实时荧光PCR检测香梨黑斑病菌_王凤军等
五种杀菌剂对梨黑斑病的室内毒力测定
五种杀菌剂对梨黑斑病的室内毒力测定梁魁景; 侯晓杰; 高小宽; 张志强; 欧阳汝欣【期刊名称】《《北方果树》》【年(卷),期】2019(000)002【总页数】3页(P8-10)【关键词】梨黑斑病; 杀菌剂; 室内毒力测定【作者】梁魁景; 侯晓杰; 高小宽; 张志强; 欧阳汝欣【作者单位】衡水学院生命科学系河北衡水 053000【正文语种】中文【中图分类】S436.612.1+4梨黑斑病又称裂果病，是梨树的三大病害之一，由真菌的链格孢菌（Alternaria alternate（Fr.）Keissl）侵染所引起[1]。
侵染可分为春季分生的新孢子引起的初次侵染和由初次侵染后在田间引起再侵染两部分组成[2]。
梨树花期和幼果期是该病潜伏侵染时期，在果实贮藏期间最易发病并且不易控制和防范[3]。
链格孢菌属半知菌亚门链格胞属。
病斑上的黑霉是病菌的分生孢子梗和分生孢子。
分生孢子梗褐至黄褐色，丛生，基部稍粗，上端略细，有分隔。
孢子脱落后有胞痕。
分生孢子串生，倒棍棒形，有纵横分隔，成熟的孢子褐色。
在20～30 ℃之间病原菌能生长， pH 值限定4～12。
在相对湿度为50%～100%时孢子可萌发，在水滴中萌发率最高，其萌发时最适pH 值为7～8[4]。
当前市场上，防治梨黑斑病的杀菌剂出现不少[5]。
有田瑞等报道的10%世高对梨黑斑病有很好防效[6]。
夏景玉等报道了多福悬浮剂对梨黑斑病有较好的控制作用[7]。
蔺经等经过实验认为嘧霉胺对梨黑斑病的防效理想[8]。
白亚梅等报道80%大生M-45 可湿性粉剂对梨黑斑病有较好的防效，防效达95.5%[9]。
付余波等报道，50%异菌脲悬浮剂对梨黑斑病有较好防治效果[10]。
禹明甫等报道，60%百泰可分散粒剂1 500 倍液的药效表现最好，3 次用药后10 d 的防效达到99.79%[11]。
阳延密等通过试验表明，扑海因1 500 倍液对梨黑斑病防效较理想，达82%[12]。
目前防治梨黑斑病的药品杂乱无章，用药选择是多了，但对很多药品都缺乏药效评价，以至于在田间生产时果农不知如何加以辨别和选择。
3种常见金银花致病菌多重实时荧光定量PCR检测方法研究
㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(７):１４５~１５１ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０７.０２０收稿日期:２０２２－１０－０９基金项目:山东省高校中药质量控制与全产业链建设协同创新中心项目(ＣＹＬＸＴＣＸ２０２１－０６)ꎻ山东省创新公共服务平台计划中药分子鉴定公共服务平台项目(２０１８ＪＧＸ１１１)ꎻ山东省农业科学院齐鲁农科英才工程(创新类)项目作者简介:朱桐杉(１９９７ )ꎬ女ꎬ山东临沂人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向:中药资源与质量控制研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｚｔｓ０１１６＠１６３.ｃｏｍ通信作者:张永清(１９６２ )ꎬ男ꎬ山东平邑人ꎬ教授ꎬ主要从事中药资源与质量控制研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｚｙｑ６２２００３＠１２６.ｃｏｍ张全芳(１９７８ )ꎬ女ꎬ甘肃酒泉人ꎬ副研究员ꎬ主要从事中药资源开发与利用ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｚｈｑｕａｎｆａｎｇ＠１６３.ｃｏｍ３种常见金银花致病菌多重实时荧光定量ＰＣＲ检测方法研究朱桐杉１ꎬ刘艳艳２ꎬ谭晴晴２ꎬ刘国霞２ꎬ陈雪燕２ꎬ步迅２ꎬ王文博３ꎬ于子涵１ꎬ４ꎬ张全芳２ꎬ张永清１(１.山东中医药大学药学院ꎬ山东济南㊀２５０３５５ꎻ２.山东省农业科学院农作物种质资源研究所ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ３.山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ４.山东中医药大学附属医院ꎬ山东济南㊀２５００１３)㊀㊀摘要:为了建立可同时检测炭疽病病原菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ)㊁白粉病病原菌(Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ)和褐斑病病原菌(Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ)３种金银花重要叶部病原菌的多重实时荧光定量ＰＣＲ快速检测方法ꎬ本试验基于３种病原菌ＩＴＳ片段序列分别设计特异引物和ＴａｑＭａｎ荧光探针ꎬ并制备重组质粒建立标准曲线ꎻ对建立的多重实时荧光定量ＰＣＲ检测方法进行特异性㊁灵敏度㊁准确性验证ꎮ结果表明ꎬ本研究建立的多重实时荧光定量ＰＣＲ快速检测方法仅针对金银花炭疽病㊁白粉病和褐斑病病原菌有特异性扩增ꎻ最低检测限为２.９４ˑ１０２ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ比普通ＰＣＲ法高１００倍ꎻ利用本方法检测１５份有叶部病害症状的金银花病叶ꎬ与ＤＮＡ测序结果完全一致ꎮ综之ꎬ本研究建立的多重实时荧光ＰＣＲ检测方法特异性强㊁灵敏度高ꎬ为金银花炭疽病㊁白粉病和褐斑病的早期诊断提供了技术支持ꎮ关键词:金银花ꎻ炭疽病ꎻ白粉病ꎻ褐斑病ꎻ多重实时荧光定量ＰＣＲ中图分类号:Ｓ４３５.１２１.４㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０７－０１４５－０７ＳｔｕｄｙｏｎＭｕｌｔｉｐｌｅｘＲｅａｌ￣ＴｉｍｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲＤｅｔｅｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｆｏｒＴｈｒｅｅＣｏｍｍｏｎＬｏｎｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａＰａｔｈｏｇｅｎｓＺｈｕＴｏｎｇｓｈａｎ１ꎬＬｉｕＹａｎｙａｎ２ꎬＴａｎＱｉｎｇｑｉｎｇ２ꎬＬｉｕＧｕｏｘｉａ２ꎬＣｈｅｎＸｕｅｙａｎ２ꎬＢｕＸｕｎ２ꎬＷａｎｇＷｅｎｂｏ３ꎬＹｕＺｉｈａｎ１ꎬ４ꎬＺｈａｎｇＱｕａｎｆａｎｇ２ꎬＺｈａｎｇＹｏｎｇｑｉｎｇ１(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙꎬＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＪｉｎａｎ２５０３５５ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｒｏｐＧｅｒｍｐｌａｓｍＲｅｓｏｕｒｃｅｓꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＱｕａｌｉｔｙＳｔａｎｄａｒｄｓａｎｄＴｅｓｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＪｉｎａｎ２５００１３ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｎ￣ｔｈｒａｃｎｏｓｅ(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ)ꎬｐｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗ(Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ)ａｎｄｂｒｏｗｎｓｐｏｔ(Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ)ｏｆＬｏｎｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａＴｈｕｎｂ.ꎬｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓａｎｄＴａｑＭａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｂａｓｅｄｏｎｔｈｅＩＴＳｆｒａｇｍｅｎｔｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｒｅｅｐａｔｈｏｇｅｎｓꎬａｎｄｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｐｒｅ￣ｐａｒｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓ.Ｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙꎬｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄａｃｃｕｒａｃｙｏｆｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｔｈｒｅｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｗｅｒｅｖｅｒｉｆｉｅｄ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰＣＲｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｏｎｌｙｈａｄｓｐｅｃｉｆｉｃａｍ￣ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｏｆＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓꎬＥｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａａｎｄＣｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ.Ｔｈｅｌｏｗｅｓｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｗａｓ２.９４ˑ１０２ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬｗｈｉｃｈｗａｓ１００ｔｉｍｅｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｏｒｄｉｎａｒｙＰＣＲｍｅｔｈｏｄ.ＦｉｆｔｅｅｎＬｏｎｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａｓａｍｐｌｅｓｗｉｔｈｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆｌｅａｆｄｉｓｅａｓｅｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄꎬｗｈｉｃｈｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ.Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎꎬｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｄｅ￣ｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｈａｄｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙꎬｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｄｔｅｃｈｎｉｃａｌｓｕｐｐｏｒｔｓｆｏｒｔｈｅｅａｒｌｙｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅꎬｐｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗａｎｄｂｒｏｗｎｓｐｏｔｏｆＬｏｎｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＬｏｎｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａＴｈｕｎｂ.ꎻＡｎｔｈｒａｃｎｏｓｅꎻＰｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗꎻＢｒｏｗｎｓｐｏｔꎻＭｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ㊀㊀金银花又名忍冬花ꎬ是忍冬科植物忍冬(Ｌｏｎ￣ｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａＴｈｕｎｂ.)的干燥花蕾或带初开的花[１]ꎬ在我国分布广泛ꎮ主要有效成分为黄酮类[２]㊁环烯醚萜类[３]㊁挥发油类[４]㊁酚酸类等[５]ꎮ其在医药领域中的应用非常广泛ꎬ具有清热解毒㊁通经活络㊁消炎消肿之功效[６]ꎮ随着金银花种植年限的增长ꎬ病虫害也逐渐加重ꎬ以叶部病害和根部病害为主ꎮ其中炭疽病㊁褐斑病和白粉病是最常发生的叶部病害ꎬ褐斑病可导致叶片枯萎脱落ꎻ金银花植株感染白粉病会导致花蕾发育畸形ꎬ严重时会大量落花ꎻ炭疽病侵染茎枝时会使枝条倒伏㊁枯死ꎬ影响植株生长发育ꎬ降低花蕾的产量与品质[７]ꎮ目前对于金银花病害的检测手段较少ꎮ传统的病原菌鉴定方法通常为病原菌分离后经过柯赫氏法则结合分子生物学进行鉴定[８]ꎬ该过程耗时长ꎬ容易延误病害防治时机ꎮ做好金银花病害的早期检测㊁及时开展防治工作ꎬ有效降低化学农药施用量ꎬ对于保证金银花药材产量和质量具有重要意义ꎮ因此建立一种快速㊁准确检测金银花炭疽病㊁褐斑病及白粉病病原菌的方法ꎬ并应用于３种病害的早期防治是当务之急ꎮ前期在山东省临沂市平邑县金银花主产区发现并分离出炭疽病病原菌胶胞杆菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉ￣ｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ)ꎬ并验证了病原菌的致病性[９]ꎬ结合已报道的金银花主要叶部病害褐斑病病原菌鼠李尾孢(Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ)和白粉病病原菌(Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ)ꎬ基于ＩＴＳ序列分别设计了特异引物和ＴａｑＭａｎ探针ꎬ通过优化ＰＣＲ体系和反应条件建立了多重实时荧光ＰＣＲ检测体系ꎬ实现了金银花炭疽病㊁褐斑病和白粉病病原菌的快速㊁准确和高通量检测ꎬ以期为及时有效地防治金银花叶部病害提供技术支持ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料与试剂白粉病病原菌(Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ)㊁炭疽病病原菌胶孢炭疽菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ)㊁褐斑病病原菌鼠李尾孢(Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ)㊁白绢病病原菌(Ｓｅｌｅｒｏｔｉｕｍｒｏｌｆｓｉｉ)㊁黑曲霉(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ)㊁禾谷镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ)㊁金银花叶斑病病原菌(Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍｓｐ.)㊁木霉菌(Ｔｒｉ￣ｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ.)ꎬ保存于山东省农业科学院农作物种质资源研究所ꎻ用于验证试验的金银花病害样本采集于山东中医药大学药用植物园和山东省临沂市平邑县金银花产区ꎮ高效植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒[ＤＰ３５０ꎬ天根生化科技(北京)有限公司]ꎬＤＮＡ分子量ＭａｋｅｒＤＬ２０００[天根生化科技(北京)有限公司]ꎬ真菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒(Ａｘｙｇｅｎ)ꎬ电泳上样缓冲液[宝生物工程(大连)有限公司]ꎮ１.