高效逆流色谱HPCCC有哪些基本概念
高速逆流色谱技术
l 高速逆流色谱是液相色谱的一种新技术，无需载体，从几种色谱原理方法可以清晰说明。
大约50年前，根据对两种液体进行分配的理念，产生了两种相似的方法：逆流分配技术和液-液色谱分配技术，即：逆流色谱和液相色谱。
30年前，日本Sanki Engineering Ltd.利用前一种技术开发出了高性能的逆流色谱仪（HPCPC），它结合了液相色谱中的快速、高效和先进技术。
HPCPC尤其在利用色谱技术进行半制备和全制备的应用中倍受瞩目，它和采用色谱柱技术的液相色谱在四个方面具有显著优势：● 无样品损失：因为流动相和固定相都是液体，样品可以全部回收。
● 大容量和高的分离能力：流动相和固定相的体积比明显很高，从而无需更大的理论塔板数，就可以获得更大的容量和更高的分离能力。
● 十分灵活的两相系统：（两种、三种、四种溶剂混合）为了获得一种纯的化合物，实验中需要比较灵活的更改流动相，HPCPC可以很方便地调整两相的极性。
● 溶剂消耗少：相对于色谱柱制备系统，对于同样的制备量，HPCPC的溶剂消耗量只有十分之一，使用逆流色谱在实验室完成分离后，可以直接放大到生产规模。
● 固定相价格低：另一个显著优点是逆流色谱的固定相是溶剂，相比色谱柱中的填充材料价格低很多；而且固定相可以很容易再生，一些添加的物质如手性选择剂或复杂的配位体可以无损失地回收，国际上出版的论文可以提供十分有用的信息和应用参考。
新型的高速逆流色谱仪HPCPC广泛地应用于化学领域的纯化，如抗生素、缩氨酸、丹宁酸、皂角苷、油脂、药品等，将来的发展可以预见更大规模和产量的HPCPC设备出现，在化学领域将更加广泛地应用，如手性药物分离等。
与传统制备液相的优势● 逆流色谱仪HPCPC十分快速由于固定相溶剂通过离心力保留在分配通道中，可以不用顾及分离精度的高低要求而让流动相的流速保持很高。
● 明显优于传统制备液相由于逆流色谱仪HPCPC不需要固定相，不会出现对十分昂贵的样品产生不可逆转的保留，而在传统色谱柱的液相色谱中，经常出现的变性和分解现象在逆流色谱不会产生，同时保留了原来的生物活性。
逆流色谱
逆流色谱基础
• 逆流色谱仪器体系
1) 重力作用 2) 流体静力学平衡体系 (HSES) 特征：a) 由一系列腔体或小室组成 b) 一个旋转轴，离心力恒定 3) 流体动力学平衡体系 (HDSE) 特征：a) 缠绕的聚四氟乙烯管 b) 两个旋转轴，离心力可变
逆流色谱基础
• 逆流色谱的基本色谱理论
CCC是一种特殊的液相色谱技术，利用特殊的 色谱柱实现液态固定相的有效保留。作为一种 色谱技术，遵循基本的色谱塔板数理论和经典 的色谱公式。
甲醇，正丙醇 ，异丙醇 甲酸，乙酸
高速逆流色谱
• 洗脱方式 1) 等度洗脱 2) 梯度洗脱
a) 三元溶剂体系 b) 多元溶剂体系
3) 双向洗脱
高速逆流色谱
• 检测 1) 紫外-可见光检测器 2) 蒸发光散射检测器 3) 傅里叶红外光谱检测器 4) 薄层色谱检测器 5) 质谱检测器
高速逆流色谱
• 优点
高速逆流色谱
• 简介
高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography, HSCCC)是20世纪80年代，由Ito教授研究和发展起来的一 种现代色谱分离制备技术，HSCCC建立在一种特殊的流体 动力学平衡基础上，利用螺旋管的高速行星式运动产生的 不对称离心力场，实现两相溶剂体系的充分保留和有效混 合及分配，从而实现物质在两相溶剂中的高效分离。
1) 两相的界面张力 2) 比重差 3) 输液管的口径 4) 分离管的材料
液滴逆流层析
