高速逆流色谱原理及应用
高速逆流色谱在天然产物分离提取中的应用ppt课件
蒽醌类化合物是广泛存在的重要天然色素，在高等植物和真菌、地衣等低等植物中尤为普遍，中药中则以蒽醌及其衍生物最为重要， 具有泻下、抗菌、抗癌等生理活性。
精、花色素等及各种衍生物。利用H S C C C 技术 利用HSCCC分离黄酮类化合物
1.2 发展史
• 二十世纪六十年代，首先在日本，随后在美国国 家医学研究院发现了一种有趣的现象：即互不相 溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小孔径管子里分段 割据，并能实现两溶剂相之间的逆向对流。
• ITO及其后来者在此基础上研究并设计制造出了一 系列逆流色谱装置，早期的是封闭型的螺旋管行 星式离心分离仪CPC（coil planet centrifuge），用 于分离染料，蛋白质和细胞粒子。数年后ITO把流 通机制引入到螺旋管柱体系中，使逆流色谱和现 代色谱一样可以实现连续的的洗脱、分离、检测 和收集，并建立了两个基本的流通体制。
1.3 HSCCC的技术特点
1．应用范围广，适应性好
与HPLC相比： 2．操作简便，容易掌握
a.分析成本低 a.溶剂消耗多
3．回收率高
b.易于操作 c.进样量大
b.检测限较低
4．重现性好
5. 分离效率高，分离量较大
1.4 HSCCC溶剂体系的选择
HSCCC成功分离天然产物的关键就是选择合 适的溶剂体系。
原料 吴茱萸 黄花乌头 附子 金果榄
绿茶
溶剂体系 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (5∶5∶7∶5) 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.2mol/L HCl (1∶3.5∶2∶4.5) 氯仿-甲醇-0.3mol/L 盐酸 (4:3:2) 氯仿-甲醇-0.2mol/L 盐酸 (2:1:1) 氯仿-甲醇-0.2mol/L 盐酸
高速逆流色谱法
五、高速逆流色谱的应用
天然药物的分离和分析 氨基酸、激素、嘌呤、抗生素等分离分物碱的分离
第9章 高速逆流色谱法
High Speed Countercurrent Chromatography HSCCC
二、分离原理
连续液液萃取过程,固定相和流动相均为液体 问题是：如何在流动相流动时使固定相不动
两种基本模式 ➢ 流体静力学平衡系统
• 洗脱速度太慢,一般需要两天或更长时间.
➢ 流体动力学平衡系统
4. 逆流色谱的分离效率比不上气相色谱和高效液相色谱等技术,不 宜进行复杂混合物的全分析.
5. 适合用于分离纯化,预处理条件宽松,回收率高,制备量大.
四、高速逆流色谱的溶剂选择
溶剂体系的选择原则
不造成样品的分解或变性 足够高的样品溶解度 样品在系统中有合适的分配系数 固定相能实现足够高的保留
溶剂应该进行分层实验,实验结果决定流速和洗脱 方式
分离：溶剂萃取过程成千上万次地、高效地、自动连续 地予以完成.各个组分也就会按其在两相中的分配系数分 离开来.
四、方法特点
1． 固定相、流动相均为液体,完全排除了载体对样品组分的吸附、 玷染、变性、失活等不良影响,能避免不可逆吸附造成的色谱峰拖 尾现象,实现高回收. 2．分离柱容积可大, 没有填料,柱内空间均为有效空间.因此,样品 负载量较大,制备量可从毫克到克量级. 3． 逆流色谱不用填料,分离过程不是淋洗或洗脱过程,而是对流穿 透过程.溶剂用量少,成本低.
三、仪器结构
高速逆流色谱的仪器流程
柱：长的软管如聚四氟乙烯管绕制成
载体：无
固定相：液体.用某一种有机／水两相溶剂体系或双水和 溶剂体系的上层或下层作为色谱过程的固定相,用离心力 场来支撑住柱内的液态相.