２㊀仪器与设备ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７Ｆｌｅｘ荧光定量ＰＣＲ仪(美国ＡＢＩ)ꎻＴａｋａｒａＰＣＲ仪[宝生物工程(大连)有限公司]ꎻＮａｎｏＤｒｏｐＬｉｔｅ超微量核酸检测仪(赛默飞世尔)ꎻ５４２４Ｄ型高速离心机(Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司)ꎻ凝胶成像仪(Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司)ꎻＵＶ３６００紫外可见分光光度计(日本岛津公司)ꎮ引物和探针序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成ꎮ使用ＱｕａｎｔＳｔｕ￣ｄｉｏＴＭＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲＳｏｆｔｗａｒｅ软件进行绘图ꎮ使用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ软件进行表格制作ꎮ６４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀１.３㊀试验方法１.３.１㊀３种病原菌特异引物及ＴａｑＭａｎ探针设计㊀根据ＧｅｎＢａｎｋ上的鼠李尾孢菌(Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈ￣ａｍｎｉꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号ＭＴ３３８０４２.１)㊁胶孢炭疽菌(ＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号ＭＮ８３３３３５.１)及白粉病病原菌(ＥｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号ＬＣ００９９９２.１)序列ꎬ使用Ｐｒｉｍｅｒｐｒｅｍｉｅｒ５.０软件分别设计引物对和ＴａｑＭａｎ探针ꎮ引物及探针序列见表１ꎮ㊀㊀表１㊀引物和探针序列菌株引物㊁探针名称引物㊁探针序列(５ᶄ－３ᶄ)目的片段长度(ｂｐ)胶孢炭疽菌白粉病病原菌鼠李尾孢菌Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ－ＦＡＧＴＴＴＡＣＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＣＣＴＴＴＧＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ－ＲＴＴＡＴＴＴＧＣＴＴＧＴＡＣＣＡＣＴＣＡＧＡＡＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ－ＰＲＯＸ－ＴＡＡＣＴＧＴＴＧＣＴＴＣＧＧＣＧＧＧＴＡＧＧ－ＢＨＱ２Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ－ＦＣＧＡＴＴＴＧＴＡＴＣＴＴＧＴＴＧＣＴＴＴＧＥｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ－ＲＡＡＣＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＧＴＴＡＧＧＴＣＴＥｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ－ＰＦＡＭ－ＡＴＧＴＣＧＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＣＡＡＧ－ＢＨＱ２Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ－ＦＧＡＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＧＣＡＣＡＴＴＧＣｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ－ＲＡＴＧＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＧＣＴＴＡＧＡＧＡＣｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ－ＰＪＯＥ－ＴＣＡＴＴＴＣＡＣＣＡＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＧ－ＢＨＱ２１６５１２４１６０㊀㊀注:探针中ＲＯＸ㊁ＦＡＭ及ＪＯＥ为３种不同荧光染料ꎻＢＨＱ２为荧光淬灭基团ꎮ１.３.２㊀多重实时荧光ＰＣＲ体系构建㊀多重实时荧光ＰＣＲ反应体系(２０μＬ):２ˑＴａｑＭａｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μＬꎬ炭疽病病原菌上㊁下游引物和探针各１μＬꎬ白粉病病原菌上㊁下游引物和探针各１μＬꎬ褐斑病病原菌上㊁下游引物和探针各１μＬꎬＤＮＡ模板１μＬꎮ褐斑病引物和探针的终浓度分别为０.５０μｍｏｌ/Ｌ和０.４０μｍｏｌ/Ｌꎬ白粉病引物和探针的终浓度为０.５０μｍｏｌ/Ｌ和０.４０μｍｏｌ/Ｌꎬ炭疽病病原菌引物和探针的终浓度为０.２５μｍｏｌ/Ｌ和０.１０μｍｏｌ/Ｌꎮ多重实时荧光ＰＣＲ扩增条件:９５ħ２ｍｉｎꎻ９５ħ１０ｓꎬ６０ħ３５ｓ(在此阶段收集荧光信号)ꎬ４０个循环ꎮ１.３.３㊀重组质粒的构建㊀使用１.３.１中金银花褐斑病㊁白粉病及炭疽病病原菌特异引物进行基因扩增ꎬ参考李敏[１０]的方法进行重组质粒构建ꎬ对重组质粒ＰＣＲ产物进行测序ꎬ验证是否正确插入目的片段ꎮＤＮＡ测序在山东省农业科学院农作物种质资源研究所进行ꎮ１.３.４㊀实时荧光ＰＣＲ标准曲线建立㊀使用ＵＶ３６００紫外分光光度计测定３种病原菌阳性重组质粒ＤＮＡ浓度ꎬ将重组质粒ＤＮＡ定量至２.９４ˑ１０８ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ按照１０倍梯度稀释成６个浓度ꎬ每个梯度３次重复ꎮ反应体系与程序按照１.３.２进行ꎮ根据重组质粒拷贝数初始量值和阈值循环数(Ｃｔ)进行多重实时荧光ＰＣＲ体系标准曲线的构建ꎮ１.３.５㊀引物和探针特异性检测㊀分别以胶孢炭疽菌㊁鼠李尾孢菌㊁白粉病病原菌㊁白绢病病原菌㊁木霉菌㊁禾谷镰刀菌㊁金银花叶斑病病原菌㊁黑曲霉的基因组ＤＮＡ为模板ꎬ按１.３.２中多重实时荧光ＰＣＲ反应条件及反应体系进行检测ꎬ每个样本３次重复ꎬ验证引物和探针的特异性ꎮ１.３.６㊀多重实时荧光ＰＣＲ方法灵敏度验证㊀将重组质粒ＤＮＡ定量至２.９４ˑ１０８ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ按照１０倍梯度依次稀释８个浓度ꎬ每个浓度重复３次ꎬ根据荧光信号值大小ꎬ评价相应引物和探针对３种病原菌的检测灵敏度ꎮ同时以此ＤＮＡ模板和表１中特异引物进行普通ＰＣＲ扩增ꎬ每个浓度重复２次ꎮ普通ＰＣＲ扩增体系:１０ˑｂｕｆｆｅｒ２.５μＬ㊁ｄＮＴＰ(２.５ｍｍｏｌ/Ｌ)２.０μＬ㊁Ｔａｑ酶(５Ｕ)０.２μＬ㊁上下游引物(１０μｍｏｌ/Ｌ)各１.０μＬ㊁ＤＮＡ模板(１~１０ｎｇ/μＬ)２.０μＬꎬｄｄＨ２Ｏ１６.３μＬꎻ扩增程序:９５ħ３ｍｉｎꎻ９５ħ３０ｓꎬ５６ħ３０ｓꎬ７２ħ３０ｓꎬ３０个循环ꎻ７２ħ１０ｍｉｎꎮ１.３.７㊀验证试验㊀利用本研究建立的３种病原菌多重实时荧光ＰＣＲ检测方法对从临沂市平邑县金银花产区㊁山东中医药大学药用植物园采集的１５份叶部病害样本进行检测ꎬ同时提取样本ＤＮＡ㊁使用真菌通用引物ＩＴＳ１:５ᶄ－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴ￣ＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３ᶄꎬＩＴＳ４:５ᶄ－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴ￣ＧＡＴＡＴＧＣ－３ᶄ进行ＰＣＲ扩增ꎬ切胶回收并测序ꎮ将两种检测方法的结果进行比较ꎬ以验证本研究所建立的多重实时荧光ＰＣＲ方法的准确性与可行性ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀实时荧光ＰＣＲ标准曲线建立以重组质粒拷贝数初始量值为横坐标ꎬＣｔ值为纵坐标ꎬ得到褐斑病线性回归方程为ｙ＝－３.２９６ｘ＋４０.２３４ꎬＲ２＝０.９９８ꎻ白粉病线性回归方程为ｙ＝－３.３７４ｘ＋４０.３７４ꎬＲ２＝０.