高速逆流色谱分离技术
逆流色谱基本原理
高速逆流色谱原理(HSCCC：High Speed Counter-Current Chromatography)液相色谱系统构成高速逆流色谱系统构成TBE300A＋ÄKTA Prime逆流色谱原理萃取：利用物质在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使物质从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。
逆流色谱原理液－液分配色谱：利用样品中各组分在两相溶剂间分配比的差异，进行分离。
它是不用固态载体的全液态的液-液分配色谱技术.优点：不存在样品的不可逆吸附，理论回收率为100％极大地避免了样品的变性问题操作简单，无需太多样品前处理等。
HSES 流体静力平衡体系在充满下（上）相的螺旋管内慢慢注入上（下）相，最终会形成整个管柱里上下两相交替分段分布的状态。
无论哪一相作为流动相，都能建立起流体静力平衡状态。
如果流动相与管壁亲和性强，它会均衡沿管壁流过形成连续流，如果亲和性较弱，会形成小滴穿过固定相。
液滴逆流色谱(DCCC)旋转腔室逆流色谱(RLCCC)离心分配逆流色谱仪(CPC)利用离心力产生的恒定立场讲固定相保留在又管道连接的一系列腔体中。
优点：噪声小、平衡性好，多数溶剂系统都可在该仪器使用，流动相流速为数毫升每分钟。
由于死体积存在，两相溶剂难以充分混合，与同体积的流体动力学的逆流色谱仪相比分离效率差。
这类一起都是采用旋转密封接头，不可避免产生溶剂渗漏问题。
HDES流体动力平衡体系螺旋管力能保留住任一相充当的固定相，并能形成在数量上超过螺旋单元数的分配单元。
在螺旋管的各个部位，由大量小滴构成了两相间广阔的界面，这些小滴在支撑相里剧烈而稳定的震荡，减小了质点传递阻力，避免了使样品区带展宽的层流的产生。
螺旋管里不存在完全由流动相占据的无效空间，无论以哪一相做流动相，在整个螺旋管的有效空间里总是有一相会形成剧烈而稳定震动小滴，靠这样的运动和分布能开发出有效的逆流色谱仪。
两相不相溶的溶剂在一根绕自身轴旋转的螺旋管内，其中一相的小液滴会向首端迁移，另一相向尾端迁移。
高速逆流色谱法分离纯化红曲色素组分
1922010, Vol. 31, No. 20食品科学※工艺技术高速逆流色谱法分离纯化红曲色素组分郑允权 1 ，李泳宁 1 ，王阿万 2 ，陈芬玲 2 ，石贤爱 2 ，郭养浩 1 , 2 , *(1.福州大学药物生物技术与工程研究所，福建 福州 2.福建省医疗器械与医药技术重点实验室，福建 福州 350002； 350002)摘 要：采用高速逆流色谱法(HSCCC)分离纯化红曲发酵产品中 6 种 Azaphilone 类色素组分。
筛选弱极性分离溶剂 系统正己烷 - 醋酸乙酯 - 甲醇 - 水，研究 6 种色素组分在不同溶剂体系中的分配系数，建立两步逆流萃取分离的技术 路线。
经过 HPCCC 分离纯化和丙酮结晶操作，得到 6 种高纯度的 Azaphilone 类色素组分，纯度均大于 98.5%，得 率达到 81.40%～84.78%，所得的 6 种色素组分的摩尔吸光系数分别为 13313、13877、9380、9360、25621、25849 L/(mol·cm)。
本研究可提供一种新型的制备高纯度红曲 Azaphilone 类色素组分的技术路线。
