高速逆流色谱仪

高速逆流色谱仪 高速逆流色谱仪（HSCCC) 高速逆流色谱法 (High-speed Countercurrent Chromatography，简称HSCCC)，于1982年由美国国立卫生院Ito博士研制开发的一种新型的、连续高效的液液分配色谱技术，与其它色谱技术不同的是它不需任何固态载体，因此能避免固相载体表面与样品发生反应而导致样品的污染、失活、变性和不可逆吸附等不良影响。同时它也具有适用范围广、快速、进样量大、费用低、回收率高等优点。因此，己在生物、医药、食品、材料、化妆品和环保等领域获得了广泛的应用，尤其是在天然产物活性成分的分离纯化领域倍受重视。 一、高速逆流色谱法的发展简史 二十世纪六十年代，首先在日本，随后在美国国家医学研究院发现了一种有趣的现象：即互不相溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小孔径管子里分段割据，并能实现两溶剂相之间的逆向对流。Ito及其后来者在此基础上研究并设计制造出了一系列逆流色谱装置，早期的是封闭型的螺旋管行星式离心分离仪CPC（coil planet centrifuge），用于分离染料，蛋白质和细胞粒子。数年后Ito把流通机制引入到螺旋管柱体系中，使逆流色谱和现代色谱一样可以实现连续的的洗脱、分离、检测和收集，并建立了两个基本的流通体制。其中有在比较简单的流体静力学平衡体制HDES基础上开发的作为分析分离的CCC、用作制备分离的DCCC以及移位腔室CCC等。另一方面，以流体动力学平衡体制HDES为基础，研制出在重力场作用下的大制备量分离仪器和在离心力场作用下的分析型和半制备型分离仪器。 二、高速逆流色谱原理记忆器的基本配置 1．高速逆流色谱技术的原理 高速逆流色谱法是建立在单向性流体动力平衡体系之上的一种逆流色谱分离方法，它是在研究旋转管的流体动力平衡时偶然发现的。当螺旋管在慢速转动时，螺旋管中的两相都从一端分布到另一端。用某一相作移动相从一端向另一端洗脱时，另一相在螺旋管里的保留值大约50%，但这一保留量会随着移动相流速的增大而减小，使分离效率降低。但使螺旋管的转速加快时，两相的分布发生变化。当转速达到临界范围时，两相就会沿螺旋管长度完全分开，其中一相全部占据首端的一段，我们称这一相为首端相，另一段全部占据尾端的一段，称为尾端相。高速逆流色谱正是利用了两相的这种单向性分布特征，在高的螺旋管转动速下，如果从尾端送入首端相，它将穿过尾端相而移向首端，同样，如果从首端相送入尾相，它将穿过首端相而移向螺旋管的尾端。分离时，在螺旋管内首先注入其中的一相(固定相)，然后从合适的一端泵入移动相，让它载着样品在螺旋管中无限次的分配。仪器转速越快，固定相保留越多，分离效果越好，且大大地提高了分离速度，故称高速逆流色谱。 2．高速逆流色谱色谱仪的基本配置 仪器的中心部分：(a) ITO多层线圈分离柱，它是由100-200米长、内径为1.6mm左右的聚四氟乙烯管沿具有适当内径的内轴共绕十多层而成，其管内总体积可达300mL左右。(b)平衡器，它可以调节重量，它的作用是让(a)， (b)相对于中心轴两边重量平衡。当在旋转控制器的控制下，在齿轮传动装置作用下，(a)，(b)同时绕中心轴作顺时针或反时针的行星运动，即(a)- (b)本身既在自转，但同时又在绕中心轴公转，公转转速可从0-4000r/min。从线圈分离柱中通过中空的中心轴还同时牵引出了线圈的两端，一端供泵入液用，一端输出液体。仪器工作需要互不相溶的两种液体，一相作固定相，一相作移动相。仪器工作前，先将作为固定相一相的液体通过恒流泵压入线圈分离柱，然后用进样器将待分离的样品按如图所示进样，最后用恒流泵压入移动相，同时启动中心部分运转直到转速大于600r/min。此时，两相在线圈分离柱中具有相对运动之势。由于移动相源源不断的压入，阻止了固定相的流出，同时，移动相带着样品在线圈分离柱中进行无限次的分配而使复杂样品得到分离。当移动相经过检测器时，由于不同的样品组分会产生不同大小的信号，用记录仪就能得到逆流色谱图谱，同时用馏分收集器分步收集移动相就会得到复杂样品被分开的组分。较大的制备型HSCCC，柱容积可达530m1，一次最多进样可达20g粗品；较小的分析型的HSCCC柱容积为8m1，进样量为几十微克，最大转速可达4000r/min，分析能力堪与HPLC相媲美。 在常用的HSCCC基础上，有人提出双向模式的高速逆流色谱" (dua-mode counter crurrent chromatography简称Dccc)，即前一次的流动相作下一次的固定相，洗脱方向相反。与常规的HSCCC相比，Dccc可以降低制备时间，免去柱冲洗时间，提高分离效率，不必预测溶质的保留时间和分配系数，减少了溶剂选择的繁琐。但目前由于溶剂体系系统不完善，应用范围较窄。 三、高速逆流色谱法的技术特点 1．应用范围广，适应性好 由于溶剂系统的组成及配比可以是无限多的，因而从理论上讲可以适用于任何极性范围内样品的分离，在分离天然化合物方面具有其独到之处。由于聚四氟乙烯管中的固定相为液体不需要固相载体，因而可以消除固-液色谱中由于使用固相载体而带来的吸附损失，特别适用于分离极性物质。 2．操作简便，容易掌握 仪器操作简单，对样品的预处理要求低，一般的粗提物即可进行的制备分离或分析。 3．回收率高 不需要固相载体，消除了由于样品在固相载体上的不可逆吸附和降解造成的损失，理论上样品的回收率可达。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。 4．重现性好 如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，即使多次进样，其分离过程都保持很稳定，而且重现性相当好。 5．分离效率高，分离量较大 由于其与一般的色谱分离方式不同，能实现梯度洗脱和反相洗脱，亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高，制备量大。 6．分配系数 溶剂系统的选择是同时选择色谱分离过程的两相，是对样品成功分离的关键所在，而样品中各组分的分配系数决定着这种溶剂系统是否合适，因此分配系数的测定是选择溶剂系统的重要环节。目前，分配系数的测定多采用薄层色谱法、毛细管电泳法、HPLC法、生物活性分配比率法及分析型HSCCC法。 7、溶剂体系和溶液系统