９９６ꎻ炭疽病线性回７４１㊀第７期㊀㊀㊀㊀朱桐杉ꎬ等:３种常见金银花致病菌多重实时荧光定量ＰＣＲ检测方法研究归方程为ｙ＝－３.４７０ｘ＋４３.０９２ꎬＲ２＝０.９９６(图１)ꎮ３种病原菌实时荧光ＰＣＲ标准曲线相关系数均大于０.９９ꎬ扩增效率均接近１００％ꎬ标准曲线横纵坐标间形成良好线性关系ꎬ表明该方法具有效性ꎮＡ:褐斑病病原菌标准曲线图ꎻＢ:白粉病病原菌标准曲线图ꎻＣ:炭疽病病原菌标准曲线图ꎮ图１㊀３种病原菌实时荧光ＰＣＲ标准曲线图２.２㊀引物和探针特异性验证按照１.３.５方法进行特异性验证ꎬ当ＲＯＸ荧光修饰探针有扩增曲线且满足Ｃｔɤ３５时ꎬ说明待检样本检出炭疽病病原菌ꎻ当ＦＡＭ荧光修饰探针有扩增曲线且满足Ｃｔɤ３５时ꎬ说明待检样本检出白粉病病原菌ꎻ当ＪＯＥ荧光修饰探针有扩增曲线且满足Ｃｔɤ３５时ꎬ说明待检样本检出褐斑病病原菌ꎻ当ＦＡＭ㊁ＪＯＥ和ＲＯＸ荧光修饰探针均无扩增曲线时ꎬ表明该检测样品为阴性ꎮ由表２可知ꎬ本试验建立的多重实时荧光定量ＰＣＲ方法只能特异扩增目的病原菌ꎬ对其他病原菌均无扩增ꎬ说明本研究建立的多重实时荧光定量ＰＣＲ体系的引物及探针的特异性良好ꎮ㊀㊀表２㊀引物及探针特异性验证试验病原名称炭疽病病原探针(ＲＯＸ)Ｃｔ值白粉病病原探针(ＦＡＭ)Ｃｔ值褐斑病病原探针(ＪＯＥ)Ｃｔ值结果判定炭疽病病原菌１６.２５ʃ０.１４ＮＮ炭疽病病原菌阳性白绢病病原菌ＮＮＮＮ褐斑病病原菌ＮＮ１５.８７ʃ０.４５褐斑病病原菌阳性木霉菌ＮＮＮＮ禾谷镰刀菌ＮＮＮＮ金银花叶斑病病原菌ＮＮＮＮ白粉病病原菌Ｎ１４.２５ʃ０.０４Ｎ白粉病病原菌阳性黑曲霉ＮＮＮＮ㊀㊀注: Ｎ 表示阴性ꎮ２.３㊀检测灵敏度多重实时荧光定量ＰＣＲ检测方法和普通ＰＣＲ法对金银花褐斑病㊁白粉病和炭疽病３种病原菌灵敏度验证结果见图２Ａ㊁Ｂ㊁Ｃꎮ３组重组质粒在浓度２９.４ｃｏｐｉｅｓ/μＬ时ꎬＣｔ值>３５ꎬ因此多重实时荧光定量ＰＣＲ法对３种病原菌检测最低检８４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀测限为２.９４ˑ１０２ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎻ在普通ＰＣＲ扩增中ꎬ当模板ＤＮＡ浓度为２.９４ˑ１０４ｃｏｐｉｅｓ/μＬ时有明显扩增条带ꎬ低于此浓度则无扩增条带ꎬ因此普通ＰＣＲ法检测灵敏度为２.９４ˑ１０４ｃｏｐｉｅｓ/μＬ(图２Ｄ)ꎮ结果表明ꎬ本试验建立的多重实时荧光ＰＣＲ检测方法的灵敏度比普通ＰＣＲ法高１００倍ꎮ２.４㊀验证试验分别使用本试验建立的检测方法和ＤＮＡ测序法对实际样本进行检测ꎬ多重实时荧光定量ＰＣＲ结果检测出炭疽病病原菌阳性样本４份㊁白粉病阳性样本５份㊁褐斑病阳性样本６份ꎬ检出率为１００％ꎬ与ＤＮＡ测序结果完全一致(表３)ꎮ㊀㊀表３㊀实际样本检测结果样品编号ＤＮＡ测序结果中文名称多重实时荧光ＰＣＲ结果１Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ胶孢炭疽菌炭疽病病原菌阳性２Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ胶孢炭疽菌炭疽病病原菌阳性３Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ胶孢炭疽菌炭疽病病原菌阳性４Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ胶孢炭疽菌炭疽病病原菌阳性５Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ白粉病病原菌白粉病病原菌阳性６Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ白粉病病原菌白粉病病原菌阳性７Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性８Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ白粉病病原菌白粉病病原菌阳性９Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性１０Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性１１Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性１２Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ白粉病病原菌白粉病病原菌阳性１３Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ白粉病病原菌白粉病病原菌阳性１４Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性１５Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性９４１㊀第７期㊀㊀㊀㊀朱桐杉ꎬ等:３种常见金银花致病菌多重实时荧光定量ＰＣＲ检测方法研究Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ分别为褐斑病㊁白粉病㊁炭疽病灵敏度检测图ꎻ图Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ中１~８质粒浓度分别为２.９４ˑ１０８㊁２.９４ˑ１０７㊁２.９４ˑ１０６㊁２.９４ˑ１０５㊁２.９４ˑ１０４㊁２.９４ˑ１０３㊁２.９４ˑ１０２㊁２９.４ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎻ图Ｄ中孔１~６所用质粒浓度分别为２.９４ˑ１０８㊁２.９４ˑ１０７㊁２.９４ˑ１０６㊁２.９４ˑ１０５㊁２.９４ˑ１０４㊁２.９４ˑ１０３ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ７为阴性对照ꎬＭ为ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒꎮ图２㊀３种病原菌多重实时荧光定量ＰＣＲ(Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ)和常规ＰＣＲ(Ｄ)扩增体系灵敏度３㊀讨论与结论金银花为山东道地药材之首ꎬ主产于山东省临沂市平邑县ꎮ以花入药ꎬ药用历史悠久ꎮ性味甘寒ꎬ气味芳香ꎬ有清透疏表㊁清热解毒之效ꎮ亦可食用ꎬ具有一定的保健功能ꎬ老少皆宜ꎮ传统植物病原菌通常使用组织分离法结合ＤＮＡ测序法进行鉴定ꎬ如紫薯腐败菌的分离和鉴定[１１]㊁马铃薯赤霉病病原菌的分离和鉴定[１２]等ꎬ耗费时间较长ꎮ实时荧光定量ＰＣＲ法可实现数个样品的自动化检测ꎬ成本低ꎬ较普通ＰＣＲ技术所用时间短ꎬ能在病害初期进行快速检测[１３]ꎮ目前已经建立了柑橘枯萎病病毒[１４]㊁橄榄果实中敏感炭疽菌[１５]等实时荧光定量ＰＣＲ检测方法ꎮ褐斑病㊁白粉病及炭疽病是常见的３种金银花叶部病害ꎬ也是导致金银花减产㊁降质的重要原因ꎮ感染白粉病时ꎬ叶部绿原酸含量降低[１６]ꎻ褐斑病㊁炭疽病发病后期ꎬ斑点融合导致叶片呈现圆形或不规则病斑ꎬ严重时会导致全株叶片脱落㊁植株枯死[１７ꎬ１８]ꎬ且病害后期致病菌可停留在土壤及病残体中越冬ꎮ李志红等[１９]对封丘金银花炭疽病染病植株叶片进行分离和检测ꎬ得到炭疽病病原菌为胶孢炭疽菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉ￣ｏｉｄｅｓ)ꎻ研究表明金银花褐斑病病原菌为半知菌亚门鼠李尾孢(Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ)㊁金银花白粉病病原菌为Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ[２０ꎬ２１]ꎮ目前对３种金银花病害的研究还停留在发病症状调查和病原菌分离鉴定阶段ꎬ防治措施是在叶部出现明显症状后进行喷洒农药或剪去带病枝条[２２ꎬ２３]ꎬ而针对３种病害的分子检测方法还未见报道ꎮ实时荧光定量ＰＣＲ技术具有操作简便㊁快速高效㊁高通量㊁高敏感性等特点ꎬ在分子诊断㊁动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛应用ꎬ提高了检测时效性和灵敏度ꎮ多重实时荧光定量ＰＣＲ方法可在同一个检测体系中对多个目标序列同时进行检测ꎬ且能精确定量ꎮ如利用实时荧光逆转录定量ＰＣＲ技术快速检测香蕉的枯萎芽孢杆菌[２４]㊁菊花的花叶白锈菌及褐锈菌[２５]㊁马铃薯中常见疮痂病及病原菌[２６]以及检测羊奶中牛奶和大豆源性成分[２７]ꎮ本研究基于ＩＴＳ序列设计引物与ＴａｑＭａｎ探针ꎬ建立了可同时检测金银花褐斑病㊁白粉病及炭０５１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀疽病３种病害病原菌的多重实时荧光ＰＣＲ检测体系ꎬ该方法最低检测限度为２.