道、激酶和离子泵的表达。
通过对这些因子的定向表达，可以研究光敏感信号的传递、光学信息的处理和细胞感知。
GFP的分子可以通过基因克隆技术导入到目标细胞或组织中，与其他光敏感蛋白一起被利用为光敏受体。
结合光学影像技术，研究人员可以通过光刺激来操作蛋白质的表达、离子流动、膜的通透性等，从而研究细胞和生物体系中各种生理或病理情况的变化。
绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用
9、药物研发：在药物研发领域，GFP可以用于标记和追踪目标药物分子。通过 观察GFP的荧光信号，可以研究药物分子的体内分布、药代动力学和毒性等指 标。同时，利用GFP还可以筛选和优化药物作用靶点及候选药物的有效性和安 全性。
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绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用
01 引言
03 GFP的发现
目录
02 研究进展 04 GFP的分类和功能
目录
05 研究现状与不足
07 应用领域
06 未来研究方向
引言
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）是一种重要的生物 标志物，它在生物学研究中被广泛用于标记和追踪目标细胞、蛋白质及其相互 作用。GFP的发现和应用为生物科学研究开辟了新的途径，本次演示将介绍 GFP的研究进展及其在各个领域的应用。
7、发育生物学：在发育生物学领域，GFP可以用于标记和追踪胚胎期和成体期 不同组织的细胞生长、分化和迁移。通过观察GFP的荧光信号，可以研究器官 形成、组织修复和再生等过程。
8、微生物学：在微生物学领域，GFP可以用于标记和追踪细菌、真菌和寄生虫 等微生物。通过观察GFP的荧光信号，可以研究微生物的感染、传播和抗感染 免疫等过程。
GFP的分类和功能
根据来源和结构差异，GFP可以分为多种类型，包括海洋水母型GFP、珊瑚型 GFP、发光细菌型GFP等。这些不同类型的GFP具有不同的光谱特性和应用范围。 其中，海洋水母型GFP具有较高的荧光亮度和良好的溶解性，是生物科学研究 中最常用的类型。
GFP的功能主要包括两个方面：作为报告基因和作为标签蛋白。作为报告基因， GFP可以用于监测基因的表达和蛋白质的定位。作为标签蛋白，GFP可以用于 研究蛋白质的结构和功能，以及细胞生物学中细胞标记、追踪和分选等方面。
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绿色荧光蛋白研究进展动物医学进展,2008,29(1):56259Progress in Veterinary Medicine绿色荧光蛋白研究进展王晓丽1,邵卫星2,单虎13(1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109;2.中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266071)摘要:来源于海洋多管水母属的绿色荧光蛋白(GFP)基因是目前惟一在细胞内稳定表达,在蓝光或长紫外光的激发下,不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光的新型报告基因,无种属、组织和位置特异性,且能监测基因表达、信号转导、共转染、蛋白运输与定位,以及细胞系谱分类等。
GFP对细胞无毒性,且检测方法简单,结果真实可靠,目前在多种原核和真核生物研究中得到广泛的应用。
文章就GFP 的生化特性、GFP的改进及其在分子生物学研究中的应用潜力进行简要阐述。
关键词:绿色荧光蛋白;选择标记基因;应用中图分类号:Q516文献标识码:A文章编号:100725038(2008)0120056204随着生命科学和医学研究的不断深入,研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因,目前常用的报告基因主要有分泌型胎盘磷酸酯酶(secreted embryo alkaline p ho sp hatase, SEA P)基因、β2半乳糖苷酶(galactosidase)基因、β2葡糖苷酸酶(glucosidase,GU S)基因、萤火虫荧光素酶(luciferase,L UC)基因等[1],但这些基因的检测方法并不理想,它们都需要底物和辅助因子,因而在活体中的应用受到限制。
一种全新的非酶性报告基因———绿色荧光蛋白(green fluorescent p rotein, GFP)引起了人们的关注[2],该蛋白能够自身催化形成发色结构并在蓝光激发下发出绿色荧光。
作为报告基因,GFP是能在活细胞中表达的发光蛋白;作为荧光标记分子,GFP既具有敏感的标记检测率,收稿日期:2007210218作者简介:王晓丽(1981-),女,山东威海人,硕士研究生,主要从事预防兽医学研究。
3通讯作者[19] Mammina C,Pontello M,Dal Vecchio A,et al.Identigica2tion of Shigella sonnei biotype g isolates carrying class2inte2 grons in Italy(200122003)[J].J Clin Mirobiol,2005,43:246722470.[20] Mammina C,Aloe A,Romani C,et al.Shigella sonnei bio2type G carrying class2integrons in sout hern Italy:a retro2spective typing study by pulsed gield gel electrophoresis[J].BMC Infect Dis,2006,(6):117.Advance in G ene C assett2Integron System of B acteriaWEI Shu2yong1,WU Deng2hong1,L IU Shi2dong2(1.V eterinary Depart ment,S out hwestern Uni versit y Rongchang Cam pus,Chongqing,402460,China;2.Forest Enterp rise of L inyi,L inyi,S handong,276000,Chi na)Abstract:Gene cassette is a minor2movable deoxyribonucleic acid(DNA)molecule,and usually is t ran2 scribed wit h a integro n.Integron is a conservative and movable transposon2like