关键词：红曲色素；高速逆流色谱；分离纯化Separation and Purification of Monascus Pigments by High-speed Counter-current ChromatographyZHENG Yun-quan1，LI Yong-ning1，WANG A-wan2，CHEN Fen-ling2，SHI Xian-ai 2，GUO Yang-hao1,2,* (1. Institute of Pharmaceutical Biotechnology and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350002, China； 2. Fujian Key Laboratory of Medical Instrumentation and Pharmaceutical Technology, Fuzhou 350002, China) Abstract： azaphilone-type pigments were separated from Monascus-fermented solid medium and purified/fractionated by Six by high-speed counter-current chromatography (HSCCC). A solvent system with weak polarity involving four components nhexane, ethyl acetate, methanol and water was selected and used for HSCCC. Based on a comparative analysis of partition coefficients of target compounds in different solvent systems, a two-step HSCCC routine was developed. After separation by HSCCC and crystallization with acetone, six azaphilone-type pigments with high purity were obtained. The purity of each pigment was above 98.5% and their yields were between 81.40% and 84.78%. Their molar absorption coefficients were 13313, 13877, 9380, 9360, 25621 L/(mol·cm) and 25849 L/(mol·cm), separately. Key words：Monascus pigments；high-speed counter-current chromatography；separation and purification 中图分类号：TS202；Q819 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)20-0192-04红曲霉菌发酵产品的生产与应用在我国已有一千多 年历史，主要用于食品着色、酿酒和传统中药材。
高速逆流色谱法分离纯化丁公藤中东莨菪内酯
·药品检验·2012年9月第9卷第26期中国医药导报CHINA MEDICAL HERALD丁公藤，是旋花科植物丁公藤（Erycibe obtusifolia Benth.）或光叶丁公藤（Erycibe schmidtii Craib ）的干燥藤茎，全年均可采收，切段或片，晒干[1]，制成中药饮片，具有解表发汗、抗炎、疏风祛湿、舒筋活络、消肿止痛等功效。
丁公藤的化学成分主要有东莨菪内酯、东莨菪苷、咖啡酸和氯原酸等[2-3]，其中东茛菪内酯具有祛风、抗炎、止痛、抗真菌和抗肿瘤作用[4]，因此建立东莨菪内酯的分离提纯方法具有重要意义。
高速逆流色谱（high-speed counter-current chromatogra -phy ，HSCCC ）是近年来发展起来的新型、不使用固态支撑体或载体的连续液-液分配色谱技术，具有分离速度快、样品吸附低、分离重现性好等优点[5-6]，已被广泛应用于天然药物成分的分析鉴定及分离制备。
