高速逆流色谱
高速逆流色谱技术
l 高速逆流色谱是液相色谱的一种新技术，无需载体，从几种色谱原理方法可以清晰说明。
大约50年前，根据对两种液体进行分配的理念，产生了两种相似的方法：逆流分配技术和液-液色谱分配技术，即：逆流色谱和液相色谱。
30年前，日本Sanki Engineering Ltd.利用前一种技术开发出了高性能的逆流色谱仪（HPCPC），它结合了液相色谱中的快速、高效和先进技术。
HPCPC尤其在利用色谱技术进行半制备和全制备的应用中倍受瞩目，它和采用色谱柱技术的液相色谱在四个方面具有显著优势：● 无样品损失：因为流动相和固定相都是液体，样品可以全部回收。
● 大容量和高的分离能力：流动相和固定相的体积比明显很高，从而无需更大的理论塔板数，就可以获得更大的容量和更高的分离能力。
● 十分灵活的两相系统：（两种、三种、四种溶剂混合）为了获得一种纯的化合物，实验中需要比较灵活的更改流动相，HPCPC可以很方便地调整两相的极性。
● 溶剂消耗少：相对于色谱柱制备系统，对于同样的制备量，HPCPC的溶剂消耗量只有十分之一，使用逆流色谱在实验室完成分离后，可以直接放大到生产规模。
● 固定相价格低：另一个显著优点是逆流色谱的固定相是溶剂，相比色谱柱中的填充材料价格低很多；而且固定相可以很容易再生，一些添加的物质如手性选择剂或复杂的配位体可以无损失地回收，国际上出版的论文可以提供十分有用的信息和应用参考。
新型的高速逆流色谱仪HPCPC广泛地应用于化学领域的纯化，如抗生素、缩氨酸、丹宁酸、皂角苷、油脂、药品等，将来的发展可以预见更大规模和产量的HPCPC设备出现，在化学领域将更加广泛地应用，如手性药物分离等。
与传统制备液相的优势● 逆流色谱仪HPCPC十分快速由于固定相溶剂通过离心力保留在分配通道中，可以不用顾及分离精度的高低要求而让流动相的流速保持很高。
● 明显优于传统制备液相由于逆流色谱仪HPCPC不需要固定相，不会出现对十分昂贵的样品产生不可逆转的保留，而在传统色谱柱的液相色谱中，经常出现的变性和分解现象在逆流色谱不会产生，同时保留了原来的生物活性。
高速逆流色谱法
HSCCC进样体积可达到柱体积的20%，广泛用于制备 性分离。
参数
固定相 机理
溶质与固定相作用
上样量 分离效率
操作 费用 危险性
HSCCC
色谱分离是依据被分离物在两相中分配系数的不同而 进行；
逆流色谱是利用物质在两相液体中分配系数的不同实 现分离；
分离也可以依据被分离物在一个含有沉淀剂的浓度梯 度变化的单一溶剂中的溶解度的不同而实现。
（前提：沉淀剂浓度梯度移动的速度远低于溶剂流速）
溶解度具有很小差异的物质，经过在柱中反复的沉淀 和溶解即可达到分离。
二、基本原理
现代逆流色谱仪器体系： 1. 流体静力学平衡体系
2. 流体动力学平衡体系（HSCCC体系） 仪器的两个特征：
a 有一个或多个缠绕有多层聚四氟乙烯管的线轴； b 没有旋转密封接头，有一个安装有两个旋转轴的齿轮传动装置，
能产生一个可变的离心力场。
通过公转、自转（同步 行星式运动）产生的二 维力场，保留两相中的 其中一相作为固定相；
广义定义： 1. 任何利用两相不混溶液体的色谱技术； 2. 其中一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管
或一系列的腔体中； —— 固定相 3. 同时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。
—— 流动相
减少了溶质分子与固体支撑体之间各种复杂的相互作 用；
不仅可以获得高纯度的分离组分；
同时具有较高的回收率和重现性。
离心沉淀色谱（centrifugal precipitation chromatography, CPC）是一种建立在类似于逆流色谱 的不用固体支撑体的开放性通道基础上的沉淀和溶 解色谱。
高速逆流色谱
1.6 葛 Pueraria lobata 葛根素（puerarin）（黄酮） 1.7 苹果 Malus pumila 原矢车菊素(procyanidin)；Procyanidin A及procyanidin