DNA element,which can make a horizontal transmission of drug resistance gene and has a great cont ribution on t he diff usion of drug resistance gene among bacteria and t he production of multidrug resistance.Since t he concept of gene cas2 sette and integro was p roduced,new types of integron was detected continuously.At p resent,t hree types of integron were generally accepted and named typeⅠ,typeⅡand typeⅢ.TypeⅠintegron has a more de2 tection and deep research.This article summarizesd t he origin,st ruct ure,categorization,expression,bio2 logical detection and t he relationship between bacterial drug resistance and t he recentadvance in gene cas2 sett2integron system of bacteria.K ey w ords:gene cassette;integro;drug resistance又没有放射性的危害。
而且新的研究表明,GFP是一个良好的细胞间信号传递的动态标记分子,可以跟踪观测第二信使[3]。
近来关于GFP 方面的研究和综述越来越多,但多是针对某一方面的特点或应用,本文将GFP基础理论和应用做一简要综述。
1 GFP的生化性质1962年,Shimomura O等首次从多管水母属(Aequorea victoria)中分离纯化出了GFP,随后人们对GFP进行了广泛研究,目前研究得较为深入的是来自多管水母科(Aequorea)和海紫罗兰科(Re2 nilla)的荧光蛋白,即A2GFP和R2GFP。
A2GFP是分子质量为27ku～30ku的蛋白单体,R2GFP是分子质量为54ku的同型二聚体,二者都是酸性球状蛋白质,氨基酸组成相似,发射光谱基本相同,但激发光谱不同。
A2GFP在395nm和470nm具有吸收高峰,R2GFP在498nm具有强烈的光吸收。
只有完整的GFP分子才会产生生物荧光,但与荧光的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为色基(Chromop hore)的部位。
在GFP 的初级氨基酸序列上,第65个至第67个氨基酸(Ser2Tyr2Gly)形成环状六肽三体,以共价形式与GFP蛋白肽键骨架相连[4]。
色基形成的机理目前尚不清楚,但在有分子氧存在的条件下,酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸,并环化形成六肽,这可能是形成色基的必然过程。
Shimo2 mura O最先推导了水母GFP色基结构,后来进行了进一步验证与修改。
GFP的cDNA 克隆序列分析表明,在2.6kb范围内至少分布有3个启动子,组成色基的Ser2Tyr2Gly三体就位于第2个内含子3′端。
GFP用作标记蛋白,具有以下优点:①荧光稳定。
GFP对光漂白有较强的耐受性,能耐受长时间的光照;GFP在p H7～12范围内也能正常发光[5];对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶(链霉蛋白酶Pronase除外)都有较强抗性。
②检测方便。
用荧光显微镜或肉眼就可以观察到,且可进行活体观察,不会损伤正在生长的细胞和组织[6];③无种属特异性,也没有细胞种类和位置的限制,Chalfie M等用PCR 方法扩增GFP cDNA 后,克隆到原核表达载体上,转化大肠埃希菌,经IP T G诱导后,在紫外光照射下转化细菌能发出绿色荧光;④GFP对受体细胞基本无毒害。
Sheen J 等[7]证实在玉米转GFP基因植株中,即使GFP 在细胞中的表达量很高时,对细胞也不会产生明显毒害;⑤不受假阳性干扰。
由于其他生物本身不含有GFP,因此不会出现假阳性结果,GFP作为分子探针可以代替荧光染料避免由于染料扩散造成的定位不准,使结果真实可靠;⑥不需任何反应底物和辅助因子;⑦可制成永久标本。
GFP的荧光可以耐受光漂白,也可耐受福尔马林的固定,因而可制成长期保存的标本;⑧灵敏度高。
GFP标记方法比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分辨率。
尽管GFP基因作为报告基因或分子探针有许多优点,但野生型GFP 发光较弱,其次荧光反应不是酶反应,不能通过添加某些物质来加强信号,且不易对荧光进行定量检测。
另一方面,GFP基因在植物细胞内的表达频率并不高,甚至在某些植物细胞中并不表达。
2 GFP基因的改进目前主要通过以下几个途径得到突变体GFP[8]:①更换GFP生色团氨基酸;②改变碱基组成;③除去GFP基因中隐蔽剪接位点;④插入植物内含子;⑤更换强启动子等突变体GFP;⑥增加荧光强度和热稳定性,促进了生色团的折叠,其荧光特性也得到了改善[9],甚至出现红色、黄绿色、蓝色等多种颜色的荧光蛋白,大大拓宽了GFP研究的领域。
以下是GFP 突变体的部分典型代表:①增强型GFP。
Guohon S等将Ser65用Thr 替代,Phe64用Leu替代,使GFP的荧光强度提高了35倍,而且激发后16h～24h后仍可稳定地测定荧光;②人工GFP。
Zolot ukhin S等改变了wt GFP基因编码区中88个密码子中的92个碱基而用人类基因组中常用的密码子代替,将GFP的荧光强度提高22倍,适合在哺乳动物细胞中高效表达;③红移荧光蛋白。
将wt GFP中的Ser65用Thr替代,得到突变体。
S65T2GFP,激发谱中只有一个峰,且红移至490nm,用蓝光即可激发RSFP,使之更适于普通荧光显微镜观察;④蓝色荧光蛋白。
双突变体Y66H/ Y145F能在381nm光的激发下产生445nm的蓝光,这种蓝光还能进一步激发GFP产生绿光,即发生荧光共振能量转移现象,为不同蛋白质之间及细胞器之间的相互作用研究开辟了更为广阔的视野。
除以上类型的GFP突变体以外,人们还通过定点突变得到了一些可用作指示剂的GFP突变型,如p H 敏感GFP,可被用来测量细胞器或更小颗粒的p H,并记录其变化,最近利用靶入了水母GFP基因的丝蛋白昆虫病毒,感染蚕的幼虫,用改造的基因取代了蚕的正常基因,当蚕吐丝时,这种丝是一种能在黑暗中发绿色荧光的纤维。