3-高速逆流色谱技术原理及应用领域

• 利用分析型高速逆流色谱仪(TBE-20A) 筛选溶剂条件：
• 1.效率高 • 2.重现性佳（分析型到制备型）
分析型HSCCC
制备型HSCCC
高速逆流色谱技术的应用领域
一. 高速逆流色谱在中草药有效成分 提取分离中的应用
实例1 实例
HSCCC分离纯化香豆素类化合物
100％
95％ 99.6％ 99.7％ 100％
高速逆流色谱的技术原理及应用领域
上海同田生物技术有限公司公司位于上海张 江科技园，占地约 30 亩，建筑面积约 20000 平方 米，总投资人民币 6000 万元，其前身是成立于 1999 年 2 月位于深圳市清华大学研究院的深圳市 同田生化技术有限公司。
公司致力于高速逆流色谱仪（ HSCCC ）、 高纯度天然产物有效成分单体、天然药物原料 / 中间体的研究开发、生产和销售。
实例7 实例 溶剂体系：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（2:3:4:2.5,V/V）， 检测波长：254nm；柱温：25℃；进样量：300mg
I+ I I III
异戊酰螺旋霉素 I+ 异戊酰螺旋霉素 I I＝95％以上 异戊酰螺旋霉素 I I I＝95％
三. 高速逆流色谱在蛋白质 分离纯化中的应用
实例8 实例
利用HSCCC分离标准蛋白质混合物
溶剂体系：PEG1000-磷酸盐体系-水＝ 14-16-70(%,w/w) 样品：1mg 细胞色素C、 20mg 溶菌酶、5mg 血红蛋白
8 6 Signal (mV) 4 2 0 0 100 200 Time (min) 300
3 1.Cytochrome C; 2 2.Lysozyme ; 3.Hemoglobin (反
溶剂体系：正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水(V/V)＝5:6:6:6 进样量＝400mg 白花败酱粗提物
HSCCC馏分的HPLC纯度检测结果 1. 99.2％，2.98.5％，3.97.6％
*引用文献：Journal of Chromatography A,1102(2006)44-50
实例4 实例
朝鲜淫羊藿的分离
实例10 实例
利用HSCCC从鸡蛋清分离了高纯度卵白蛋白
1
8
10 8 Signal (mV) 6 4 2 0 0
1 2
6 Signal (mV) 4
2
2 0 0 100 Time (min) 200 300
3
50
100 Time (min)
150
200
Sigma鸡蛋清蛋白质干粉 鸡蛋清蛋白质干粉
逆流色谱的原理
• 液－液分配色谱：利用样品中各组分在两相溶 液分配色谱： 剂间分配比的差异，进行分离。 剂间分配比的差异，进行分离。它是不用固态 载体的全液态的液-液分配色谱技术 液分配色谱技术. 载体的全液态的液 液分配色谱技术 • 优点： 优点： • 不存在样品的不可逆吸附，理论回收率为100％ 不存在样品的不可逆吸附，理论回收率为 ％ • 极大地避免了样品的变性问题 • 操作简单，无需太多样品前处理等。 操作简单，无需太多样品前处理等。
• 同田对照品纯度达99%以上,均通过严格的质 量检测,包括HPLC,NMR,MS,UV等方法的鉴定.
银杏内酯 B
银杏内酯 A
Hale Waihona Puke 银杏内酯 C• 部分对照品获得国家质量监督检 验检疫总局颁发的标准物质证书
• 天然植物<银杏,大豆>单体 提取物-上海市高新技术成 果转化项目
• <石杉碱甲>-上海市高 新技术成果转化项目
作为多分离柱高速逆流色谱仪国家新型 专利的拥有者、高速逆流色谱领域的领导者， 我们与通用电气医疗生物科学中国有限公司 通用电气医疗生物科学中国有限公司 （ GE Healthcare Bio-sciences co.,ltd . ） 建立 了长期的合作伙伴关系 .