• 装置：三部分组成 1) 输液部分：微型泵、贮液槽、进样器 2) 分离管部分 3) 样品收集部分：检测器、自动收集仪 • 应用实例 柴胡皂苷a, d (C-16羟基端基异构体) 人参皂苷的分离 • 与逆流分配比较：优点
高速逆流色谱高速逆流色谱高速逆流色谱高速逆流色谱
高速逆流色谱High Speed Countercurrent Chromatography（HSCCC）逆流色谱是利用溶质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同，应用色谱层析的方法，将不同溶质分离。
逆流色谱的发展从逆流分配、液滴逆流色谱直至现在的高速逆流色谱，经历了近60年的历程，技术和设备均已日益成熟，现越来越多地应用于中药及天然药物的研究开发。
高速逆流色谱特点：! 无不可逆吸附# 液—液层析系统，无样品与固定相之间的不可逆吸附! 高回收率# 流动相和固定相均为液体，样品可全部回收! 操作简便# 固定相为液体，体系更换、平衡方便、快捷。
高速逆流色谱原理：高速逆流色谱是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相（固定相），利用恒流泵连续输入另一相（流动相），随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。
在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脱。
图1是螺旋柱中互不相溶的两相溶剂在行星运动时的流体动力学运动及分配示意图。
上图，在达到稳定的流体动力学平衡态后，柱中呈现两个截然不同的区域：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域（混合区）呈现两相的激烈混合。
其余区域（静置区）两溶剂相分成两层：较重的溶剂相在外部，而较轻的溶剂相在内部，两相形成一个线状分界面。
下图，I到IV的展开柱，分别与上图中I到IV位置相对应，每一混合区以跟柱旋转速度相同的速度向柱头端移动（与海面波的运动相似）。
在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂都在反复进行混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，当柱以800rpm旋转时，频率超过13次/秒，流动相则不断地穿过固定相。
所以高速逆流色谱在一个较宽的流动相流速范围内，仍有相当高的分配效率。
图1 螺旋柱中两溶剂相流体动力学运动及分配高速逆流色谱应用：1. 旋转速度在逆流色谱中，留在柱中固定相的量是影响溶质峰分离度的一个重要因素，一般说来，高保留量会大大改进峰分离度。
高速逆流色谱操作步骤
高速逆流色谱操作步骤高速逆流色谱（High-Performance Counter-Current Chromatography，HPCCC）是一种液-液色谱技术，通过在两种不同的不溶溶剂相之间的弯曲螺旋柱中建立逆流运动，实现分离和纯化化合物。
以下是一般的高速逆流色谱的操作步骤：1.系统准备：•确保逆流色谱系统（HPCCC系统）处于良好状态，所有连接都紧固，管路无泄漏。
•根据实验需要选择合适的溶剂相，并准备好两相的溶液。
2.填充柱体：•将两相的溶液分别注入到弯曲螺旋柱的两个相对侧。
柱内建立液-液平衡。
3.样品加载：•在逆流色谱系统中加入待分离的混合物样品。
4.逆流运行：•开始逆流运行，通过外部离心力或其他手段，让两相的流动方向相反。
这样，溶液就会在弯曲螺旋柱中形成逆流。
5.分离：•样品成分在两相中根据其在两相之间的分配系数进行分离。
相对溶剂流动的方向，样品在柱内依次进入高和低浓度的相中，实现分离。