东莨菪内酯为香豆素类化合物，目前香豆素的传统分离多采用柱色谱和薄层色谱法，操作繁琐，本实验采用半制备型高速逆流色谱仪从丁公藤粗提物中成功分离纯化出东莨菪内酯，经高效液相色谱峰面积归一化法分析，纯度达到98.04%，为香豆素类化合物的高效、方便和快速分离提供了有效借鉴。
1仪器与试剂1.1仪器TBE 300B 高速逆流色谱仪（上海同田生物技术有限公司），AKTA prime 泵及检测系统（美国通用电器医疗集团），LC-20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），HH-1型数显恒温水浴锅（江苏省荣华仪器制造有限公司），9312A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂），DFT-100J 型手提式高速中药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司），C3860型超声波清洗器（河南省巩义市英峪予华公司），Milli-Q Academic 超纯水器（法国密理博有限公司）。
1.2试剂东莨菪内酯标准品（购自中国药品生物制品检定所，批号：110768-200504），粗提物的制备及高速逆流所用的有机溶剂正己烷、乙酸乙酯和甲醇均为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司），HPLC 分析用甲醇为色谱纯（美国Fisher 公司），实验室用水是自制的超纯水。
中药有效成分分离应用中的高速逆流色谱技术
高 速 逆 流 色 谱 技 术 （ ｉｈ ｓｅｄＣ ｕ ｔ ｃｒ ｎ ｈｏ ｍ ｔ ｒ— 酸 钠 缓 冲液 （ ．， ：） 溶 剂 系 统 ． 苦 参 中 分 离 得 到 苦 参 生 Ｈ ｇ—ｐ ｅ ｏ ｎｅ ｕｒ ｔ ｒ— ａｏ ａ ｒ ｅ Ｃ ｇ ｐ ６２ １ １为 Ｈ 从
ｐ ｙ 简 称 Ｈ Ｃ Ｃ） 是 由 ２ ｈ， ＳＣ 。 ０世 纪 ８ ０年 代 初 美 国 国立 健 康 研 究 院 Ｉ ｔ 授 在 液 液 分 配 色 谱 的 基 础 上 建 立 的 一 项 分 离 技 术 。 体 动 ０教 流 力 学 中 有 一 种 特 殊 的 动 力 学 平 衡 现 象 一 单 向 流 ． Ｃ Ｃ就 是 利 ＨＳ Ｃ 系 数 不 同 ， 质 在 两 相 溶 剂 中 进行 分 配 平 衡 ， 而 使 不 同 成 分 得 溶 从
属 于 生 理 活性 物 质 。 然 他 们 不 被 认 为 是 维 生 素 ， 是 在 生 虽 但 分 与 糖 形 成 苷 ， 分 以 游 离 的形 式 存 在 。 部
物 体 内 的 反 应 里 ， 认 为 有 营 养 功 能 。这 类 化 合 物 种类 较 多 大 部 人 参 皂 苷 Ｒ 被 ｅ和 Ｒ ｌ ｇ 。孙 成 贺 等［ 乙酸 乙酯 一 丁 醇 一 （ ： ： ） ７ １ 以 正 水 １ ６７ 孙 印石等【 １ 以石 油 醚 一 酸 乙酯 一 醇 一 ｆ 积 比为 ２４３３ 乙 甲 水 体 ：：： 皂 苷 Ｒ 。 艳 艳 等［ ） ｅ王 ８ １ 仿 一 醇 一 丁醇 一 （ ： ２４ 为溶 剂 系 以氯 甲 正 水 ５４： ：） 为 两 相 溶 剂 系 统 ， 陈 皮 中 分 离 出 橙 皮 苷 、 皮 素 和 ５ 羟 基 一 统 ， 龙 胆 中分 离 制 备 高 纯 度 龙 胆 苦 苷 。 它 还 有 以 氯 仿 一 在 桔 一 从 其 甲醇 一 ６７８ ，五 甲 氧基 黄 酮 。 厚 鼎 等 日 ， ，，－ ，３ ４ 骆 以正 庚 烷 一 酸 乙 酯一 乙 甲醇 一 异 丙 醇 一 （ ：：：）上 相 为 固 定 相 ， 相 为 流 动 相 ， 用 高 速 逆 水 ５６ Ｉ４ ， 下 采 水 （：：：Ｖ ｖ ， 相 （ 机 相 ） 固定 相 ， 相 （ 相 ） 流 动 相 ， ２３２３ 厂）上 ， 有 为 下 水 为 分 流 色 谱 法 分 离 纯 化 刺 五 加 粗 品 中 的 刺 五 加 苷 Ｅ： 用 正 丁 醇 一 采 乙 离 出 卷 柏 中 三 种 高 纯 度 黄 酮类 化 合 物 ， 阿曼 托 双 黄 酮 、 伯 茨 酸 乙酯 一 （ ： ： ） 为 罗 水 ４ ２ ５ 相 ， 上 下 分 双 黄 酮 、 柏 双 黄 酮 。