９４ˑ１０２ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ比普通ＰＣＲ方法提高１００倍ꎬ特异性强ꎬ可为金银花叶部病害早诊断㊁早防治提供技术支持ꎬ弥补了金银花炭疽病㊁褐斑病及白粉病病害检测方法的缺失ꎮ但本试验未曾对多种病害同时检测进行实际样本验证ꎬ对于病原菌的鉴定停留在定性层面而未进行定量计算ꎬ因此关于多种病原菌的同时检测及其定量分析是下一步研究重点ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典[Ｍ].北京:中药医药科技出版社ꎬ２０２０.[２]㊀ＷｕＪꎬＷａｎｇＸＣꎬＬｉｕＹꎬｅｔａｌ.ＦｌａｖｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｓｆｒｏｍＬｏｎｉｃｅ￣ｒａｊａｐｏｎｉｃａａｎｄＬ.ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓｒｅｖｅａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｆｌａｖｏｎｅａｃ￣ｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｓｃｉ.Ｒｅｐ.ꎬ２０１６ꎬ６:１９２４５.[３]㊀ＧｏłｂａＭꎬＳｏｋół￣ŁęｔｏｗｓｋａＡꎬＫｕｃｈａｒｓｋａＡＺ.Ｈｅａｌｔｈｐｒｏｐｅｒ￣ｔｉｅｓａｎｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅｂｅｒｒｙＬｏｎｉｃｅｒａｃａｅｒｕｌｅａＬ.ａｎｕｐｄａｔｅｏｎｒｅｃｅｎｔｓｔｕｄｉｅｓ[Ｊ].Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０２０ꎬ２５(３):７４９. [４]㊀ＴａｎｇＸＰꎬＬｉｕＸＧꎬＺｈｏｎｇＪＦꎬｅｔａｌ.ＰｏｔｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＬｏｎｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａｅｘｔｒａｃｔｓｉｎａｎｉｍａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ:ｆｒｏｍｔｈｅｐｅｒ￣ｓｐｅｃｔｉｖｅｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｈｅａｌｔｈ[Ｊ].Ｆｒｏｎｔ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.ꎬ２０２１ꎬ１２:７１９８７７.[５]㊀ＢｉＺＨꎬＺｈａｏＹꎬＨｕＪＨꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＬｏｎｉｃｅｒａｅｊａｐｏｎｉｃａｅＣａｕｌｉｓ:ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ￣ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ[Ｊ].ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙ￣ｍｅｒｓꎬ２０２２ꎬ２９２:１１９６７４.[６]㊀熊乐文ꎬ金莹ꎬ黄玮慕ꎬ等.金银花色泽与酚酸类成分含量相关性研究[Ｊ].中成药ꎬ２０２２ꎬ４４(８):２７３６－２７３９. [７]㊀杨帆ꎬ刘玉霞ꎬ李炯ꎬ等.忍冬枝枯病对忍冬药材产量和质量的影响[Ｊ].中国实验方剂学杂志ꎬ２０１８ꎬ２４(２０):３２－３７. [８]㊀ＺｈａｎｇＬꎬＬｉＸＨꎬＺｈｏｕＹＹꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃ￣ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐｅｃｉｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＣａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｉｎＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｅꎬＣｈｉｎａ[Ｊ].ＰｌａｎｔＤｉｓ.ꎬ２０２１ꎬ１０５(９):２６４９－２６５７.[９]㊀朱桐杉ꎬ谭晴晴ꎬ刘国霞ꎬ等.金银花炭疽病病原菌的分离鉴定和ｑＰＣＲ检测[Ｊ].中药材ꎬ２０２２ꎬ４５(１１):２５５６－２５６１. [１０]李敏.北柴胡成花基因克隆及时空表达模式分析[Ｄ].济南:山东中医药大学ꎬ２０２１.[１１]刘绪ꎬ郑运ꎬ黄潇漪ꎬ等.紫薯腐败菌的分离与鉴定[Ｊ].食品安全质量检测学报ꎬ２０２２ꎬ１３(１６):５２９７－５３０４. [１２]ＤｕａｎＹＨꎬＱｕＷＷꎬＣｈａｎｇＳＸꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐａｔｈ￣ｏｇｅｎｉｃｉｔｙｇｒｏｕｐｓａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｓｅｓａｍｉｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏ￣ｇｙꎬ２０２０ꎬ１１０(５):１０９３－１１０４.[１３]ＭｃＣａｒｔｎｅｙＨＡꎬＦｏｓｔｅｒＳＪꎬＦｒａａｉｊｅＢＡꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｉ￣ａｇｎｏｓｔｉｃｓｆｏｒｆｕｎｇａｌｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｓ[Ｊ].ＰｅｓｔＭａｎａｇ.Ｓｃｉ.ꎬ２００３ꎬ５９(２):１２９－１４２.[１４]ＳａｐｏｎａｒｉＭꎬＺｉｃｃａＳꎬＬｏｃｏｎｓｏｌｅＧꎬｅｔａｌ.ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣｉｔｒｕｓｔｒｉｓｔｅｚａｖｉｒｕｓａｎｄｃｏｉｎｆｅｃｔｉｎｇｖｉｒｏｉｄｓ[Ｊ].ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ.Ｂｉｏｌ.ꎬ２０１９ꎬ２０１５:６７－７８.[１５]Ａｚｅｖｅｄｏ￣ＮｏｇｕｅｉｒａＦꎬＧｏｍｅｓＳꎬＬｉｎｏＡꎬｅｔａｌ.Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍａｃｕｔａｔｕｍｓｅｎｓｕｓｔｒｉｃｔｏｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｏｌｉｖｅｆｒｕｉｔｓａｍｐｌｅｓ[Ｊ].ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０２１ꎬ３３９:１２７８５８. [１６]陈美兰ꎬ刘红彦ꎬ李琴ꎬ等.白粉病发生程度对金银花药材中绿原酸含量的影响[Ｊ].中国中药杂志ꎬ２００６(１０):８４６－８４７.[１７]赵健飞ꎬ樊博.药用植物金银花病虫害的发生及综合防治技术[Ｊ].河南农业ꎬ２０１０(１６):４９－５０.[１８]付嵘.金银花炭疽病的初步研究[Ｄ].雅安:四川农业大学ꎬ２０１２.[１９]李志红ꎬ翟凤艳ꎬ张永霞ꎬ等.封丘金银花炭疽病病原的分离和鉴定[Ｊ].河南科技学院学报(自然科学版)ꎬ２０１９ꎬ４７(２):２０－２３.[２０]ＢｒａｄｓｈａｗＭꎬＢｒａｕｎＵꎬＧöｔｚＭꎬｅｔａｌ.Ｔａｘｏｎｏｍｙａｎｄｐｈｙｌｏｇｅ￣ｎｙｏｆｔｈｅＥｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａｅｃｏｍｐｌｅｘ(ＨｅｌｏｔｉａｌｅｓꎬＥｒｙｓｉｐｈａｃｅ￣ａｅ)ｏｎＬｏｎｉｃｅｒａｓｐｐ.[Ｊ].ＦｕｎｇａｌＳｙｓｔ.Ｅｖｏｌ.ꎬ２０２１ꎬ７:４９－６５. [２１]王馨.药用植物金银花常见病虫种类及防治方法[Ｊ].农技服务ꎬ２０１４ꎬ３１(２):７７.