6.收集分离产物：•根据需要，通过调整逆流色谱系统的操作参数，收集某个时间点或某个分离峰的产物。
7.监测：•监测分离过程，可以使用检测器如紫外可见光谱仪（UV-Vis）等进行在线监测。
8.系统维护：•在实验过程中，注意监测溶剂消耗情况，必要时进行补充。
对于柱体的维护和清洗也需要定期进行，以保证仪器的正常运行。
需要注意，高速逆流色谱是一种相对复杂的色谱技术，具体的操作步骤可能会因为使用的设备和实验条件而有所不同。
在进行高速逆流色谱实验时，建议参考具体的仪器操作手册和相关文献，确保按照正确的步骤进行操作。
高速逆流色谱技术在药物研究开发中的应用
高速逆流色谱技术在药物研究开发中的应用*□曹学丽** (北京工商大学化学与环境工程学院/北京市植物资源研究开发重点实验室 北京 100037) 收稿日期:2006210210 修回日期:2006211230* 北京市教育委员会科技发展教育计划项目(K M200410011001);天然药物活性成分分离纯化技术研究,负责人:曹学丽;北京市自然科学基金项目(2042006)高速逆流色谱螺线形圆盘柱分离系统的研究,负责人:曹学丽。
** 联系人:曹学丽,博士,教授,主要从事天然植物和药物活性成分的逆流色谱分离纯化技术研究。
Tel:010*********,E 2mail:Caoxl@th .btbu .edu .cn 。
摘 要:对高速逆流色谱(HSCCC )技术。
在天然药用植物活性成分分离及标准品制备、中药指纹图谱分析、天然新药的研发和活性部位筛选等方面中的应用及其在生物药物以及药物工业化领域的应用发展趋势进行了综述。
关键词:高速逆流色谱 药物研究开发 活性成分分离 高速逆流色谱(H igh -Speed Countercurrent Chr o 2mat ography,HSCCC )是一种连续高效的液2液分配色谱分离技术。
该技术由于不需要固体支撑体,物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现,因而避免了因不可逆吸附引起的样品损失、失活、变性等,特别适合于天然生物活性成分的分离。
而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触,使得样品的制备量大大提高,是一种理想的制备分离手段,目前已广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域,尤其是在我国生物医药以及中药现代化等领域的应用愈来愈广。
HSCCC 在过去的20～30年中发展十分迅速,产生了一系列新型的分离技术,积累了大量的科研成果。
自1995年以来,国外已有5本英文专著出版[1-5],我国目前也已出版两本中文专著[6,7]。
本文将重点就近年来HSCCC 在药物研究开发中的应用进行讨论和综述。
逆流色谱技术
逆流色谱起源于最简单的液液分配装置－实验室里常用 的分液漏斗。二十世纪30年代初，Jantzen对工业上的 混合分离单元首先使用了逆流分配术语，并发展了实 验室规模的逆流分配装置。1941年，Martin和Synge设 计了一种级联型萃取装置，他们使用多孔固态载体支 撑一种液体，而让另一种不互溶的液体通过载体，从 而产生了分配色谱。逆流分配法的创始人Craig发明了 非连续式的逆流分配（countercurrent distribution,CCD）装置，并设计了几种CCD仪器用于 多种类型物质的分离，这一设计很快被接受，用于天 然产物、多肽和其它生物大分子。此法设备复杂，溶 剂消耗大、易乳化，分离操作时间长。此后出现的几 种液液分配分离装置和仪器都没有根本上的突破，因 此均未得到推广用于。