TBE300A＋ÄKTA Prime ＋
• 20世纪50年代，逆流分溶法(CCD) • 由Craig发明的非连续性分溶装置 (设备庞大复杂、易碎、溶剂体系容易乳化、溶 剂耗量大、分离时间太长) • 20世纪60年代被液相色谱代替
• 20世纪70年代，逆流色谱(CCC)。首先 出现液滴逆流色谱(DCCC)
溶剂 泵
进样器
进样器
溶剂 约300根管柱 300根管柱 上行法 收集器
溶剂体系：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:7:5,v/v) 样品：吴茱萸粗提物180mg
1.Evodiamine; 2.rutaecarpine; 3.evocarpine; 4.1methy-2-[(6Z,9Z)-6,9-pentadecadienyl-4-(1H)quinolone; 5.1-methy-2-dodecyl-4-(1H)-quinolone;
溶剂体系：氯仿:甲醇:水(V/V)＝4:3.5:2 进样量＝200mg 朝鲜淫羊藿提取物
HSCCC馏分的HPLC纯度检测结果 1.98.2％，2.99.7％，3.98.5％
*引用文献：Journal of Chromatography A,1064(2005)53-57
实例5 实例
HSCCC分离生物碱类化合物
• 同田对照品质量目前已得到美国，德国， 瑞士，英国，新加坡等多家标准品经销 商及科研院校的认可，公司与国内外多 家科研单位保持长期稳固的合作。
高速逆流色谱 High Speed Counter-Current Chromatography
一、逆流色谱(CCC)原理及分类 二、高速逆流色谱(HSCCC)的原理 三、高速逆流色谱的应用实例
溶剂体系:石油醚:乙酸乙酯:甲醇:水(V/V)＝5:5:5:5，5:5:6:4， 5:5:6.5:3.5(梯度洗脱)；进样量＝150mg(蛇床子提取物)
样品的HSCCC图谱
样品的HPLC图谱
*注：Ⅵ是未知化合物，纯度为 98.1％ 注 98.1％ 是未知化合物， *引用文献:Journal of Chromatography A,1055(2004)71-76
转出峰，上相为流动 相)
1
*引用文献：色谱，2005,Vol.23 No.1 12～17
实例9 实例
溶剂体系：PEG1000-磷酸二氢钾-水＝15-17-68(%,w/w) 样品：1mg 细胞色谱、8mg 肌红蛋白、20mg溶菌酶
1.Cytochrome C; 2.Myoglobin 3.Lysozyme
• 用分析型HPLC筛选溶剂体系，主要是利 用HPLC来确定溶质的分配系数，分配系 数K=CS/CM 或CU/CL • HSCCC最合适的K值范围是0.5－2 • 当CS/CM＜＜0.5时，出峰时间太快，峰 之间的分离度较差，当CS/CM＞＞2时， 出峰时间太长，且峰形变宽
实例 根据文献报道，筛选出芦荟甙HPLC分离的色谱条件，得到芦荟甙 提取物的HPLC图谱如下，1芦荟未知物，2芦荟甙A，3芦荟甙B
二. 高速逆流色谱在抗生素 分离纯化中的应用
实例6 实例 溶剂体系：石油醚-丙酮-水（3:3:2,v/v） 样品：250mg 环孢菌素粗品 检测条件：ELSD
环保菌素 A－98.6%， 90.2%(收率) 环孢菌素 C－99.3％， 85.0%(收率) 环孢菌素 B－98.7％， 88.5%(收率) 环孢菌素 D－98.5％， 86.3%(收率)
在高速逆流色谱技术领域，公司所研制并批 量生产拥有自主知识产权的新型多分离柱高速逆 流色谱仪，性能稳定可靠，有分析型、半制备型、 制备型等7种不同产品：
德国
泰国
• 国内最大最早的专业对照品标准品研发及 生产企业之一 • 拥有长达8年的对照品研发及生产经验
•配备有完整的对照品研发中心,检测中心和 生产中心(对照品高速逆流色谱生产线)
HSCCC的工作流程简易图
HSCCC分离条件 分离条件
溶剂 条件
样品 分离 效果
转速
温度
流速
HSCCC的溶剂条件选择 的溶剂条件选择
• HSCCC采用液-液分配原理，增加了 固定相选择环节，因此它的溶剂条件 选择方法与其他色谱技术不同。
溶剂条件的筛选方法
1、文献报道的溶剂条件 经典体系1：氯仿-甲醇-水：4-3-2 经典体系2：正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水：1-1-1-1 2、TLC方法初步筛选 初步判断样品在上、下相中的分配情况 3、HPLC方法分析分配系数 、 方法分析分配系数 分析目标组分在两相中的分配系数K值 4、利用分析型HSCCC 时间短、溶剂消耗少等优点
HDES 可变的引力场
离心力 引力 离心力
同步行星式运动 CPC DCCC RLCCC HSCCC
高速逆流色谱(HSCCC)的原理
流体静力学 平衡(HSES) 平衡 流体动力学 平衡(HDES) 平衡
逆流色谱的基本体系示意图
固定相的保留原理
如上图所示，螺旋柱中注满差不多相等体积的两相溶 剂（见右侧试管），在螺旋柱的匀速转动下两相溶剂受 到“阿基米德螺旋力”的作用，竞争性地朝首端移动。 不久，两相在螺旋管地首端建立一种流体动力平衡，按 一定比例共存，而这种情况发生在每一圈螺旋柱内。并 且任何一相的超量都会被推向螺旋管的尾端一侧。
实例2 实例 溶剂体系:石油醚:乙醇:乙醚:水(V/V)＝5:4:0.5:1， 进样量＝658mg 姜黄根挥发油
*HSCCC馏分的HPLC纯度检 测，纯度>95％
*引用文献:Journal of Chromatography A,1070(2005)207-210
实例3 实例
HSCCC分离黄酮类化合物
－ 上层 － 下层
体系
氯仿/异丁醇/甲醇/水 4：0.25：3：2 芦荟未知物 0.9 2.3h 芦荟甙A 1.9 4.0h 芦荟甙B 2.3 5.3h
目标物质 分配系数K 分配系数 300BHSCCC保留时间