[学习]高速逆流色谱原理及应用
高速逆流色谱法
HSCCC进样体积可达到柱体积的20%，广泛用于制备 性分离。
参数
固定相 机理
溶质与固定相作用
上样量 分离效率
操作 费用 危险性
HSCCC
色谱分离是依据被分离物在两相中分配系数的不同而 进行；
逆流色谱是利用物质在两相液体中分配系数的不同实 现分离；
分离也可以依据被分离物在一个含有沉淀剂的浓度梯 度变化的单一溶剂中的溶解度的不同而实现。
（前提：沉淀剂浓度梯度移动的速度远低于溶剂流速）
溶解度具有很小差异的物质，经过在柱中反复的沉淀 和溶解即可达到分离。
二、基本原理
现代逆流色谱仪器体系： 1. 流体静力学平衡体系
2. 流体动力学平衡体系（HSCCC体系） 仪器的两个特征：
a 有一个或多个缠绕有多层聚四氟乙烯管的线轴； b 没有旋转密封接头，有一个安装有两个旋转轴的齿轮传动装置，
能产生一个可变的离心力场。
通过公转、自转（同步 行星式运动）产生的二 维力场，保留两相中的 其中一相作为固定相；
广义定义： 1. 任何利用两相不混溶液体的色谱技术； 2. 其中一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管
或一系列的腔体中； —— 固定相 3. 同时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。
—— 流动相
减少了溶质分子与固体支撑体之间各种复杂的相互作 用；
不仅可以获得高纯度的分离组分；
同时具有较高的回收率和重现性。
离心沉淀色谱（centrifugal precipitation chromatography, CPC）是一种建立在类似于逆流色谱 的不用固体支撑体的开放性通道基础上的沉淀和溶 解色谱。
高速逆流色谱技术原理及应用领域
• 20世纪70年代，逆流色谱(CCC)。首先 出现液滴逆流色谱(DCCC)
溶剂 泵
进样器
进样器
溶剂 约300根管柱 上行法 收集器
泵 收集器 约300根管柱 下行法
优点：DCCC仪器轻巧简便，能避免乳化或泡沫的产生。 缺点：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程 长，一般需要几十小时才能完成一次几个组分的分离．
分离管内侧 ——————————————————————————————————————— ………………………………ooooo……ooooo②……oooo……………………………………… ………………………………………ooo…………oooo………………③……………………… ………………………………oooo①oo……ooooooo……oooo…①…………………………… ①②③④ ooooooooooooooooooooooooo……③……oooo…………ooooooooooooooooooooooooooooooo ooooooooooooooooooooooooo…oo……ooo④oo……ooo…ooooooooooooo④oooooooooooooo oooooooooooooooooooooooooo………oooo……oooo………oooooooooooooooooo②ooooooooo ——————————————————————————————————————— 分离管外侧 ①③组分，由于在轻相中的分配系数过大不易被流动相洗脱下来 ②④组分，根据在重相的分配系数大小按顺序洗脱出来分离区 ………………――――轻相 oooooooooooo――――重相 ①②③④——样品（4组分）
作为多分离柱高速逆流色谱仪国家新型 专利的拥有者、高速逆流色谱领域的领导者， 我们与通用电气医疗生物科学中国有限公司 （ GE Healthcare Bio-sciences co.,ltd . ） 建立 了长期的合作伙伴关系 .
高速逆流色谱高速逆流色谱高速逆流色谱高速逆流色谱
高速逆流色谱High Speed Countercurrent Chromatography（HSCCC）逆流色谱是利用溶质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同，应用色谱层析的方法，将不同溶质分离。
逆流色谱的发展从逆流分配、液滴逆流色谱直至现在的高速逆流色谱，经历了近60年的历程，技术和设备均已日益成熟，现越来越多地应用于中药及天然药物的研究开发。
高速逆流色谱特点：! 无不可逆吸附# 液—液层析系统，无样品与固定相之间的不可逆吸附! 高回收率# 流动相和固定相均为液体，样品可全部回收! 操作简便# 固定相为液体，体系更换、平衡方便、快捷。
高速逆流色谱原理：高速逆流色谱是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相（固定相），利用恒流泵连续输入另一相（流动相），随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。
在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脱。
图1是螺旋柱中互不相溶的两相溶剂在行星运动时的流体动力学运动及分配示意图。