曲 丽 萍 等 ｌ 定 氯 仿 一 扁 ３ 】 选 甲醇 一 ｆ ： ：） 两 离 连 翘 中 的 连 翘 酯 苷 ； 用 正 己 烷 一乙 酸 乙 酯 ～ 醇 一 一 １ ４ 水 ４ ３ ２为 采 乙 水 （ ：： 相 溶 剂 系 统 ， 离 制 备 淡 豆 豉 中大 豆 素 和 染 料 木 素 。其 它 还 有 乙 分
高速逆流色谱法分离制备辛夷中的表木兰脂素A
声溶解后 得 到 １ｍ ／ Ｌ的样 品溶液 ， ０ ｇｍ 备用 。
１ ４ Ｈ Ｃ Ｃ分离 纯 化方 法 ． Ｓ Ｃ 将 两相 溶 剂 系统 中 已超 声 脱 气 的上相 （ 固定 相 ） ２ Ｌ ｍｉ 以 ０ｍ ／ ｎ的速度泵 入 ＨＳ Ｃ Ｃ Ｃ分 离管 中 ， 上相充 满整 个 分 离管 后 ， 慢 调 节 主机 转 速 至 待 缓 ８ ０／ ｉ ， 时针旋 转 ， 时以 １ ２ｍＬ ｍ ｎ的速 度将 下 相 ８ ｒｍ ｎ 顺 同 ． ／ ｉ
安徽农学通报 ， ｎ ｕ Ａ ｒ ＳｉＢ ｌ ２ １ １ （５ Ａ ｈ ｉ ｇｉ ｃ． ｕ１ ０ ２，８ ０ ） ． ．
高 速 逆 流 色 谱 法 分 离 制 备 辛 夷 中的表 木 兰脂 素 Ａ
刘 宗红 于 波
１６２ ） ０ ９ １ （ 辽宁师范大学 生命科学学院 ， 辽宁大连
１５ Ｈ Ｌ ． Ｐ Ｃ条 件
色 谱柱 ：ｔｒ １ 柱 。流动 相 ： 为 Ｘｅ ａ ８ ｒ Ｃ Ａ相
１ 实验 部分
１１ 实验材料 ． Ｗａ ｒ公 司高 效 液 相 色 谱 仪 和 质 谱 仪 ； ｔｓ ｅ 高 速逆 流色谱 仪 （ 海 同 田生 化 技 术 有 限公 司 ） ５０ ｚ 上 ； ０ Ｈ
炎 、 敏 和降压 等药理 作用 … 。表 木兰脂 素具 有杀 昆虫 抗过 作用， 当饲料 中含 本 品 ＞１ ｇｍ ｍ ／ Ｌ时 ， 著 抑 制 黄 猩猩 果 显 蝇 幼虫 的生长 。对于 木 脂 素成 分 的分 离 国内外 已有 很 多
报 道且采 用 的分离手 段也 多为硅胶 和凝 胶柱 层析 法 ， 尚 而 缺 乏用 现代分 离技术 对辛夷 中木脂 素成 分 的分 离 。
高速逆流色谱在手性拆分中的应用
定相 的分离方 法 。 由于不需 要 固体 支撑体 ， 物质 依 据其在两相 中分 配系数 的不 同而 分离 ， 因而解
决 了 传 统 分 离 色 谱 因 不 可 逆 吸 附 而 引 起 的 样 品
损失 、 失活、 变 性等 问题 。由于这个 特点 ， 高速逆 流色谱特别适合 于天然生物活性成分的分离 。而
速旋转和分离过程 中不易 出现渗漏现象 。 高速 逆流色谱 的 目的主要 是制备 型分离 ， 目
前 已被 广 泛 应 用 于 植 物 中 生 物 碱 类 ，黄 酮 类 ， 萜
修 回 日期 ： ２ ０ １ ３ — ０ ４ — ２ ５ 作者简介 ： 黄林兵（ １ ９ ７ ９ 一 ） ， 男， 浙 江 台州 人 ， 工程师 ， 浙 江 大 学 应 用 化 学专 业 硕 士 学 位 ， 主要 从 事 化 工 、 医 药 方 面 的工 艺 设 计 。 电
的制备分离手段 。
１ ＨＳ ＣＣＣ 技 术
１ ． １ Ｈ ＳＣＣ Ｃ 发 展 过 程
上 世纪 ５ Ｏ年 代 ，逆 流 分 溶 法 （ ｃ ｏ ｕ ｎ ｔ ｅ ｒ ｃ ｕ ｒ ｒ ｅ ｎ ｔ ｄ ｉ ｓ ｔ ｒ ｉ ｂ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ， Ｃ Ｃ Ｄ） 被 广 泛 应 用 于 天 然 产 物 的分 离 。 但 是 由 于装 置 固有 的 一 些 缺 陷 ． 比 如设 备 庞 大 复