B。 1.8 牛膝 Achyranthes bidentata 牛膝多糖 (多糖) 1.9 宽叶羌活 Notopterygium forbessi notopterol、isoimperatorin。 1.10 红豆杉粗提物 10-脱乙酰浆果紫杉素（10-deacelylbaccatin），紫杉醇
流速范围:0.1-30ml/min 分离流速：2.0-4.0ml/min； 压力:0-2MPa
紫外检测器波长：使用汞灯 - 滤光片选择 254 、 280nm ( 标配 )
多种滤光片可选： 313 、 365 、 405 、 436 、 546nm( 选购 )
温控模块（接循环水浴）：温度调控范围 15 ～ 40 ℃，精度 0.5 ℃ ，
轻的为上相，重的为下相），一相为固定相，另一相 为流动相。 b) 被分离物质的分配系数（K）范围在0.5-2。K=Cu/CL， Cu是上相中溶质浓度，CL是下相中溶质浓度。K＜＜ 0.5 会导致峰分离度的下降，而K＞＞2，会使保留时 间太长，样品峰过宽。
表 1 中列举了常用的溶剂系统。查找溶剂系统可以从左边
步骤2:溶剂系统的优化
区域
化合物极性
A
强极性
B
中极性
C
非极性
溶剂系统 正己烷/正丁醇/甲醇/水 正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水
正己烷/乙腈
步骤3:溶剂比例的优化
一次只改变一种溶剂的量 取少量样品在试管中进行分配系数实验 TLC或HPLC测定实验结果
高速逆流色谱在天然产物分离提取中的应用-PPT
作者 王凤美
原料 丹参水溶性成分 丹酚酸类物质
溶剂体系 正己烷-醋酸乙酯-水-甲苯 (1.5:5:5:1.5)
分离物质 丹酚酸 B
Tian G L 山茱萸
乙酸乙酯-正丁醇-水(5:1.8:6) 乙酸乙酯-乙醇-水(5:0.5:6)
没食子酸
黄健光
正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水(7:3:6:4) 邻苯二酚和对苯二酚
溶剂系统
正己烷-乙酸乙酯-乙腈-水（2：2:1:0.6:2） 乙酸乙酯-乙醇-水（15:1:15） 乙酸乙酯-水（1:1） 正丁醇-乙酸乙酯-水（2:8:5） 乙酸乙酯-水（1:1） 乙酸乙酯-乙醇-水（4:1:5） 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.2:0.8） 和石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.4:0.6） 梯度洗脱
原料 吴茱萸 黄花乌头 附子 金果榄
绿茶
溶剂体系 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (5∶5∶7∶5) 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.2mol/L HCl (1∶3.5∶2∶4.5) 氯仿-甲醇-0.3mol/L 盐酸 (4:3:2) 氯仿-甲醇-0.2mol/L 盐酸 (2:1:1) 氯仿-甲醇-0.2mol/L 盐酸
Liu R M 秦皮
正丁醇-甲醇-0.5%乙酸(5:1.5:5)
秦皮素、七叶甙、秦 皮甙和七叶素
3、7 其她类化合物得分离提取
作者 佘佳红
原料 银杏叶
溶剂体系 氯仿-甲醇-水(4:3:2)
分离物质 白果内酯
Du Q Z
穿心莲
正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(1:4:2.5:2.5)
穿心莲内酯和新穿心 莲内酯
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
12
a、仪器对保留值得影响(外因)
高速逆流色谱操作步骤
高速逆流色谱操作步骤高速逆流色谱（High-Performance Counter-Current Chromatography，HPCCC）是一种液-液色谱技术，通过在两种不同的不溶溶剂相之间的弯曲螺旋柱中建立逆流运动，实现分离和纯化化合物。
以下是一般的高速逆流色谱的操作步骤：1.系统准备：•确保逆流色谱系统（HPCCC系统）处于良好状态，所有连接都紧固，管路无泄漏。