[２２]王瑞娟ꎬ张立秋.金银花的主要病虫害及其防治[Ｊ].河北林业科技ꎬ２００６(５):６６－６７.[２３]欧善生ꎬ苏桂花ꎬ谢恩倍ꎬ等.金银花主要病虫害综合防治研究[Ｊ].广东农业科学ꎬ２０１１ꎬ３８(５):９０－９４.[２４]ＬｉＳꎬＨｅＰꎬＦａｎＨＣꎬｅｔａｌ.Ａｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｇｅ￣ｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｓᶄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＦｕｓａｒｉｕｍｗｉｌｔｏｆｂａ￣ｎａｎａｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎＢａｃｉｌｌｕｓ[Ｊ].Ｊ.Ｆｕｎｇｉ(Ｂａｓｅｌ)ꎬ２０２１ꎬ７(５):３５３.[２５]ＤｅｍｅｒｓＪＥꎬＣｒｏｕｃｈＪＡꎬＣａｓｔｌｅｂｕｒｙＬＡ.Ａｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＰｕｃｃｉｎｉａｈｏｒｉａｎａａｎｄＰ.ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉｏｎｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ[Ｊ].ＰｌａｎｔＤｉｓ.ꎬ２０１５ꎬ９９(２):１９５－２００.[２６]ＱｕＸＳꎬＷａｎｎｅｒＬＡꎬＣｈｒｉｓｔＢＪ.Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ(ＴａｑＭａｎ)ａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｃｒｉｍｉｎａ￣ｔｉｏｎｏｆｐｏｔａｔｏｐｏｗｄｅｒｙａｎｄｃｏｍｍｏｎｓｃａｂｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｓ[Ｊ].Ｊ.Ａｐｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.ꎬ２０１１ꎬ１１０(３):７６９－７７７. [２７]范阳阳ꎬ张荦嘉ꎬ刘艳艳ꎬ等.一种从羊奶中检测牛奶和大豆成分多重实时荧光定量ＰＣＲ方法的建立[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０１６ꎬ４８(６):１１８－１２３.１５１㊀第７期㊀㊀㊀㊀朱桐杉ꎬ等:３种常见金银花致病菌多重实时荧光定量ＰＣＲ检测方法研究。
5种化学药剂对梨黑斑病菌的室内防治研究
5种化学药剂对梨黑斑病菌的室内防治研究作者：李洪坤王芳芳于占晶侯晓杰梁魁景来源：《果树资源学报》2023年第06期收稿日期：2023-07-10中文收稿日期基金项目：衡水市科技计划资助项目（2022014026Z）；河北省现代农业产业技术体系梨产业创新团队建设衡水综合试验推广站（HBCT2021210402）;河北省高等学校科学技术研究项目（ZC2023143）。
第一作者简介：李洪坤（1986-），男，本科，助理实验师，主要从事园林植物病虫害防治等研究工作。
*通信作者：于占晶（1984-），女，农学硕士，讲师，主要从事植物病虫害研究工作。
E-mail：*******************摘要：【目的】梨树的病虫害严重影响着梨产业的发展，由链格孢真菌侵染引起的梨黑斑病是侵染梨树的主要病害之一，为筛选出预防和治疗梨黑斑病的高效化学药剂，开展了5种化学药剂对梨黑斑病菌的室内防效试验。
【方法】从常用的药剂中挑选10%中生·寡糖素、1.26%辛菌胺醋酸盐、15%络氨铜、20%吡唑醚菌酯和60%多菌灵5种化学药剂，采用体外接种法对梨黑斑病进行室内防治效果研究。
【结果】5种化学药剂对梨黑斑病的生长都有一定的防治作用，但预防和治疗的效果不同。
其中预防效果最好的是20%吡唑醚菌酯，在浓度为1 000 mg/L时，其病斑平均直径为0.12 mm，防效达到94.8%，EC50为3.312 01 mg/L；其次为1.26%辛菌胺醋酸盐、15%络氨铜和60%多菌灵，在浓度1 000 mg/L時，防效分别为90.1%、69.1%和60.1%；预防作用最差的是10%中生·寡糖素，在浓度62.5 mg/L时，其病斑平均直径为1.67 mm，防效仅为28.3%，EC50为334.470 mg/L。
治疗效果最好的为20%吡唑醚菌酯，在浓度1 000 mg/L时，其菌落生长量平均直径为0.27 mm，抑制率达到了77.5%；最差的是60%多菌灵，在浓度62.5 mg/L时，抑制率为-6.7%。
实时荧光定量PCR快速检测四种蛀果性害虫
实时荧光定量PCR快速检测四种蛀果性害虫王凤军;刘莎莎;冯俊丽【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(000)002【摘要】Laspeyresia pomonella, Euzophera pyriella Yang, Grapholitha molesta and Blank cutworm are important pets of fragrant pears and other fruits in Xinjiang, and they are also internationally important pests on inspection and quarantine. However, the identification relies mainly on morphological characters up to date. The lack of molecular detection methods greatly limits the international export trading of fragrant pears and related products. The 16S rDNA COI fragments from the four pests were cloned and sequenced. Then, specific primers and probes were designed according to the sequencing data, and the fluorescence Real-time quantification PCR detection system was established. The results demonstrates the limits of detection concentration of Laspeyresia pomonella, Euzophera pyriella Yang, Grapholitha molesta and Blank cutworm in this system are respectively 1.605×10-2,0.729×10-2,0.475×10-2 and 0.818×10-2 ng/μL, meeting the deman d of inspection and quarantine routine testing. To overcome the residual bodies of some insects and some pieces mixed samples, or several insects together mixed samples appeared in actual testing process, DNA extracted from single, multiple and mixed pest samples were detected and evaluated, furtherverifying the specificity of this method, the reliability and applicability.%苹果蠹蛾、香梨优斑螟、梨小食心虫及地老虎是危害新疆香梨等产品的重要害虫，前3种也属于国际上检验检疫重要虫害。
梨园气溶胶中梨火疫病菌的定量检测
梨园气溶胶中梨火疫病菌的定量检测作者：荆琚王杰花韩丽丽陈卫民吴品珊雷荣来源：《植物保护》2023年第06期关键词：梨园；气溶胶；梨火疫病菌；定量检测解淀粉欧文氏菌Erwinia arnylouora被列为我国重大检疫性细菌，其引起的梨火疫病于2015年6月首次在新疆伊犁地区霍城县发现并暴发流行，现已蔓延至新疆14个地州（市），严重危害梨、苹果、山楂、海棠、榀椁等果树，尤其在库尔勒香梨上传播极为迅速，给新疆乃至全国林果产业带来严重威胁。
