高速逆流色谱法
高速逆流色谱技术
l 高速逆流色谱是液相色谱的一种新技术，无需载体，从几种色谱原理方法可以清晰说明。
大约50年前，根据对两种液体进行分配的理念，产生了两种相似的方法：逆流分配技术和液-液色谱分配技术，即：逆流色谱和液相色谱。
30年前，日本Sanki Engineering Ltd.利用前一种技术开发出了高性能的逆流色谱仪（HPCPC），它结合了液相色谱中的快速、高效和先进技术。
HPCPC尤其在利用色谱技术进行半制备和全制备的应用中倍受瞩目，它和采用色谱柱技术的液相色谱在四个方面具有显著优势：● 无样品损失：因为流动相和固定相都是液体，样品可以全部回收。
● 大容量和高的分离能力：流动相和固定相的体积比明显很高，从而无需更大的理论塔板数，就可以获得更大的容量和更高的分离能力。
● 十分灵活的两相系统：（两种、三种、四种溶剂混合）为了获得一种纯的化合物，实验中需要比较灵活的更改流动相，HPCPC可以很方便地调整两相的极性。
● 溶剂消耗少：相对于色谱柱制备系统，对于同样的制备量，HPCPC的溶剂消耗量只有十分之一，使用逆流色谱在实验室完成分离后，可以直接放大到生产规模。
● 固定相价格低：另一个显著优点是逆流色谱的固定相是溶剂，相比色谱柱中的填充材料价格低很多；而且固定相可以很容易再生，一些添加的物质如手性选择剂或复杂的配位体可以无损失地回收，国际上出版的论文可以提供十分有用的信息和应用参考。
新型的高速逆流色谱仪HPCPC广泛地应用于化学领域的纯化，如抗生素、缩氨酸、丹宁酸、皂角苷、油脂、药品等，将来的发展可以预见更大规模和产量的HPCPC设备出现，在化学领域将更加广泛地应用，如手性药物分离等。
与传统制备液相的优势● 逆流色谱仪HPCPC十分快速由于固定相溶剂通过离心力保留在分配通道中，可以不用顾及分离精度的高低要求而让流动相的流速保持很高。
● 明显优于传统制备液相由于逆流色谱仪HPCPC不需要固定相，不会出现对十分昂贵的样品产生不可逆转的保留，而在传统色谱柱的液相色谱中，经常出现的变性和分解现象在逆流色谱不会产生，同时保留了原来的生物活性。
高速逆流色谱法快速分离制备雷帕霉素工艺研究
种 发 酵 水 平 低 下 和 生 产 提 取 路 线 复 杂 ， 由于 雷 帕霉
经活 性炭 脱色 后 ，减压 浓缩 得 雷帕 霉素粗 提 取物 。
２２ ． ＨＳ Ｃ 分 离 雷帕霉 素粗提 物 Ｃ Ｃ
ｓ ｐ ｒ ｔ ｎ ａ ｄ ｐ ｒｆ ａ ｉ ｎ ｏ ｐ ｍｙ ｉ ｏ ｆｒ ｎ ａ ｉ ｎｂ ｏｈ ｉ ｒ ｅ ｓ ａ ｅ ｅ ａ ａ ｉ ｎ ｕ ｉ ｃ ｔ ｆ ａ ａ ｃｎ ｆ ｍ ｅ ｍｅ ｔｔ ｒ ｔ ｌ ｇ — ｃ ｌ ｏ ｉ ｏ ｒ ｒ ｏ ｎ ａ
．
Ｋｅ ｒ ｓ Ｈ 曲一 ｅｄｃｕ ｔ － ｒ ｎ ｒｍａｏｒｐ ｙ Ｓｐ ｒｔ ｎａｄｐ ｒ ｃｔ ｎ Ｒ ｐ ｍｙｉ； ｃｌ ； ｕ ｔ ｙｗｏｄ ｉ ｓ ｅ ｎｅ ｃ ｒ ｔ ｈｏ ｔｇａｈ ； ｅ ａａｏ ｕｉ ａ ｏ ； ａ ａ ｃ Ｍｙ ｅ ａ Ｐ ｒｙ ｐ ｏ ｒｕ ｅ ｃ ｉ ｎ ｉ ｆ ｉ ｎ ｉ ｌ
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高速逆流色谱法
HSCCC进样体积可达到柱体积的20%，广泛用于制备 性分离。
参数
固定相 机理
溶质与固定相作用
上样量 分离效率
操作 费用 危险性
HSCCC
色谱分离是依据被分离物在两相中分配系数的不同而 进行；
逆流色谱是利用物质在两相液体中分配系数的不同实 现分离；
分离也可以依据被分离物在一个含有沉淀剂的浓度梯 度变化的单一溶剂中的溶解度的不同而实现。
（前提：沉淀剂浓度梯度移动的速度远低于溶剂流速）
溶解度具有很小差异的物质，经过在柱中反复的沉淀 和溶解即可达到分离。
二、基本原理
现代逆流色谱仪器体系： 1. 流体静力学平衡体系
2. 流体动力学平衡体系（HSCCC体系） 仪器的两个特征：
a 有一个或多个缠绕有多层聚四氟乙烯管的线轴； b 没有旋转密封接头，有一个安装有两个旋转轴的齿轮传动装置，
能产生一个可变的离心力场。
通过公转、自转（同步 行星式运动）产生的二 维力场，保留两相中的 其中一相作为固定相；
广义定义： 1. 任何利用两相不混溶液体的色谱技术； 2. 其中一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管
或一系列的腔体中； —— 固定相 3. 同时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。
—— 流动相
减少了溶质分子与固体支撑体之间各种复杂的相互作 用；
不仅可以获得高纯度的分离组分；
同时具有较高的回收率和重现性。
离心沉淀色谱（centrifugal precipitation chromatography, CPC）是一种建立在类似于逆流色谱 的不用固体支撑体的开放性通道基础上的沉淀和溶 解色谱。
高速逆流色谱法分离纯化红曲色素组分