•根据实验需要选择合适的溶剂相，并准备好两相的溶液。
2.填充柱体：•将两相的溶液分别注入到弯曲螺旋柱的两个相对侧。
柱内建立液-液平衡。
3.样品加载：•在逆流色谱系统中加入待分离的混合物样品。
4.逆流运行：•开始逆流运行，通过外部离心力或其他手段，让两相的流动方向相反。
这样，溶液就会在弯曲螺旋柱中形成逆流。
5.分离：•样品成分在两相中根据其在两相之间的分配系数进行分离。
相对溶剂流动的方向，样品在柱内依次进入高和低浓度的相中，实现分离。
6.收集分离产物：•根据需要，通过调整逆流色谱系统的操作参数，收集某个时间点或某个分离峰的产物。
7.监测：•监测分离过程，可以使用检测器如紫外可见光谱仪（UV-Vis）等进行在线监测。
8.系统维护：•在实验过程中，注意监测溶剂消耗情况，必要时进行补充。
对于柱体的维护和清洗也需要定期进行，以保证仪器的正常运行。
需要注意，高速逆流色谱是一种相对复杂的色谱技术，具体的操作步骤可能会因为使用的设备和实验条件而有所不同。
在进行高速逆流色谱实验时，建议参考具体的仪器操作手册和相关文献，确保按照正确的步骤进行操作。
高速逆流色谱技术
高速逆流色谱技术目录介绍 (1)高速逆流色谱的原理 (1)1.系统描述 (2)1.1主机 (2)1.2恒流泵 (2)1.3紫外检测器 (3)1.4恒温循环器 (3)1.5色谱工作站 (3)2.主机描述 (3)2.1操作 (4)2.1.1传感器控制面板 (4)2.1.2电源开关 (4)2.1.3样品进样口及样品出样口 (4)2.1.4进口 (4)2.1.5出口 (4)2.2六通阀 (4)2.3进样步骤 (8)2.4控制面板 (9)2.4.1功能键介绍 (9)2.4.2控制面板的操作 (9)2.5TBE-300B高速逆流色谱的工作流程 (10)3.安装 (10)3.1检查包裹 (10)3.2安装环境 (10)3.3连接管 (10)3.4连接保温系统的管路 (11)3.5连接信号线 (12)4.操作 (12)4.1准备 (12)4.2操作程序 (12)4.3系统平衡 (13)4.3.1单泵平衡 (13)4.3.2双泵平衡 (14)4.4样品分离 (14)5.维护 (14)5.1清洗系统 (14)5.2警告 (15)6.系统特性及工作参数 (15)附录A (15)附录B (16)附录C (17)同田生物介绍逆流色谱（CCC）是一种无固体载体支持的液-液分配色谱技术。
与其他柱色谱相比，逆流色谱不会导致不可逆吸附，样品，变性，污染及等问题。
除此之外，它能够分离分子量从小变到大的化合物，甚至一些生物大分子。
高速逆流色谱（HSCCC）是逆流色谱中的最新的发展。
高速逆流色谱不仅减少的分离时间，而且也极大地提高了分离度和制备能力。
高速逆流色谱的应用：1、制备性地分离毫克到克规模的样品；2、从粗样品中分离目标化合物；3、分离放射性同位素。
高速逆流色谱在分离天然产物中的优势：1、更加方便和迅速；2、不需要对样品进行前处理；3、液-液分配容积系统的选择广泛；4、因为没有固体载体，所以无死吸附，无污染；5、高的重现性及重复性。
高速逆流色谱技术 综述
高速逆流色谱技术1.概述高速逆流色谱（high-speed counter current chromatography，简称 HSCCC），是20世纪70年代由美国国立卫生院（National Institute of Health，简称NIH）Ito博士首创，并且在最近10年之内发展迅速，是一种可在短时间内实现高效分离和制备的新型液-液分配色谱技术，这项技术可以达到几千个理论塔板数的。
它具有操作简单易行、应用范围很广、无需固体载体、产品纯度高、适用于制备型分离等特点。
自1982年第一台仪器问世，就开始了HSCCC的现代化进程。
HSCCC用于天然药物化学成分的分离始于1985年，到1989年达到一个高潮。
自2000年9月起国际逆流研究领域每隔2年举行一次世界逆流色谱学术会议。
近几年, 人们对健康的认识越来越深刻, 更多的人追求天然绿色的健康理念, 故HSCCC 作为一种对提取物污染小的制备技术, 它的应用越来越受到了人们的关注。