高速逆流色谱仪的优势
高速逆流色谱仪的优势高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography，简称HSCCC）是一种较新型的液—液分配色谱,由美国国立健康研究院（National Institute of Health, U.S.A.）Ito博土最先研制开发后由北京市新技术应用研究所在国内开展研发和推广工作。
其原理是基于样品在旋转螺旋管内的互不混溶的两相溶剂间分配不同而获得分离，因而无须任何固体载体或支撑体，能达到在短时间内实现高效分离和制备，并且可以达到几千个理论塔板数。
与其他柱色谱相比较，它克服了固定相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形施尾等缺点[3]。
目前此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域[5]。
我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。
美国FDA及世界卫生组织（WHO）都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定，90年代以来，高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。
1. 高速逆流色谱仪原理及特点HSCCC利用了一种特殊的流体动力学（单向流体动力学平衡）现象。
具体表现为一根100多米长的螺旋空管，注入互不相溶的两相溶剂中的一相作为固定相，然后作行星运动；同时不断注入另一相（流动相），由于行星运动产生的离心力场使得固定相保留在螺旋管内，流动相则不断穿透固定相；这样两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。
由于样品中各组分在两相中的分配比不同，因而能使样品中各组分得到分离。
2. HSCCC的优点HSCCC主要具有以下几个方面的优点。
2.1 应用范围广，适应性好。
由于溶剂系统的组成与配比可以是无限多的，因而从理论上讲HSCCC适用于任何极性范围的样品的分离，所以在分离天然化合物方面具有其独到之处。
并因不需固体载体，而消除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质和其它具有生物活性的物质。
高速逆流色谱技术 综述
高速逆流色谱技术1.概述高速逆流色谱（high-speed counter current chromatography，简称 HSCCC），是20世纪70年代由美国国立卫生院（National Institute of Health，简称NIH）Ito博士首创，并且在最近10年之内发展迅速，是一种可在短时间内实现高效分离和制备的新型液-液分配色谱技术，这项技术可以达到几千个理论塔板数的。
它具有操作简单易行、应用范围很广、无需固体载体、产品纯度高、适用于制备型分离等特点。
自1982年第一台仪器问世，就开始了HSCCC的现代化进程。
HSCCC用于天然药物化学成分的分离始于1985年，到1989年达到一个高潮。
自2000年9月起国际逆流研究领域每隔2年举行一次世界逆流色谱学术会议。
近几年, 人们对健康的认识越来越深刻, 更多的人追求天然绿色的健康理念, 故HSCCC 作为一种对提取物污染小的制备技术, 它的应用越来越受到了人们的关注。
鉴于HSCCC的显著特点, 此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域。
目前,HSCCC已从制备型发展到了分析型, 甚至是微量分析型, 应用范围也十分广泛[ 2]。
高速逆流色谱技术在我国的应用较早, 技术水平在国际领域也处于领先地位。
目前, 我国是世界上为数不多的高速逆流色谱仪生产国之一。
我国的深圳同田生化技术有限公司是全球第一家多分离柱高速逆流色谱仪专业生产企业。
公司拥有自主知识产权的高速逆流色谱专利技术, 现已研制并生产出TBE 系列分析型, 半制备型TBE 300，300A, 制备型TBE1000高速逆流色谱仪设备。
2.基本原理高速逆流色谱技术(HSCCC)是一种不用任何同态载体的液-液色谱技术，其分离原理是进行分离纯化时，首先选择预先平衡好的两相溶剂中的一相为固定相, 并将其充满螺旋管柱, 然后使螺旋管柱在一定的转速下高速旋转, 同时以一定的流速将流动相泵入柱内。