1922010, Vol. 31, No. 20食品科学※工艺技术高速逆流色谱法分离纯化红曲色素组分郑允权 1 ，李泳宁 1 ，王阿万 2 ，陈芬玲 2 ，石贤爱 2 ，郭养浩 1 , 2 , *(1.福州大学药物生物技术与工程研究所，福建 福州 2.福建省医疗器械与医药技术重点实验室，福建 福州 350002； 350002)摘 要：采用高速逆流色谱法(HSCCC)分离纯化红曲发酵产品中 6 种 Azaphilone 类色素组分。
筛选弱极性分离溶剂 系统正己烷 - 醋酸乙酯 - 甲醇 - 水，研究 6 种色素组分在不同溶剂体系中的分配系数，建立两步逆流萃取分离的技术 路线。
经过 HPCCC 分离纯化和丙酮结晶操作，得到 6 种高纯度的 Azaphilone 类色素组分，纯度均大于 98.5%，得 率达到 81.40%～84.78%，所得的 6 种色素组分的摩尔吸光系数分别为 13313、13877、9380、9360、25621、25849 L/(mol·cm)。
本研究可提供一种新型的制备高纯度红曲 Azaphilone 类色素组分的技术路线。
关键词：红曲色素；高速逆流色谱；分离纯化Separation and Purification of Monascus Pigments by High-speed Counter-current ChromatographyZHENG Yun-quan1，LI Yong-ning1，WANG A-wan2，CHEN Fen-ling2，SHI Xian-ai 2，GUO Yang-hao1,2,* (1. Institute of Pharmaceutical Biotechnology and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350002, China； 2. Fujian Key Laboratory of Medical Instrumentation and Pharmaceutical Technology, Fuzhou 350002, China) Abstract： azaphilone-type pigments were separated from Monascus-fermented solid medium and purified/fractionated by Six by high-speed counter-current chromatography (HSCCC). A solvent system with weak polarity involving four components nhexane, ethyl acetate, methanol and water was selected and used for HSCCC. Based on a comparative analysis of partition coefficients of target compounds in different solvent systems, a two-step HSCCC routine was developed. After separation by HSCCC and crystallization with acetone, six azaphilone-type pigments with high purity were obtained. The purity of each pigment was above 98.5% and their yields were between 81.40% and 84.78%. Their molar absorption coefficients were 13313, 13877, 9380, 9360, 25621 L/(mol·cm) and 25849 L/(mol·cm), separately. Key words：Monascus pigments；high-speed counter-current chromatography；separation and purification 中图分类号：TS202；Q819 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)20-0192-04红曲霉菌发酵产品的生产与应用在我国已有一千多 年历史，主要用于食品着色、酿酒和传统中药材。
高速逆流色谱
1.6 葛 Pueraria lobata 葛根素（puerarin）（黄酮） 1.7 苹果 Malus pumila 原矢车菊素(procyanidin)；Procyanidin A及procyanidin
B。 1.8 牛膝 Achyranthes bidentata 牛膝多糖 (多糖) 1.9 宽叶羌活 Notopterygium forbessi notopterol、isoimperatorin。 1.10 红豆杉粗提物 10-脱乙酰浆果紫杉素（10-deacelylbaccatin），紫杉醇