鉴于HSCCC的显著特点, 此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域。
目前,HSCCC已从制备型发展到了分析型, 甚至是微量分析型, 应用范围也十分广泛[ 2]。
高速逆流色谱技术在我国的应用较早, 技术水平在国际领域也处于领先地位。
目前, 我国是世界上为数不多的高速逆流色谱仪生产国之一。
我国的深圳同田生化技术有限公司是全球第一家多分离柱高速逆流色谱仪专业生产企业。
公司拥有自主知识产权的高速逆流色谱专利技术, 现已研制并生产出TBE 系列分析型, 半制备型TBE 300，300A, 制备型TBE1000高速逆流色谱仪设备。
2.基本原理高速逆流色谱技术(HSCCC)是一种不用任何同态载体的液-液色谱技术，其分离原理是进行分离纯化时，首先选择预先平衡好的两相溶剂中的一相为固定相, 并将其充满螺旋管柱, 然后使螺旋管柱在一定的转速下高速旋转, 同时以一定的流速将流动相泵入柱内。
高速逆流色谱溶剂体系筛选及其联用技术
02 03
拓展高速逆流色谱与其他技术的联用范围
将高速逆流色谱与更多的分析技术联用，如红外光谱、拉 曼光谱等，以实现对复杂样品中目标化合物的更全面、更 准确的分析和鉴定。
拓展应用领域
将所建立的方法应用于更多领域的实际样品中，如环境污 染物、生物大分子等，以拓展其应用范围和应用价值。同 时，积极探索高速逆流色谱技术在其他领域中的潜在应用 前景。
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研究高速逆流色谱溶剂体系筛选及其联 用技术，对于提高天然产物、药物等复 杂体系的分离纯化效率具有重要意义。
溶剂体系筛选是HSCCC技术中的关键 环节，直接影响分离效果和分离纯度。
国内外研究现状及发展趋势
01
国内外学者在HSCCC溶剂体系 筛选方面进行了大量研究，涉 及不同类型的溶剂体系和实验 条件。
时监测和分离纯化。
案例分析：成功应用实例分享
中药活性成分分离纯化
利用HSCCC-MS联用技术，成功从中药复杂体系中分离出多种活性ห้องสมุดไป่ตู้分，并进行结构鉴定和定量 分析。
天然产物化学成分研究
利用HSCCC-NMR联用技术，对天然产物中的化学成分进行在线结构解析和定量分析，为天然产 物的开发利用提供有力支持。
分离等。
实验结果可靠性
对实验结果的重复性、稳定 性和准确性进行评估，确保 实验结果的可靠性。
存在问题及改进方向
实验操作问题
反思实验过程中可能存在的操作不规范、误差较大等问题， 提出改进措施，提高实验操作的准确性和可重复性。
溶剂体系选择局限性
讨论当前溶剂体系选择的局限性，探索更多可能的溶剂组 合，以扩大高速逆流色谱的应用范围。
02 高速逆流色谱技术基础
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400
流速: 2.0 ml 转速：800 rpm 样品量：150 mg 粗提物 机型：TBE-300A 固定相保留： 60% Ⅰ：花椒毒素 95.0％ 7.6 mg Ⅱ: 异茴芹素 99.6％ 7.6 mg Ⅲ: 佛手苷内酯 99.7％ 9.7 mg Ⅳ: 欧前胡素 100％ 60.5 mg Ⅴ: 蛇床子素 100％ 50.6 mg Ⅵ:未知化合物 98.1％ 10.2 mg min-1
实例3 白花败酱异戊烯基黄酮的分离
溶剂系统: 正己烷-乙酸乙酯－甲醇-水 (5:6:6:6) 流动相：下相 流速: 1.0-2.0 ml min-1 转速：850 rpm 样品量：400 mg 粗提物 固定相保留： 65% 分离温度: 25°C 机型：TBE-300A Ⅰ: orotinin （牡荆苷）99.2％ 38.2 mg Ⅱ: orotinin-5-methyl ether 98.5％ 19.8 mg Ⅲ: licoagroachalcone B 97.6％ 21.5 mg Journal of Chromatography A,1102(2006)44-50
两相溶剂体积选择