高速逆流色谱分离技术
四川大学硕士研究生课程考试试卷姓名唐昌云学号 2012224050107 学院华西药学院专业生药学任课教师王曙教授课程名称高等生药学课程成绩考试时间 2012.12.31.四川大学高速逆流色谱分离技术的运用1 发展历史高速逆流色谱(HSCCC)是在1982年，美国国立卫生院的一个教授首先研究和发展起来的一种不同于传统液相色谱法的现代色谱分离制备技术。
作为一种新的色谱技术，HSCCC分离系统可以理解为以螺旋管式离心分离仪代替HPLC的柱色谱系统。
HSCCC不使用固相载体作固定相, 克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点。
由于不需要固定相，HSCCC技术具有进样量大、无不可逆吸附等优于其他色谱技术的优点，此项技术已经被广泛地应用于医药、环境、化工等领域。
2 原理2.1 色谱分离原理高速逆流色谱分离原理结合了液液萃取和分配色谱的优点，是一种不需任何固态载体或支撑的液-液分配色谱技术，其基本分离原理与其他同类色谱技术相同，主要是利用物质在两相间分配系数的差别进行分配。
而HSCCC将两溶剂的分配体系置于高速旋转的螺旋管内，螺旋管的运动形式，是在自身自转的基础上，同时绕一公转轴旋转，形成行星运动。
由此加在分配体系上的离心力场不断发生变化，使两相溶剂充分的混合和分配，从而达到洗脱分离目的。
因为样品中各组分在两相中分配系数不同，导致组分在螺旋柱中的移动速度不同，因而能使样品组分按分配系数的大小次序被依次洗脱下来的一种色谱分离技术。
在流动相中分配比例大的先被洗脱, 在固定相中分配比例大的后被洗脱。
2.2 固定相的保留在高速逆流色谱仪设计方面，其有两个轴，其中一个为公转轴，一个为自转轴，两个轴由一个电动机带动。
仪器的公转轴呈水平方向，圆柱形的螺旋管支持件围绕此轴进行行星式运转，同时围绕自转轴进行自转。
由于螺旋管柱的行星式运动产生了一个在强度和方向上变化的离心力场，使在螺旋柱中互不相溶的两相不断混合从而达到稳定的流体动力学平衡，两相分离成两层，重相占据螺旋管的每一段的外部，轻相占据每一段的内部，并且两相沿螺旋管形成一个清晰的线性界面。
高速逆流色谱
2 溶剂体系选择的步骤
预测要分离物质的极性，粗选一个溶剂体系； （1）预测要分离物质的极性，粗选一个溶剂体系； 取少量样品于上下相各 毫升的溶剂体系中 的溶剂体系中， （2）取少量样品于上下相各2毫升的溶剂体系中，用 TLC进行检验，可加入甲醇 乙醇、醋酸乙酯等来调节 甲醇、 TLC进行检验，可加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯等来调节 进行检验 溶剂体系的极性，直到样品在上下相中的分配比K为 溶剂体系的极性，直到样品在上下相中的分配比K 0.5~2为止； 为止； 为止 HPLC测定 测定K （3）用HPLC测定K值； 分析型HSCCC进行预分离，再用制备型高速逆 HSCCC进行预分离 （4）用分析型HSCCC进行预分离，再用制备型高速逆 流色谱进行分离。 流色谱进行分离。 进行分离
中等极性溶剂体系
强极性溶剂体系
两相由正己烷和水组成 可用甲醇 乙醇、 组成， 甲醇、 两相由正己烷和水组成，可用甲醇、乙醇、醋酸 等来调节溶剂系统的极性。 乙酯等来调节溶剂系统的极性 乙酯等来调节溶剂系统的极性。 典型的溶剂体系有 典型的溶剂体系有： 正己烷-醋酸乙酯-乙醇正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水 正己烷-醋酸乙酯-甲醇正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水
强极性溶剂体系的两相基本物质是正丁醇和水， 强极性溶剂体系的两相基本物质是正丁醇和水，可以 两相基本物质是正丁醇和水 加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯等溶剂来调节溶剂系统的 加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯等溶剂来调节溶剂系统的 甲醇 极性，也可以在氯仿水体系中调节pH值来增大极性, 极性，也可以在氯仿水体系中调节pH值来增大极性,或 pH 适量的酸和碱. 在异丁基甲醚水体系中加入适量的酸和碱 在异丁基甲醚水体系中加入适量的酸和碱.适合于极性 很强的生物碱类化合物的分离。 很强的生物碱类化合物的分离。 典型的溶剂体系: 典型的溶剂体系: 氯仿-甲醇氯仿-甲醇-HCl 异丁基甲醚有机相加三乙胺，水相加盐酸） 异丁基甲醚-水（有机相加三乙胺，水相加盐酸）