螺旋管行星式离心色谱 螺旋形逆流色谱仪 液滴逆流色谱仪 旋转和回旋腔室逆流色谱 流通型行星式逆流色谱仪 连续洗脱型逆流色谱仪 倾斜角转子逆流色谱仪 慢旋转螺旋管制备型逆流色谱仪 水平流通式逆流色谱仪 非同步逆流色谱仪 高速逆流色谱仪 离心液滴逆流色谱仪 双向逆流色谱仪 多螺旋管逆流色谱仪
逆流色谱原理
日本学者Ito等首先在日本，随后在美国的国家 医学科学研究院发现了一种有趣的现象：不互 溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小口径管子里能 在重力场的作用下实现物质在两相溶剂间的连 续分配。而当螺旋管柱在一离心力场内转动时， 随着转速的增加，两相溶剂的混合程度，分配 效率，管柱的利用率及物质在固定相的保留值 也随之增加。如果把待分离样品从管子的入口 引入，连续分配传递过程就会在管柱里进行， 从而实现连续的液一液分配分离，并由此设计 制造了多种逆流色谱仪。
物体在旋转螺旋管里的运动状态示意图
1．首端；2．玻璃珠；3．铅粒； 4．气泡；5尾端．
《逆流色谱技术》课件
广泛应用
在中药、生物医药、食品添加剂 等领域，逆流色谱技术被广泛应 用于天然产物的分离和纯化。
在药物分离中的应用
药物分离
逆流色谱技术在药物分离中具有重要作用，能 够分离和纯化药物中的有效成分。
药物质量控制
该技术可用于药物质量控制，确保药物的有效 性和安全性。
药物研发
逆流色谱技术还可用于药物研发，帮助研究人员发现新的药物候选物。
逆流色谱技术的应用范围
01
逆流色谱技术在生物医药领域应用广泛，可用于分离纯化蛋白 质、酶、核酸等生物大分子。
02
此外，逆流色谱技术在天然产物提取、食品分析、环境监测等
领域也有广泛应用。
由于逆流色谱技术具有分离效率高、样品回收率高、操作简便
03
等优点，因此在科研和工业生产中得到了广泛应用。
02
逆流色谱技术的分类
原理
基于溶质在固定相和流动相之间的水动力学 作用进行分离。
优点
分离效果好，可实现连续分离。
应用
适用于分离和纯化大分子化合物，如DNA、 RNA和蛋白质等。
缺点
操作条件较为严格，有时需要大量有机溶剂 。
03
逆流色谱技术的实验设备
分离柱
分离柱是逆流色谱技术中的核心部件，其作用是提供固定相和流动相的相 对运动，从而实现混合物的分离。
素。
03
泵的性能参数如流量、压力等对分离效果有很大影响，需 要精确控制。
检测器
检测器的作用是检测和记录 分离过程中各组分的浓度变
化。
常用的检测器有紫外可见光 检测器、荧光检测器、电导 检测器等。选择合适的检测 器需要考虑被分离物质的性
质和检测灵敏度。
检测器的性能参数如检测限 、线性范围等对分离效果有 很大影响，需要合理选择和 使用。
高速逆流色谱技术 综述
高速逆流色谱技术1.概述高速逆流色谱（high-speed counter current chromatography，简称 HSCCC），是20世纪70年代由美国国立卫生院（National Institute of Health，简称NIH）Ito博士首创，并且在最近10年之内发展迅速，是一种可在短时间内实现高效分离和制备的新型液-液分配色谱技术，这项技术可以达到几千个理论塔板数的。
它具有操作简单易行、应用范围很广、无需固体载体、产品纯度高、适用于制备型分离等特点。
自1982年第一台仪器问世，就开始了HSCCC的现代化进程。
HSCCC用于天然药物化学成分的分离始于1985年，到1989年达到一个高潮。
自2000年9月起国际逆流研究领域每隔2年举行一次世界逆流色谱学术会议。
近几年, 人们对健康的认识越来越深刻, 更多的人追求天然绿色的健康理念, 故HSCCC 作为一种对提取物污染小的制备技术, 它的应用越来越受到了人们的关注。