流速范围:0.1-30ml/min 分离流速：2.0-4.0ml/min； 压力:0-2MPa
紫外检测器波长：使用汞灯 - 滤光片选择 254 、 280nm ( 标配 )
多种滤光片可选： 313 、 365 、 405 、 436 、 546nm( 选购 )
温控模块（接循环水浴）：温度调控范围 15 ～ 40 ℃，精度 0.5 ℃ ，
轻的为上相，重的为下相），一相为固定相，另一相 为流动相。 b) 被分离物质的分配系数（K）范围在0.5-2。K=Cu/CL， Cu是上相中溶质浓度，CL是下相中溶质浓度。K＜＜ 0.5 会导致峰分离度的下降，而K＞＞2，会使保留时 间太长，样品峰过宽。
表 1 中列举了常用的溶剂系统。查找溶剂系统可以从左边
步骤2:溶剂系统的优化
区域
化合物极性
A
强极性
B
中极性
C
非极性
溶剂系统 正己烷/正丁醇/甲醇/水 正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水
正己烷/乙腈
步骤3:溶剂比例的优化
一次只改变一种溶剂的量 取少量样品在试管中进行分配系数实验 TLC或HPLC测定实验结果
高速逆流色谱法分离纯化长春花中长春新碱
采 用 高速 逆流 色谱 仪 ， 氯仿一 醇一． ｏ ・ ＨＣ（ ３： ） 甲 ０ ３ｍ ｌ Ｌ １ ４： ２溶剂 体 系， 上相 为 固定相 ， 相 为流 动 相 ， 下 流动 相 流 速 为 ２０ｍ ． Ｌ・ ｎ ， ｍｉ ～ 紫 外检 测 波 长 为 ２ ０ｎ 主机 转速 为 ８ ０ｒ ８ ｍ， ０ ・ｍｉ＿ ， 温循 环 温 度 为 ２ ｎ 。恒 ８℃ 。 结果 业 生产 高 纯 度 产 品 。 关键词 ： 高速 逆 流 色谱 ； 春 花 ； 长 长春 新碱
ｓ ｅ ｄｃ ｕ ｔ ｒ ｕ ｒｎ ｈ ｏ ｔｇ ａ ｈ ｓｕ ｅ ｉ ｈｏ ｏ ｏ ｍ ｍｅｈ ｎ ｌ ． ｏ ． ＨＣ ４：３： ）ａ ｈ ｏｖ ｎ ｙ ｔｍ． ｐ ｅ ｏ ｎ ｅ－ ｒｅ ｔ ｒ ｍａｏ ｒｐ ｙｗａ ｓ ｄ ｗ ｔ ｃ ｌｒ ｆｒ — ｔａ ｏ－ ３ ｍ １ Ｌ ｃ ｃ ｈ ０ ｌ（ ２ ｓｔ ｅｓ ｌｅ ｔ ｓｅ ｓ
西 北 药 学杂 志
２１ ０ １年 １ 第 ２ ２月 ６卷
第 ６ 期
３５ ９
高速 逆 流 色 谱 法分 离 纯化 长 春 花 中长春 新 碱
韩 艳 ， 张 琰 ， 新友 ， 刘 覃 华 ， 小燕（ 杜 第四军医大学唐都医院药剂科， 陕西 西安 ７０ ３） １０８
应用高速逆流色谱分离中药中有效成分及质谱结构研究
应用高速逆流色谱分离中药中有效成分及质谱结构研究I. 研究背景在中医药学的发展过程中，中药已经成为了人们日常生活中不可或缺的一部分。
随着科技的进步，人们对中药的研究也越来越深入，尤其是对中药中有效成分的提取和分离技术。
高速逆流色谱(HSLC)作为一种高效的分离技术，已经在中药研究领域得到了广泛应用。
本研究旨在通过HSLC技术分离中药中的有效成分，并利用质谱技术对其进行结构解析，以期为中药的现代化研究和开发提供理论依据和技术支撑。
在过去的几十年里，我国中医药事业取得了世界公认的辉煌成果。
然而随着现代医学的发展，中医药面临着前所未有的挑战。
为了更好地传承和发扬中医药文化，我们需要不断地对中药进行创新研究，提高其药效和安全性。
高速逆流色谱作为一种新兴的分离技术，具有操作简便、分离效率高、适用范围广等优点，为中药的有效成分提取和分离提供了有力保障。
质谱技术作为现代分析科学的重要手段，已经在生物医药领域取得了显著的应用成果。
通过对中药中有效成分的结构解析，我们可以更深入地了解其药理作用机制，为新药的研发提供理论依据。
此外质谱技术还可以用于中药的质量控制和评价，确保药品的安全性和有效性。
中药中有效成分的研究意义及现状在我们的日常生活中，中药已经成为了许多人的日常调理和疾病治疗的重要手段。
而其中最让人着迷的，莫过于中药中那些神奇的有效成分。
这些成分不仅能够治病救人，还能够为我们的生活带来诸多健康益处。
因此研究中药中有效成分的意义不言而喻。
然而尽管中药有着悠久的历史和丰富的经验，但在现代科学技术的发展下，我们对中药中有效成分的认识仍然有限。
这主要是因为中药中的有效成分种类繁多，分离提取难度较大，而且很多成分的结构性质尚不清楚。
因此如何高效、准确地从中药中提取出这些有效成分，成为了一个亟待解决的问题。
近年来随着高速逆流色谱等现代分离技术的不断发展，我们对中药中有效成分的研究取得了一定的进展。
通过对大量中药样品的分析，我们已经发现了许多具有潜在药用价值的化合物。
高速逆流色谱法
五、高速逆流色谱的应用
天然药物的分离和分析 氨基酸、激素、嘌呤、抗生素等分离分物碱的分离
第9章 高速逆流色谱法
High Speed Countercurrent Chromatography HSCCC
二、分离原理
连续液液萃取过程,固定相和流动相均为液体 问题是：如何在流动相流动时使固定相不动
两种基本模式 ➢ 流体静力学平衡系统
• 洗脱速度太慢,一般需要两天或更长时间.