高速逆流色谱
溶剂体系的选择
基本原则: • 1. 不能影响样品（分解, 变性） • 2. 对样品溶解度好 • 3. 两相稳定可迅速分相（小于30秒） • 4. 固定相有较好保留（大于50%） • 5. 尽量用挥发性溶剂有利于样品回收
• 6. 样品在两相中分配系数合适（ 0.5~2 ）
溶剂条件的筛选方法
溶剂体系可分为三大类：
高速逆流色谱技术及应用
杨晶 授课老师：刘俊达
内容提纲
• 逆流色谱发展史 • 高速逆流色谱简介 • 高速逆流色谱的应用 • 总结与展望
逆流色谱的发展史
逆流分配色谱 Counter-current Distribution 上世纪 四十年代 Lyman C. Craig 发明了第一台设备 (不算分液漏斗!) 进行逆流分配实 验; 他称其为 Counter-current Distribution (CCD)。下面是一台由 Hecker (Tuebingen, Germany) 试制的由手动操作的CCD。
高速逆流色谱 High Speed CCC (HSCCC)
由Yoichiro Ito博士 (NIH, Bethesda, 20世纪60年代逆流色谱的基本模 型创始人)于1982年首先研发出行星式离心逆流色谱仪。 ●“增加的引力” – 混和程度提高 – 形成流体动力学平衡体系(变化 力场) ● 理论塔板数高 (up to 70,000 per hour) ● 无死体积，低压力，固定相保留率更高。
• ①③组分，由于在轻相中的分配系数过大不易被流动相洗脱下来 • ②④组分，根据在重相的分配系数大小按顺序洗脱出来分离区 •
………………――――轻相 • oooooooooooo――――重相 • ①②③④——样品（4组分）
HSCCC的工作流程简易图
高速逆流色谱在天然产物分离提取中的应用ppt文档
a.仪器对保留值的影响（外因）
研究表明：螺旋管支持件的自转半径r与公转半 径R之比B值是一个影响两相互不混溶溶剂在旋转 螺旋管内保留的关键因素。用大直径的支持件使 值进一步提高，能导致亲水性溶剂体系的单向性 流体动力学分布反向；反之，用小直径的支持件 使值减小，能使疏水性溶剂体系的单向性流体运 动方向反向，而介于疏水性和亲水性溶剂之间的 中间极性溶剂，其两相分布状况则会受到离心力 条件的影响。
• 2.2.4 温度的影响
温度的提高溶剂的黏度有很大的影响，一般提高 温度会获得高的保留值，而相反降低温度则得到低 的保留值，但一般温度不可能提高太多，因为所用 的都是有机溶剂，沸点很低。
3.在分离天然产物中的应用
从天然产物中提取的活性成分是防治疾病和强身 健体的物质基础。从天然产物活性成分中发展新药 、寻找先导化合物并进行结构修饰是药物研发的重 要内容,目前,许多市场销售和进入临床阶段的抗肿瘤 和抗感染药物都来源于天然产物。
溶剂系统
正己烷-乙酸乙酯-乙腈-水（2：2:1:0.6:2） 乙酸乙酯-乙醇-水（15:1:15） 乙酸乙酯-水（1:1） 正丁醇-乙酸乙酯-水（2:8:5） 乙酸乙酯-水（1:1） 乙酸乙酯-乙醇-水（4:1:5） 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.2:0.8） 和石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.4:0.6） 梯度洗脱
1.2 发展史
• 二十世纪六十年代，首先在日本，随后在美国国 家医学研究院发现了一种有趣的现象：即互不相 溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小孔径管子里分段 割据，并能实现两溶剂相之间的逆向对流。
• ITO及其后来者在此基础上研究并设计制造出了一 系列逆流色谱装置，早期的是封闭型的螺旋管行 星式离心分离仪CPC（coil planet centrifuge），用 于分离染料，蛋白质和细胞粒子。数年后ITO把流 通机制引入到螺旋管柱体系中，使逆流色谱和现 代色谱一样可以实现连续的的洗脱、分离、检测 和收集，并建立了两个基本的流通体制。
高速逆流色谱法分解
1.