鉴于HSCCC的显著特点, 此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域。
目前,HSCCC已从制备型发展到了分析型, 甚至是微量分析型, 应用范围也十分广泛[ 2]。
高速逆流色谱技术在我国的应用较早, 技术水平在国际领域也处于领先地位。
目前, 我国是世界上为数不多的高速逆流色谱仪生产国之一。
我国的深圳同田生化技术有限公司是全球第一家多分离柱高速逆流色谱仪专业生产企业。
公司拥有自主知识产权的高速逆流色谱专利技术, 现已研制并生产出TBE 系列分析型, 半制备型TBE 300，300A, 制备型TBE1000高速逆流色谱仪设备。
2.基本原理高速逆流色谱技术(HSCCC)是一种不用任何同态载体的液-液色谱技术，其分离原理是进行分离纯化时，首先选择预先平衡好的两相溶剂中的一相为固定相, 并将其充满螺旋管柱, 然后使螺旋管柱在一定的转速下高速旋转, 同时以一定的流速将流动相泵入柱内。
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高效逆流色谱HPCCC有哪些基本概念
1、分配系数D
所有样品在HPCCC里发生的分离，是由于化合物在两相溶剂体系里的溶解度不同。
用分配系数D (也称作Kd)来表述这种结果：
D = CS/CM
C S 代表样品化合物在固定相中的浓度，C
M
代表样品化合物在流动相中的浓度。
样品中一种
高分配系数的化合物在固定相中的浓度要高于在流动相中的浓度，要晚一些从柱子里洗脱出来。
另一种低分配系数的化合物在流动相中的浓度要高于在固定相中的浓度，要早一些洗脱出来。
如果一种化合物在两相中的是平均分配的(D=1) ，不论哪一相溶剂被选为流动相，在流动相流出1倍柱体积的量后，这种化合物都会被洗脱出来。
2、固定项保留因子SF
是固定相的体积与总柱（系统）体积的比值。
固定相保留因子Sf越大，柱子（系
统）的分离能力越大，因此，分离度越好
Vcolumn
-Vmp
SF(%) = Vcolumn x 100
Vmp 相当于在平衡期间洗脱出的固定相体积（我们在后面操作HPCCC部分讨论），Vc 是的柱子体积，在下一个图中可以看到：
3、洗脱出峰时间t
如果您一旦知道了目标化合物的分配系数和在两相溶剂体系中的固定相保留因
子，您可以通过下面的公式计算出任意目标化合物的洗脱出峰时间：
Vc
tD = Sf (D-1) + 1
F
这里VC 是螺旋柱（管）体积，F 是流动相MP流速，Sf 是固定相保留因子(作为一个系数) ，D 是分配系数. 无论样品负载量是多少，用这种规格的柱子，目标化合物总是在同一时间里被洗脱出峰。
因此，在分配系统确定后，就非常容易预测洗脱出峰时间。
4、出峰顺序
右图显示化合物的理论洗脱出峰顺序与分配系数D的关系如果化合物的分配系数较低(即<1)，在流动相中的浓度要高于在固定相中的浓度，则出峰速度快。
如果化合物的分配系数较高(即>1)，在固定相中的浓度要高于在流动相中的浓度，则出峰速度慢。
接下来，我们来
解释任意级别的分离纯化过程中,利用这一特性来如何准确预测洗脱出峰的时间。
5. 分离度（分辨率）：
这种技术具有高分离性能的关键是它具有高固定
相保留因子. 这对分离纯化的性能有什么影响
呢？正如左边的谱图所示，好的固定相保留因子能
获得好的分离度。
我们可以看到固定相保留因子越
高，实现的分离度越好。
以前的高速逆流色谱仪
HSCCC固定相保留因子最多也不过70%；而现在的
高效逆流色谱仪HPCCC固定相保留因子一般都要
高于 85%。
这主要带来两个好处。
第一个好处是具有高固定相
保留因子，扩大了两相溶剂体系的范围。
这很容易