上图，在达到稳定的流体动力学平衡态后，柱中呈现两个截然不同的区域：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域（混合区）呈现两相的激烈混合。
其余区域（静置区）两溶剂相分成两层：较重的溶剂相在外部，而较轻的溶剂相在内部，两相形成一个线状分界面。
下图，I到IV的展开柱，分别与上图中I到IV位置相对应，每一混合区以跟柱旋转速度相同的速度向柱头端移动（与海面波的运动相似）。
在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂都在反复进行混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，当柱以800rpm旋转时，频率超过13次/秒，流动相则不断地穿过固定相。
所以高速逆流色谱在一个较宽的流动相流速范围内，仍有相当高的分配效率。
图1 螺旋柱中两溶剂相流体动力学运动及分配高速逆流色谱应用：1. 旋转速度在逆流色谱中，留在柱中固定相的量是影响溶质峰分离度的一个重要因素，一般说来，高保留量会大大改进峰分离度。
高速逆流色谱原理及应用
高速逆流色谱的仪器设备
高速逆流色谱系统由高压泵、进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统等组 成，其中色谱柱是核心部件。
高速逆流色谱的应用领域
高速逆流色谱在药物分析、天然产物研究、环境监测和食品安全等领域具有广泛的应用。
高速逆流色谱与传统色谱快、样品损失少等优点，适用于复杂样品的分析。
高速逆流色谱的优势和局限性
高速逆流色谱具有高灵敏度、高分辨率和多样性等优势，但对样品前处理要求严格，并且柱寿命较短。
总结与展望
高速逆流色谱作为一项重要的分析技术，将继续发展并在更多领域中发挥重要作用，为科学研究和工业应用提 供支持。
高速逆流色谱原理及应用
高速逆流色谱（HPLC）是一种高效、准确的分析技术，广泛应用于生物医药、 食品安全和环境监测等领域。
高速逆流色谱的介绍
高速逆流色谱是一种液相色谱技术，利用高压泵将样品溶液通过色谱柱，以不同的化学性质分离样品中的化合 物。
高速逆流色谱的原理
高速逆流色谱基于溶质的分配与吸附过程，通过调节移动相和静态相的性质，实现对样品中化合物的分离和分 析。
高速逆流色谱在天然产物分离提取中的应用-PPT
作者 王凤美
原料 丹参水溶性成分 丹酚酸类物质
溶剂体系 正己烷-醋酸乙酯-水-甲苯 (1.5:5:5:1.5)
分离物质 丹酚酸 B
Tian G L 山茱萸
乙酸乙酯-正丁醇-水(5:1.8:6) 乙酸乙酯-乙醇-水(5:0.5:6)
没食子酸
黄健光
正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水(7:3:6:4) 邻苯二酚和对苯二酚
溶剂系统
正己烷-乙酸乙酯-乙腈-水（2：2:1:0.6:2） 乙酸乙酯-乙醇-水（15:1:15） 乙酸乙酯-水（1:1） 正丁醇-乙酸乙酯-水（2:8:5） 乙酸乙酯-水（1:1） 乙酸乙酯-乙醇-水（4:1:5） 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.2:0.8） 和石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.4:0.6） 梯度洗脱
原料 吴茱萸 黄花乌头 附子 金果榄
绿茶
溶剂体系 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (5∶5∶7∶5) 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.2mol/L HCl (1∶3.5∶2∶4.5) 氯仿-甲醇-0.3mol/L 盐酸 (4:3:2) 氯仿-甲醇-0.2mol/L 盐酸 (2:1:1) 氯仿-甲醇-0.2mol/L 盐酸
Liu R M 秦皮
正丁醇-甲醇-0.5%乙酸(5:1.5:5)
秦皮素、七叶甙、秦 皮甙和七叶素
3、7 其她类化合物得分离提取
作者 佘佳红
原料 银杏叶
溶剂体系 氯仿-甲醇-水(4:3:2)
分离物质 白果内酯
Du Q Z
穿心莲
正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(1:4:2.5:2.5)
穿心莲内酯和新穿心 莲内酯
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
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a、仪器对保留值得影响(外因)
高速逆流色谱仪原理特点及应用
高速逆流色谱仪原理特点及应用一、简介高速逆流色谱（HPLC）是一种高效、精准的分析技术，它广泛应用于化学、制药、环保、食品等领域。
高速逆流色谱仪是高速逆流色谱技术的核心设备，能够对各种化合物进行分离和检测。
在本文中，我们将介绍高速逆流色谱仪的原理、特点及应用。
二、原理高速逆流色谱仪使用液相色谱技术，其基本原理是将待测样品溶液经过一定的处理后，注入色谱柱，通过色谱柱内液相的物理化学作用，将各种组分分离出来，并用检测器检测分离出来的化合物。