2.
3.
减少了溶质分子与固体支撑体之间各种复杂的相互作 用； 不仅可以获得高纯度的分离组分； 同时具有较高的回收率和重现性。
逆流色谱的发展
20世纪50年代，逆流分溶法（CCD）被广泛用于天然产 物的分离。有设备庞大复杂、溶剂消耗大、分离时间太长 等缺陷。
20世纪70年代，液滴逆流色谱（DCCC）利用重力场将 固定相保留在管形柱中，使流动相以液滴形式通过固定相。 缺陷是分离时间长，溶剂体系有限。 改进后的离心分配色谱和螺旋管式逆流色谱，利用离心力 场来实现固定相的保留，缩短了分离时间。
庚烷-甲醇-水体系：庚烷（固定相）水相（流动相） 乙酸乙酯-正丁醇-水体系：水（固定相）乙酸乙酯（流动相） 用于糖苷混合物的分离 糖苷溶解度：正丁醇 > 水 > 乙酸乙酯
（2）多元溶剂体系：情况复杂
正庚（己）烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系 上相：正庚（己）烷-乙酸乙酯有机相 下相：水-甲醇 甲醇变化 上相溶解在水相中
参数
固定相
HSCCC
液体
HPLC
固体
机理
溶质与固定相作用 上样量 分离效率
液-液分配（简单）
分配、吸附、离子交换、 体积排阻等（复杂）
与液体固定相的整个体 在固定相与固体支撑体 积相接触 的界面相互作用 高 低 中等 高
操作
费用 危险性
容易
便宜 高速运转产生机械故障
复杂
昂贵 安全
HSCCC与HPLC是互补的分离技术
2、柱系统的准备
1. 2.
固定相注入螺旋管柱内 重相为固定相：尾头 轻相为固定相：头尾
仪器以选定转速转动 流动相以合适流速泵入柱内 检测器基线稳定时，柱系统准备就绪 进样分析
高速逆流色谱技术名词解释
高速逆流色谱技术名词解释
高速逆流色谱法（High Performance Reversed Phase，HPLC）是用于分离高分子物质的一种有效的分析技术。
其原理是利用两相溶液的相分离效应，将分子大小和组成的不同物质分离出来，以提高分析的灵敏度和准确度。
HPLC是一种高精密和快速的技术，在多学科领域有着广泛的应用，比如说化学、分析化学、药理、免疫学和生物学等。
高速逆流色谱法的关键是精确控制好柱温，使用色谱液和流速。
色谱液中含有目标分离物质，可以用弱酸或碱性溶液，以及选择性的表面活性剂进行改性，以形成两种不同的溶剂，用不同的流速进行分离。
扩散和摩擦力作用会导致分离物质在柱内停留不同时间，以达到分离目的。
使用高速逆流色谱分离物质时，必须使用高品质的过滤器和检测仪，以确保色谱柱中的溶液质量，并获得准确的分离结果。
这种技术不仅能用于分离物质，而且还能
快速检测滤失和含量，甚至可以检测目标物的性质。
HPLC在药物的研制和测试方面也有着重要的作用。
它能够准确地检测出药物制剂中不同原料之间的比例，从而保证制剂质量，同时也能快速测定药物的组分和结构含量等。
另外，高速逆流色谱法还可用于药物的发掘，通过检测不同地质环境中各类有用的生物活性物质，可以大大提高寻找新药的效率。
可以看出，高速逆流色谱法影响着一系列领域的分析方法，它可以提高分析的准确性，简化试验过程，还可以避免出现许多不必要的错误。
虽然HPLC有着一系列优良的性能，但是在使用时，仍然应该采用谨慎，确保滤失和污染等方面的控制，为科研和实验提供准确可靠的数据。