被分离物质种类 基本两相溶剂体系 辅助溶剂

非极性或弱极性物质 正庚（己）烷-甲醇 氯烷烃

正庚（己）烷-乙睛 氯烷烃

正庚己烷-甲醇（或乙睛）-水 氯烷烃

中等极性物质 氯仿-水 甲醇、正丙醇、异丙醇

乙酸乙酯-水 正己烷、甲醇、正丁醇

极性物质 正丁醇-水 甲醇、乙酸 高速逆流色谱常用基本溶剂体系表 上表中是根据被分离物质的极性列出一些基本的可供参考的溶剂体系，它包括非水体系和含水体系。 溶剂系统的选择对于HSCCC分离十分关键。遗憾的是到目前为止溶剂系统的选择还没有充分的理论依据，而是根据实际积累的丰富经验来选择。通常来说，溶剂系统应该满足以下要求：溶剂系统不会造成样品的分解或变性样品中各组分在溶剂系统中有合适的分配系数，一般认为分配系数在0.2-5的范围内是较为合适的，并且各组分的分配系数值要有足够的差异，分离因子最好大于或等于1.5；溶剂系统不会干扰样品的检测；为了保证固定相的保留率不低于50%，溶剂系统的分层时间不超过30秒；上下两相的体积比合适，以免浪费溶剂；尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理尽量避免使用毒性大的溶剂。根据溶剂系统的极性，可以分为弱极性、中等极性和强极性三类。经典的溶剂系统有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等。在实验中，应根据实际情况，总结分析并参照相关的专著及文献，从所需分离的物质的类别出发去寻找相似的分离实例，选择极性适合的溶剂系统，调节各种溶剂的相对比例，测定目标组分的分配系数，最终选择合适的溶剂系统。 四、高速逆流色谱法的应用 中国是世界上较早开展研究逆流色谱技术的国家，它的应用范围十分广泛，如生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、生物化学、医药学、农业、环境、材料、化工、海洋生物以及无机离子、保健品原料、食品添加剂和化妆品等众多领域。 1．天然产物 HSCCC可采用不同物化特性的溶剂体系和多样性的操作条件，具有较强的适应性，为从复杂的天然产物粗制品中提取不同特性(如不同极性)的有效成分提供了有利条件。因此在80年代后期，在世界范围内的"回归大自然"浪潮的席卷之下，HSCCC被大量用于天然产物化学成分的分析和制备分离，目前报道也最多。 例如：用正己烷／乙酸乙酯/甲醇／水(3：7：5：5)分离粉防己干根粗提物 ；正己烷／乙酸乙酯／乙醇／水(6：3：2：5)或正己烷／乙酸乙酯／甲醇／水(1：1：I：I)体系分离红豆杉粗提物 ；分离紫杉醇混合物采用石油醚(40-60℃)／乙酸乙酯／甲醇/水(50：70：80：65)体系比较合适；采用正己烷/乙酸乙酯／甲醇／水(3：7：5：5)有效分离肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸混合物 ；采用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/乙醇／水(5：7：5：1：1．5)五元体系分离紫杉醇和caphalornannine；氯仿／0.07 mol/L磷酸钠 0.04 mol／L柠檬酸缓冲液体系(pH： 5.08，1：1)分离制备马钱子碱和番术鳖碱 ；用氯仿/甲醇/丙酮 /水(5：6：1：4)分离挪威云杉针叶粗提物 ；用正庚烷／乙酸乙酯／甲醇/水(3：l0：IO：7)分离杂交番茄枝种子的粗提物 等等，一般均采用下相作流动相。 其它，尚有用正己烷／乙酸乙酯／甲醇／水两步分离紫杉醇的同系物例(eaphalonmmaine，7-epi-10-deaeetyltaxo1)等 ，第一步采用(1：1：1：1)，第二步采用(3：3：2：3或4：4：3：4)并实现制备分离，并发现甲醇