2017年，苹果在中国的种植面积约222万hm2，产量382万t；梨种植面积约107万hm2，产量1289万t，种植面积和产量均为世界第一。
我国梨每年的出口值超过2亿美元，是世界上最大的梨出口国之一，也是我国农业重要的经济来源之一。
因此，梨火疫病害一旦传播至国内其他省份，将造成巨大损失。
细菌、真菌、病毒、噬菌体等微生物可附着在气溶胶包含的固体或液体颗粒上，以独立个体或聚集体的形式在空气中扩散，造成病原微生物的长距离传播和入侵。
迄今，大部分研究认为梨火疫病菌主要通过伤口、自然孔口和花侵入寄主，进而侵染韧皮部组织、花丝及柱头，引起组织发病，而通过在种植苹果的模拟苗圃中研究风雨形成的气溶胶在梨火疫病传播流行中的作用，发现大多数疫情都与流行之前发生的风暴有关。
梨火疫病菌在相对湿度为40%～90%的空气粒子中可存活较长时间。
目前自然条件下国内梨园气溶胶携带梨火疫病菌情况未见报道。
因此，本研究于2019年-2021年收集了新疆库尔勒市人和农场‘香梨’园中的气溶胶，对其中可能携带的梨火疫病菌进行检测，为掌握梨火疫病的传播途径提供技术依据，对库尔勒香梨产业的可持续发展具有理论和实践意义。
1材料与方法1.1试验材料1.1.1梨园基本概况试验地位于新疆巴州库尔勒人和农场，共12个梨园，经纬度：41°40'N～41°49'N，85°59'E～85°47'E，海拔：907.5～928m，株行距：3m×5m，每个梨园面积0.67hm2，共计8.04 hm2。
香梨黑斑病原生物学及室内药剂试验
含有３ ０毫 升的 Ｐ Ｋ液体培 养基 （Ｓ ０ Ｓ Ｐ Ｉ培养基 ：ｏ ２ ０克 土豆 ，Ｏ克蔗糖 ， Ｋ Ｈ Ｏ 加水至 ｌ ） ３ １克 ２ Ｐ ， 升 的三角瓶 中， 每瓶接种 ３块 ， ２ ℃摇床培养 ５ ７ 置 ６ ￣ 天备用。
一
、
材 料 与 方 法
培 养液用 ４层纱 布过 滤 ，滤液置 于 电热 炉上 加热 至
１ 验 材料 ． 试
沸腾 ，０ 钟后冷却 备用 。 １分 采用 针刺法 将粗毒 素接种
供 试 菌株从 库 于库尔 勒香 梨果 实表面 ， 菌水 做 对照 ， 种后 置 于 无 接 保湿缸 内保湿培 养 ， ７天后观 察发病 情况 。
，
普通 为短棍 棒状 ， 基部 膨大 ， 顶端 细小 ， 往有 较 往
长的嘴胞 ， 横隔膜 ０ １ 有 — １个 ， 隔 膜 Ｏ ５个 ， 小 纵 一 大
１－ ０ 米× ～ ２ 米 ， ０７ 微 ６２ 微 隔膜所 在处 略缢 缩 。老熟 的
分 生孢 子 ， 较厚 ， 色 ； 嫩 的分 生 孢子 则 壁薄 ， 壁 暗褐 幼
温度 下培 养， 分不 同 时问段 随 机取 样 镜检 观 察 ， 每个 处理检查 １ 视野， ０个 观察每 个视野 下孢子 数 ， 记录 并 孢子萌 发率 。
５不 同 药 剂 对 孢 子 萌发 的 抑 制 作 用 ．
将供 试 的 ８种杀 菌剂 稀释成 比所 需 稀 释倍数 高 ｌ倍 的 药 液 与 孢 子 悬 浮 液 等 量 混 合 得 到 ５ ０ ８ ０ ０ 、０ 、
② 不 同营养 物质对 链格孢 菌 的影 响 取 １ ２滴 —
可 分散 粒 剂 ，５ ２ ％阿 米西 达悬 浮 剂 ，０ ３ ％克霉 灵 可 湿 性 粉剂 ，０ ８ ％代 森 锰锌 可湿 性 粉 剂 ，０ ７ ％甲基 硫 菌灵 可湿 性 粉剂 ，０ ７ ％百菌 清 可湿 性粉 剂 ，０ ７ ％甲基 托 布
3种常见金银花致病菌多重实时荧光定量PCR检测方法研究
3种常见金银花致病菌多重实时荧光定量PCR检测方法研究
作者：朱桐杉刘艳艳谭晴晴刘国霞陈雪燕步讯王文博于子涵张全芳张永清
来源：《山东农业科学》2023年第07期
摘要：為了建立可同时检测炭疽病病原菌、白粉病病原菌和褐斑病病原菌3种金银花重要叶部病原菌的多重实时荧光定量PCR快速检测方法，本试验基于3种病原菌ITS片段序列分别设计特异引物和Taq Man荧光探针，并制备重组质粒建立标准曲线；对建立的多重实时荧光定量PCR检测方法进行特异性、灵敏度、准确性验证。
结果表明，本研究建立的多重实时荧光定量PCR快速检测方法仅针对金银花炭疽病、白粉病和褐斑病病原菌有特异性扩增；最低检测限为2.94x102 copies/uL，比普通PCR法高100倍；利用本方法检测15份有叶部病害症状
的金银花病叶，与DNA测序结果完全一致。
综之，本研究建立的多重实时荧光PCR检测方法特异性强、灵敏度高，为金银花炭疽病、白粉病和褐斑病的早期诊断提供了技术支持。
关键词：金银花；炭疽病；白粉病；褐斑病；多重实时荧光定量PCR
中图分类号：S435.121.4 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023）07-0145-07。
梨黑斑病菌拮抗菌的筛选及鉴定
梨黑斑病 菌 （ Ａ ｌ ｔ ｅ ｒ ｎ ａ ｒ ｉ ａ ａ ｌ ｔ ｅ ｒ ｎ ａ ｔ ｅ ） 、 梨 黑 星病 菌 （ Ｖ ｅ ｎ ｔ ｕ ｒ ｉ ａ
ｐ ｉ ｒ ｉ ｎ ａ ） 、 苹果轮纹病菌 （ Ｐ ｈ ｙ ｓ ａ ｌ ｏ ｓ ｐ ｏ ｒ ａ ｐ ｉ ｒ ｉ ｃ ｏ ｌ ａ ） 、 柑 橘青霉病 菌
关键 词 ： 梨黑斑病 ； 链霉菌 ； 抑菌物质 ； 拮抗菌
中图分类号 ： ￥ ４ ３ ６ ． ６ １ ２ 文献标 志码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ２—１ ３ ０ ２ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ２— ０ １ ３ ４— ０ ２
梨黑斑病是一种 由链格孢菌 （ Ａ ｈ ｅ ｒ ｎ ａ ｒ ｉ ａ ａ ｌ ｔ ｅ ｒ ｎ ａ ｔ ｅ ） 引起 的
Ｐ ｒ ： ５ ， ＿ Ａ Ｃ Ｇ Ｇ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ｃ Ｔ Ｉ ＧＴ ｒ Ａ Ｃ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ一 ３ 。测 序 由上 海 生 工 生
拮抗菌 的分离培养均采用高氏 ｌ 号培养基 ； 发酵培养基 ： 黄豆饼粉 ２ ０ ． ０ ｇ ， 淀粉 １ ０ ． ０ ｇ ， 葡萄糖 １ ５ ． ０ ｇ ， 碳酸钙 ５ ． ０ ｇ ，
一
１ ３ ４一
江苏农业科学
２ ０ １ ３年第 ４ １卷第 ２期
张根伟 ， 张丽萍 ， 李书生， 等．梨黑斑病 菌拮抗菌的筛选及鉴定 ［ Ｊ ］ ．江苏农业科学， ２ ０ １ ３ ， ４ １ （ ２ ） ： １ ３ 张丽萍， 李书生， 程辉彩
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王凤军1，张祥林2，马海波3，冯新忠1，冯俊丽4，华 鹏1
(1.库尔勒出入境检验检疫局，新疆 库尔勒 841000；2.新疆出入境检验检疫局，新疆 乌鲁木齐 3.新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐 830000；4.浙江理工大学生物工程研究所，浙江 杭州
Abstract：A real-time fluorescence PCR method was established by using a pair of specific primers and double-fluores-
cence labeling probe according to the conserved sequence of the pathogen Alternaria alternata causing fragrant pear black
Key words：fragrant pear；Alternaria alternata；real-time fluorescence polymerase chain reaction；TaqMan probe；
rapid detection
中图分类号：Q945.8
文献标志码：A
文章编号：1002-6630(2013)20-0170-04
难以满足快速诊断的需要[10-12]。实时荧光PCR 技术已广泛 应用于植物病原菌的检测与鉴定[13-17]，本研究通过设计特 异性引物和探针，以期建立基于TaqMan探针的实时荧光 PCR检测技术，对香梨黑斑病的快速检测提供技术保障。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 梨花和梨果于2012年花期初至梨果采收完毕(即4月