➢ 流体动力学平衡系统
4. 逆流色谱的分离效率比不上气相色谱和高效液相色谱等技术,不 宜进行复杂混合物的全分析.
5. 适合用于分离纯化,预处理条件宽松,回收率高,制备量大.
四、高速逆流色谱的溶剂选择
溶剂体系的选择原则
不造成样品的分解或变性 足够高的样品溶解度 样品在系统中有合适的分配系数 固定相能实现足够高的保留
溶剂应该进行分层实验,实验结果决定流速和洗脱 方式
分离：溶剂萃取过程成千上万次地、高效地、自动连续 地予以完成.各个组分也就会按其在两相中的分配系数分 离开来.
四、方法特点
1． 固定相、流动相均为液体,完全排除了载体对样品组分的吸附、 玷染、变性、失活等不良影响,能避免不可逆吸附造成的色谱峰拖 尾现象,实现高回收. 2．分离柱容积可大, 没有填料,柱内空间均为有效空间.因此,样品 负载量较大,制备量可从毫克到克量级. 3． 逆流色谱不用填料,分离过程不是淋洗或洗脱过程,而是对流穿 透过程.溶剂用量少,成本低.
三、仪器结构
高速逆流色谱的仪器流程
柱：长的软管如聚四氟乙烯管绕制成
载体：无
固定相：液体.用某一种有机／水两相溶剂体系或双水和 溶剂体系的上层或下层作为色谱过程的固定相,用离心力 场来支撑住柱内的液态相.
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High Speed Countercurrent Chromatography
HSCCC
一、概述
Ito，70年代提出，80年代提出CCC，一种液液 色谱分离技术
逆流分配→液滴逆流色谱→高速逆流色谱
参考书
1.《逆流色谱技术》张天佑，北京科学技术出版社， 1991年 2.《高速逆流色谱分离技术与应用》曹学丽，化学工 业出版社，2009年
四、高速逆流色谱的溶剂选择
溶剂体系的选择原则
不造成样品的分解或变性 足够高的样品溶解度
样品在系统中有合适的分配系数
固定相能实现足够高的保留
溶剂应该进行分层实验，实验结果决定流速和洗 脱方式 样品要溶解于流动相或固定相之中
五、高速逆流色谱的应用
天然药物的分离和分析
氨基酸、激素、嘌呤、抗生素等分离分析 蛋白质、细胞至微生物的分离等
四、方法特点
1． 固定相、流动相均为液体，完全排除了载体对样品组分的吸 附、玷染、变性、失活等不良影响，能避免不可逆吸附造成的色 谱峰拖尾现象，实现高回收。 2．分离柱容积可大， 没有填料，柱内空间均为有效空间。因此， 样品负载量较大，制备量可从毫克到克量级。 3． 逆流色谱不用填料，分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对 流穿透过程。溶剂用量少，成本低。 4. 逆流色谱的分离效率比不上气相色谱和高效液相色谱等技术， 不宜进行复杂混合物的全分析。 5. 适合用于分离纯化，预处理条件宽松，回收率高，制备量大。
黄连生物碱的分离
二、分离原理
连续液液萃取过程，固定相和流动相均为液体
问题是：如何在流动相流动时使固定相不动？ 两种基本模式 流体静力学平衡系统
• 洗脱速度太慢，一般需要两天或更长时间。
流体动力学平衡系统
三、仪器结构
高速逆流色谱的仪器流程
柱：长的软管(如聚四氟乙烯管)绕制成
载体：无 固定相：液体。用某一种有机／水两相溶剂体系或双水 和溶剂体系的上层或下层作为色谱过程的固定相，用离 心力场来支撑住柱内的液态相。 流动相：若用溶剂体系中的另一层作为流动相，带着混 合样品由泵的压力推入分离管柱，样品就会穿过两个液 相完成。各个组分也就会按其在两相中的分配系数 分离开来。