高速逆流色谱仪相较于其他色谱仪的优势在于可以在极短的时间内完成大量的分离、检测等操作。
高速逆流色谱仪的原理是基于其内部的色谱柱，其内部结构可以细分为装载柱、色谱柱和联接管。
样品通过色谱柱时，每种组分将被一步一步地分离出来，直到达到检测器，最后数据将被转换为电子信号，并通过数据处理软件进行分析和处理。
三、特点1. 高效HPLC技术的一大优势在于其高效性，使用HPLC技术可以在更短的时间内分离出更多的物质成分，从而提高分析效率。
2. 精准由于高速逆流色谱仪的高分辨率和灵敏度，其能够分离出复杂物质的成分，从而提供更加准确的结论。
3. 多种检测方式高速逆流色谱仪可使用不同类型的检测器，如紫外检测器、荧光检测器等，可以检测多种类型的化合物成分。
4. 适用范围广高速逆流色谱仪不仅适用于小分子化合物的分离和检测，也可以用于生物大分子、天然产物、有机和无机化合物等物质的分离和检测。
四、应用高速逆流色谱仪广泛应用于化学、生命科学、环境科学、食品科学等领域，其准确性和高效性为这些领域的研究和实践提供了重要的技术支持。
1. 化学在化学领域中，高速逆流色谱仪通常在合成新药物、分离小分子化合物、分析毒物、研究反应机理等方面有着广泛的应用。
2. 生命科学高速逆流色谱仪在生命科学领域可以用于分析蛋白质、氨基酸、核酸和多糖等生物大分子，可以检测蛋白质含量和组成，研究生物大分子的三维结构，为分子生物学、细胞生物学和基因工程研究提供技术支持。
高速逆流色谱
400
流速: 2.0 ml 转速：800 rpm 样品量：150 mg 粗提物 机型：TBE-300A 固定相保留： 60% Ⅰ：花椒毒素 95.0％ 7.6 mg Ⅱ: 异茴芹素 99.6％ 7.6 mg Ⅲ: 佛手苷内酯 99.7％ 9.7 mg Ⅳ: 欧前胡素 100％ 60.5 mg Ⅴ: 蛇床子素 100％ 50.6 mg Ⅵ:未知化合物 98.1％ 10.2 mg min-1
实例3 白花败酱异戊烯基黄酮的分离
溶剂系统: 正己烷-乙酸乙酯－甲醇-水 (5:6:6:6) 流动相：下相 流速: 1.0-2.0 ml min-1 转速：850 rpm 样品量：400 mg 粗提物 固定相保留： 65% 分离温度: 25°C 机型：TBE-300A Ⅰ: orotinin （牡荆苷）99.2％ 38.2 mg Ⅱ: orotinin-5-methyl ether 98.5％ 19.8 mg Ⅲ: licoagroachalcone B 97.6％ 21.5 mg Journal of Chromatography A,1102(2006)44-50
两相溶剂体积选择
• 色谱理论,样品分离的必要条件是合适的分配系数。溶剂 体系的选择对于HSCCC十分关键,通常来说,两相溶剂体系 应满足以下要求: • (1)为保证固定相保留值合适(不低于50% ) ,溶剂体系的分 层时间要小于30 s。 • (2)目标样品的分配系数K接近于1,容量因子应大于1. 5。 • (3)上下两相的体积大致相等,以免浪费溶剂。 • (4)尽量采用挥发性溶剂,以方便后续处理,易于物质纯化。 • Ito博士根据在螺旋管中行星运动的溶剂流体力学特性将溶 剂分为疏水性、中等疏水性和亲水性体系 。
Absorbance(mAU)
高速逆流色谱仪原理特点及应用
高速逆流色谱仪原理特点及应用气路管路、进样器、注射器的清洗清洗气路连接管时，应首先将该管的两端接头拆下，再将该段管线从色谱仪中取出，这时应先把管外壁灰尘擦洗干净，以免清洗完管内壁时再产生污染。
清洗管路内壁时应先用无水乙醇气路管路、进样器、注射器的清洗清洗气路连接管时，应首先将该管的两端接头拆下，再将该段管线从色谱仪中取出，这时应先把管外壁灰尘擦洗干净，以免清洗完管内壁时再产生污染。
清洗管路内壁时应先用无水乙醇进行疏通处置，这可除去管路内大部分颗粒状堵塞物及易被乙醇溶解的有机物和水分。
在此疏通步骤中，如发觉管路不通，可用洗耳球加压吹洗，加压后仍无效可考虑用细钢丝捅针疏通管路。
如此法还不能使管线畅通，可使用酒精灯加热管路使堵塞物在高温下炭化而实现疏通的目的。
用无水乙醇清洗完气路管路后，应考虑管路内壁是否有不易被乙醇溶解的污染物。
如没有，可加热该管线并用干燥气体对其吹扫，将管线装回原气路待用。
假如由分析样品过程判定气路内壁可能还有其它不易被乙醇溶解的污染物，可针对实在物质溶解特性选择其它清洗液。
选择清洗液的顺序应先使用高沸点溶剂、而后再使用低沸点溶剂浸泡和清洗。
可供选择的清洗液有萘烷、N、N—二甲基酰胺、甲醇、蒸馏水、丙酮、乙醚、氟里昂、石油醚、乙醇等。
对进样器（包含汽化室）的清洗应以疏通为先导。
通常在进样器中的堵塞物是进样隔垫的碎片，样品中被炭化了的高沸点物，对这些固态杂质可用不锈钢捅针疏通，然后再用乙醇或丙酮冲洗。
为了使清洗更彻底，可选用2：1：4的H2SO4/HNO3/H2O混合溶液先对进样器清洗，然后再用蒸馏水，最后再用丙酮或乙醇清洗。
清洗完后烘干，装上仪器通载气半小时，加热到120℃待几小时后即可正常工作。
在拆装进样器时需注意不要碰断加热器引线或使引线碰到外壳；测温元件也应在装回进样器之后，按原先测温点装回。
通常测温元件和进样器加热体是紧密接触的，如距离过大将会造成过高的汽化温度。
注射器使用前可先用丙酮清洗，以免玷污样品，但可以还是用待注射样品对注射器自身做一二次清洗。