• 色谱理论,样品分离的必要条件是合适的分配系数。溶剂 体系的选择对于HSCCC十分关键,通常来说,两相溶剂体系 应满足以下要求: • (1)为保证固定相保留值合适(不低于50% ) ,溶剂体系的分 层时间要小于30 s。 • (2)目标样品的分配系数K接近于1,容量因子应大于1. 5。 • (3)上下两相的体积大致相等,以免浪费溶剂。 • (4)尽量采用挥发性溶剂,以方便后续处理,易于物质纯化。 • Ito博士根据在螺旋管中行星运动的溶剂流体力学特性将溶 剂分为疏水性、中等疏水性和亲水性体系 。
Absorbance(mAU)
600
cinnamic acid
500
400
em odin aloe-emodin rhein physcion chrysophanol
300
200
100
0 0 10 20 30 40
Tim e/min
I II
1000
III
IV
V
Absorbance(mV)
800
600
三、高速逆流色谱应用
高速逆流色谱技术的应用领域
1 高速逆流色谱在中药现代化中的应用 2 高速逆流色谱在抗生素分离纯化中的应用 3 高速逆流色谱在异构体分离纯化中的应用 4 高速逆流色谱在食品行业中的应用 5 高速逆流色谱在化学合成中的应用 6 高速逆流色谱在生物领域中的应用 7 高速逆流色谱在发酵产物分离纯化中的应用
HSCCC图谱
不同产地丹参提取物
HPLC图谱
800
Evodiamine
1-Methy-2-[(6Z,9Z)]-6,9pentadecadienyl -4-(1H)-quinolone Evocarpine
600
Rutaecarpine 400
1-Methyl-2-dodecyl4-(1H)-quinolone
200
0 0 10 20 30 40 50 60
Time (min)
1000
I II III
IV
V
VI
Absorbance (mV)
800
600
400
200
0
100
200
300
400
500
Time (min)
Journal of Chromatography A, 2004, Volume 1055, Issues 1-2, 71-76
HSCCC在分离中药单体中的应用(黄酮类)
1000
I
II
Time (min) IV V III
Absorbance (mV) / 254 nm
800
600
400
200 0 100 200 300 400 500 600
Time (min)
J. Chromatogr. A, 2005, vol 1074/1-2 pp. 139-144
芦荟提取物HSCCC分离图谱 分离图谱 芦荟提取物
140 120 Absorbance (OD280nm) 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Time (h)
T im e ( m in )
2 0 0 mAU (280nm)
A3
B3
1 0 0
0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 T im e ( m in )
芦荟未知物
A 芦荟苷A 芦荟苷B
丹参提取物的HSCCC分离图谱 分离图谱 丹参提取物的
丹酚酸 B
沙棘提取物的HSCCC图谱 图谱 沙棘提取物的
异鼠李素
山奈酚 槲皮素
荔枝草提取物的HSCCC图谱 图谱 荔枝草提取物的
208.000 [mv]
高车前素
泽兰黄酮
164.400
120.800
未知物
77.200
实例1 大黄有效成分的分离
HSCCC条件： 固定相：乙醚 流动相：1%NaH2PO4-1%NaOH 梯度 洗脱(500min内,由100:0-0:100) 流速: 2.0 ml min-1 转速：800 rpm 样品量：120 mg 粗提物 固定相保留：40% 机型：TBE-300A Ⅰ：rhein（大黄酸）19 mg Ⅱ: cinnamic acid（苯乙烯酸）19 mg Ⅲ: emodin（大黄素）18 mg Ⅳ: aloe-emodin（芦荟大黄素）14 mg Ⅴ: chrysophanol （大黄酚）10 mg Ⅵ: physcion（大黄素甲醚）6 mg 纯度均在98％以上
固定相的保留