理解，从非极性两相溶剂体系到极性两相溶剂体系
固定相保留因子降低(即极性变强). 因此，在过去
由于固定相保留因子太低，不能利用这个技术解决
纯化分离遇到的问题
由于工业上在非极性范围一直采用反相高效液相色谱技术，这种技术并没有被采用。
第二个好处关系到纯化分离的通量和速度。
过去，尽管这项技术叫高速逆流色谱，但是名不符实。
因为分离纯化时间经常是以小时计算而不是分钟。
高的固定相保留因子允许在不损失分离度的状况下提高流动相流速。
右边图示例子。
现在的HPCCC，溶剂的极性范围扩大，使高通量的分离纯化能够实现。
6. 柱长的影响：
可以通过增加柱长来提高分离度，这一点与常规采用固体固定相色谱技术的不同。
因为HPCCC 是一种低压分离技术，柱长不受限制。
分离度与柱长倍数的平方根成
正比（如，柱长为2倍时，相当于提高分离度为2的平方根，即1.4)。
显然，柱长增加，分离时间也增加了，但是通量（产量）却不受影响，因为样品负载能力是柱体
积的a %（在上面的例子，样品的负载加倍，但是分离时间也是加倍，因此生产能
力保持不变）。
所以产品研发阶段，可以先在小级别的设备上检验工艺条件是否合适。
用户可以根据最重要的工艺参数（通量，产率和纯度），放大工艺条件，制作
柱子。
4.与其它色谱技术的比较，HPCCC的优势有哪些？
HPCCC具有许多超越其他类型分配色谱设备（如，HSCCC ，CPC和FCPC）的优势。
首先，固定相保留因子要好于HSCCC设备，流动相流速要
远高于其它设备，因此分离时间显著减少，通量显著增加。
操作模式更灵活
液体固定相的优势是可以采用多种不同的操作模式，这是固体固定相难以实现的。
现在介绍一下液体固定相及它的组成。
另一个区别，HPCCC技术与液固色谱技术不同，正相分离过程就是反相分离过程的逆向过程。
跑得快的化合物洗脱更靠后，跑得慢的化合物
洗脱更靠前。
这是因为每种化合物的分配系数在反相分离过程中变成了原
来的倒数。
请看右图所示[5]。
能实现高分离度分离
首先，我们先明确HPCCC实现高分离度分离的条件。
这个条件就是目标化合物的D 值要选择介于0.5 和 2.0之间。
对未知混合物，其所包含的大多数复杂化合物的平均D值也要被设定在这个范围里。
调整D值最好的方式是调整两相溶剂体系；这在后面的方法开发部分会介绍。
接下来，我们来介绍通过改变操作模式来实现这个目的。
通过在一次分离过程中从正相分离模式切换到反相分离模式，或者相反，来调整D值。
单向洗脱模式CCC
单向洗脱模式CCC是最基本的分离类型。
是一种单方向的分离模式，可以是正
相分离过程也可以是反相分离过程，这取决于选择的流动相。
在❽正相分离❾模式，溶质洗脱顺序是增加极性（正相等梯度模式）。
上相是有机相做流动相，下相是水相做固定相。
在❽反相分离❾模式，溶质洗脱顺序是降低极性（反相等梯度模式）。
下相是水相做流动相，上相是有机相做固定相。
洗脱推出模式：
洗脱推出模式的理论基础是基于化合物在从色谱柱里洗脱出来之前，就已经被完全分离
的假设。
由于我们使用的是液体固定相，所以在完整洗脱循环过程没有完成的时候，我
们可以回收已经分离开的化合物。
.
洗脱推出模式，分离开始的方式与单向洗脱模式CCC一样。
但是，当运行到一
个点时(如D=1.0)。
流动相被停止，固定相被泵送入，推出柱子里内容物。
(即，
开始是固定相的那一相溶剂被当作新的流动相引入到设备里) [6]。
这种模式的优点是：
高D值得化合物的峰宽将变窄，对于在固定相中强保留的化合物能够提高分离度。
总的运行时间将缩短，因为只需要有1倍柱体积的初始固定相（也就是新流动相）推出全部样品。
洗脱推出模式另外一个好处是，在实验结束时设备里填满了固定相，可以进行下一次进样。