关键词：香梨；链格孢菌；实时荧光PCR；TaqMan探针；快速检测
Real-Time Fluorescence PCR Identification of Alternaria alternata Causing Black Spot Disease of Fragrant Pear
WANG Feng-jun1，ZHANG Xiang-lin2，MA Hai-bo3，FENG Xin-zhong1，FENG Jun-li4，HUA Peng1 (1. Korla Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Korla 841000, China；
初至9月底)，采自新疆库尔勒市阿瓦提香梨园和沙依东 香梨园，梨花每3d采样1次，梨果每周采样1次。
梨黑斑病链格孢子阳性菌株由河北出入境检验检疫 局馈赠。
供试玻片，将涂有凡士林的载玻片分别置于两香梨 园的空中孢子捕捉器中，每周采样2次。
基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限 公司；荧光定量PCR检测试剂盒 宝生物工程(大连)有 限公司；探针与引物委托美国Invitrogen公司合成。 1.2 仪器与设备
2.1 香梨黑斑病的分离鉴定及发生规律 从花序伸出期到成果采收完毕的6个月中，对2个香梨
园中黑斑病菌孢子动态监测，共取得玻片样本94片，2个 香梨园各47片，对玻片镜检可发现引起梨黑斑病的链格孢 子多在6月底果实即将成熟时开始大量产生，直到采收完 毕，但在开花期也有出现(图1A、B)。对采集的梨花(12次 采样结果)和梨果样本(30次采样结果)进行病原菌的分离与 鉴定，结果表明除了花序伸出期初(两梨园第1次梨花采样 结果)和幼果形成期初(两梨园第1次梨果采样结果)之外， 采集到的样本中均检出梨黑斑病链格孢属(图1 C、D)。
收稿日期：2012-12-02 基金项目：国家质量监督检验检疫总局资助项目(201110022-3；2012IK290)；库尔勒市重点科技项目 作者简介：王凤军(1984—)，女，工程师，硕士，主要从事植物病害和转基因检测研究。E-mail：wfj0808@
※分析检测
食品科学
2013, Vol.34, No.20 171
spots, fluorescence signal could be collected with the specific primers and probe. The assay for specific detection was more
sensitive than conventional PCR, and could detect the concentration of DNA template as low as 1.9 pg/μL without pathogen
2. Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Ürümqi 830000, China； 3. College of Agriculture, Xinjiang Agricultural University, Ürümqi 830000, China； 4. Institute of Bioengineering, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)
经各种途径侵入而潜伏至贮藏期发病，是一种典型的潜 伏侵染性病害。
国内外对梨黑斑病的分离与鉴定进行了广泛研究。 目前，对链格孢菌等真菌传统鉴定方法需要经过组织分 离、单孢纯化、培养保存和显微观察等，检验时间较 长，而且形态学上的变异容易造成检验误区。近年来开 展的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、 巢式PCR等诸多植物病原的分子生物学检测技术具有一 定的有效性，但仍需进一步分子杂交或克隆测序鉴定，
剂盒说明书进行操作，加入50 L无菌水洗脱两次。用核 酸蛋白分析仪检测DNA提取的纯度和质量浓度。 1.3.5 引物和探针设计
根据NCBI的GenBank核酸序列数据库中真菌核糖体 18S rDNA基因序列中表达链格孢菌的OPA1-3基因组序列 (EF503810)[18]，使用Primer Premier 5.0软件和Primer Express 3.0软件设计引物和探针，在DNAStar软件上评价引物的特 异性，在BLAST网页上比对扩增产物的特异性。 1.3.6 实时荧光定量反应
spots. Totally 12 flowers, 30 fruits and 94 slides from fragrant pears were detected in this study. The real-time fluorescence
PCR was used to detect four other plant disease pathogens on pears. Results showed that only in the pathogen causing black
ABI7500实时荧光定量PCR仪 美国应用生物系 统公司；ND2000C核酸蛋白分析仪 美国热电公司； 1-14ED小型离心机 美国Sigma公司。 1.3 方法 1.3.1 香梨园中黑斑病菌孢子监测
2012年4～9月，在2个香梨园分别设置空中孢子捕捉 器各1个，将孢子捕捉器放在果园中央，在每一孢子捕捉 器中各放置2片表面涂有凡士林的载玻片，设置转速和定 时工作时间(每天12h)，每隔3d取出孢子捕捉器中的载玻 片，编号后放入载玻片盒中，并在孢子捕捉器中放入新 的涂有凡士林的载玻片，使之继续工作。将载玻片盒带 回实验室，按编号顺序在显微镜下观察链格孢菌分生孢 子的有无及数量。共采集样本94片，两香梨园各47片。 1.3.2 香梨开花期黑斑病发生动态监测
取梨花或梨果样品100mg，按照基因组DNA提取试
䬮Ṭᆒᆀᮠ/(њ/cm2) 2222222222222222000000000000000011111111111111112222222222222222----------------00000000000000004445568687687697----------------01212001232312109990119100109839
doi:10.7506/spkx1002-6630-201320035
梨黑斑病是梨种植区广泛发生的一种世界性病害， 是梨三大病害之一，它是由链格孢菌(Alternaria alternate) 引起的贮藏期病害[1-3]。主要侵染叶片、新稍和果实，果 实成熟期时在果实表面形成近圆形或不规则的黑褐色病 斑，中间凹陷，潮湿时病斑表面产生黑色霉层，严重影 响果实的产量和品质。链格孢菌为半知菌亚门丝孢纲丝 孢目链格孢属真菌，是一种寄主范围广泛的弱寄生菌， 已在苹果、梨、甘薯、柑橘、番茄、鸭梨、非洲菊、苜 蓿等蔬果上有报道[4-9]。链格孢菌可在花期和果实发育期
在0.2mL光学PCR反应管中依次加入：灭菌蒸馏 水15.75 L、10×PCR Buffer 2.5 L、dNTP(400 mol/L) 2 L、引物(10 mol/L)0.5 L、探针(10 mol/L)0.5 L、500U Taq DNA聚合酶 0.25 L和DNA模板3 L，反应混合液在 实时定量PCR仪中进行扩增。反应条件设置为95℃预处 理15s，再以95℃变性15s，60℃退火延伸1min，进行40 个循环。定量中设置重复实验和阴性对照实验，阴性对 照中不加模板DNA，而以灭菌蒸馏水代替，用于检验是 否存在PCR污染和较高的引物二聚体污染。 1.3.7 建立标准曲线
从花序伸出期至落花期，在供试果园中放置孢子 捕捉器的周围选4棵树作为观测点，每3d采集1次样品， 每次采集梨花25朵，其中15朵切取各段组织进行分离 培养，花序伸出期取全花，经0.25%次氯酸钠表面消毒 45s，用无菌水清洗2～3次，置于马铃薯-胡萝卜琼脂培养 基(PCA)上25℃黑暗培养5～7d，待长出菌落后进行纯化 鉴定，另10朵花用于PCR鉴定。 1.3.3 香梨结果期黑斑病发生动态监测
将测定好质量浓度的香梨黑斑病菌基因组DNA 作为标准品，进行5倍梯度稀释，共设置6个梯度，分 别为6.0000、1.2000、0.2400、0.0480，0.0096ng/ L和 0.0019ng/ L，稀释介质为灭菌蒸馏水。对6个梯度的标准 品进行实时荧光定量反应，每个梯度设置3个重复。