利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产生的二维 离心力场形成的单向性流体动力学平衡（HDES） 从而实现流动相高速移动时固定相的保留
混合区：在靠近离心轴
心大约有四分之一的区 域，两相的激烈混合
静置区：两相溶剂分成
两层，重相在外部，轻 相在内部
以1000转/分的速率进行旋 转，在二维力场的作用下 分离管柱内混合和传递的 频率可达到17次/S，从而 实现高效的分离
Imperatorin 800
HSCCC条件： 溶剂系统: 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水 流动相：梯度洗脱
0-150 min:5:5:5:5下相 150-250 min:5:5:6:4下相 250 min后: 5:5:6.5:3.5下相
600 Bergapten Isopimpinellin Xanthotoxin 200 Unknown 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Osthole
VI
400
200
0
100
200
300
400
500
Time/min
Journal of Chromatography A,2004,Volume 1052, Issues 1-2, Pages 217-221
HSCCC在分离中药单体中的应用（香豆素类）
实例2 蛇床子有效成分的分离
Asorbance (mAU)
HSCCC的工作流程
实物照片
二、高速逆流色谱优点
不用固态载体的高效液不用固态载体的高效液-液分配色谱技术
不存在样品的不可逆吸附，理论回收率 不存在样品的不可逆吸附，理论回收率100% 样品负载能力强，制备量大， 样品负载能力强，制备量大，重现性好 操作成本低，无制备柱消耗， 操作成本低，无制备柱消耗，后续投入较低 可采用广泛的溶剂体系和多样性的操作条件 操作简单， 操作简单，无需太多样品前处理
0
Time (h)
10
20
30
40
T im e ( m in )
1 60
100
Absorbance (OD280nm)
80
A2
60
mAU (280nm)
1 20 8 0 4 0 0 0 1 0
B2
40
20
2
30
40
0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Time (h)
高速逆流色谱技术
1 高速逆流色谱原理 2 高速逆流色谱优点 3 高速逆流色谱应用
一、高速逆流色谱原理
液－液分配色谱
利用一种流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂( 利用一种流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂(固定 两相溶剂 相和流动相) 螺旋管中高效地接触、混合、 相和流动相)在螺旋管中高效地接触、混合、分配和传 中高效 递 其中固定相以一种相对均匀的方式分布在一根聚四氟 乙烯管绕成的螺旋管中 流动相以一定的速度通过固定相，并按照被分离物质 流动相以一定的速度通过固定相， 分配系数的不同依次洗脱而获得分离
• 以下两种疏水性范围很宽的体系：正己烷/ 乙酸乙酯/甲醇/正丁醇/水;氯仿/甲醇/水 • 对于未知样品一般采用正己烷/乙酸乙酯/甲 醇/水(1∶1∶1∶1)，通过检测样品在上下 相中的分配情况再进行修改。选到大概的 比例再进行试验，直到选到适当 的溶剂比 例。
HSCCC在分离中药单体中的应用（蒽醌类）
33.600
-10.000 0.00
24.00
48.00
72.00
96.00
120.00 144.00 168.00 192.00 216.00 240.00 [min]
250
实例
200
A1
Absorbance (OD280nm)
mAU (280nm)
200
B1
150
100
100
50
0
0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
HSCCC在分离中药单体中的应用（生物碱类）