ｌ １ 避 免 了样 品 在 分 离 过 程 的不 可 逆 吸 附 、 分 解 等 可 能 的样 品变 性 问题 。 ２ １ 滞 留在 柱 中 的 样 品可 以 通 过 多 种 洗 脱 方
杂， 易碎 ， 溶剂体 系容易乳 化 ， 溶剂消 耗量大 和分
离 时 间太 长 等 ，很 快 在 ２ Ｏ世 纪 ６ ０年 代 被 液相 色 谱淘汰 。 在２ ０世 纪 ７ ０年代 ．一 种 结 合 了逆 流分 溶 和 液 相 色谱 的 优 点 的 方 法 ， 逆 流色谱 （ ｃ ｏ ｕ ｎ ｔ ｅ ｒ ｃ ｕ ｒ ｒ ｅ ｎ ｔ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ 。 Ｃ Ｃ Ｃ）法 被 用 来 进 行 连 续 的 逆 流 分 离 。基 于 这 种 方 法 的 液 滴 逆 流 色 谱 在 １ ９ ７ ２年 被 商 业 化 ，并 在 ２ ０世 纪 七 八 十 年 代 被 广 泛 用 于 天然 产 物 的 分 离 。但 是 这 种 装 置 所 需 分 离 时 间较 长． 通 常要 ２ ～ ３ ｄ 。 并 且 仅 有 有 限 的 溶 剂 体 系 可 以
高速逆流色谱快速分离四种甘草黄酮及其结构鉴定
表 １ 馏 分 Ｉ～ Ⅳ 在 正 己烷 一 乙酸 乙酯
一
ＴＢ ３ ０ 高速逆 流色 谱仪 ： Ｅ ０Ａ 上海 同 田生 化技术
有 限公 司 ；
ＡＫ ＴＡ ｒ 泵 及 紫 外 检 测 系 统 ： 国 Ｇ ｐｉ ｍｅ 美 Ｅ公
司；
ＨＸ １５ 恒温器 ： －００ 北京博 医康实验仪器有 限公
成分 被证 明 比甘 草酸具 有更 好 的抗 肿瘤疗 效［ 引。 ２ ￣
因植 物 甘草 种 属 多样 ， 同种 属 甘 草粗 提物 所 不
Ｉ 甘 草 黄 酮 醇 （ ｃ ｆａ ｏ ｏ ） ： Ｌｉｏ ｌｖ ｎ １
含 成 分差别 较大 ， 且有 效成分 含量 低 ， 市场上 一直 故
Ｉ： 草 紊 ｆ ｉ ｕｒｔ ｅ ｉ ） １甘 Ｌ ｑ ｉ ｉ ｎｎ ｉｓ
细胞 增殖 Ｌ 。 ３ 叫］
ｌ 甘 草 异 黄 酮 甲（ ￣ ｉ ｆａ ｏ ｅＡ） ｖ： Ｌｉｏ ｓ ｌ ｖ ｎ ｏ
图 １ 四种馏态载体 的液一
维普资讯
第 ２期
高速 逆流 色谱 快速分 离四种 甘草 黄 酮及 其 结构鉴 定
司；
甲醇一 水体 系中分配系数
Ａ ｌｎ ｅ２９ ｌａｃ ９ ６高效液相 色谱 仪 ： 国 Ｗａ ｒ ｉ 美 ｔｓ ｅ
公司；
色谱 柱 ：Ｓ ｎ ｒ １（２ｍｍ ｘ７ｍｍ，５ｔ ， ｕ ｆｅＣ８ １０ ｉ ０ ￣ ｍ）
美 国 Ｗａｅｓ 司 ； ｔｒ 公
ｎ － Ｃ ＮＭＲ 定 。 鉴
关键词 ： 高速逆流色谱
甘草黄酮醇 甘草素 芒柄花素 甘草异黄酮甲
液分 配色谱 ， 已在 天 然产 物 分 离 纯 化 领域 得 到广 现
高速逆流色谱实验在有效成分分离中溶剂体系的选择
Ｓ ｌｃｉｎ ｏ ｏｖ ｎ ｙ ｔｍ ｏ ｇ － ｐ ｅ ｕ ｔｒ ｕ ｒ ｎ ｈ ｏ ｔｇ ａ ｈ ｅｅ ｔ ｆＳ ｌｅ ｔＳ ｓｅ ｆ ｒＨｉｈ ｓ ｅ ｄ Ｃｏ ｎ ｅ ｃ ｒｅ ｔＣ ｒ ｍａｏ ｒ ｐ ｙ ｏ
（ ｉ —ｐ ｅ ｃｕ ｔ — ｕｒｎ 定 的借鉴和指导作用。 ｈｇ ｓｅｄ ｏ ｎｅ ｃ ｒ ｔ ｈ ｒ ｅ
高 速 逆 流 色 谱
ｃｒｍ ｔｇａｈ ，Ｈ Ｃ Ｃ 是 ２ ｈｏ ａ ｒｐ ｙ Ｓ Ｃ ） ｏ ０世 纪 ８ ０年 代 发 展 起 １ 溶剂 体 系 （ 系统 ）的选 择 来 的 ，一种 不 使用 固态支 撑体 或 载体 连续 高效 的 ． 液一 液分 配色谱 技 术 ，利用 溶质 在两 种互 不相 溶 的溶 １１ 选择 原 则 溶 剂体 系 是所 有逆 流 色谱 的心 脏 ，它构 成逆 流色 剂 中分配 系数 的不 同 ，将 不 同物 质进 行有 效分 离 。相
ｉ ｅ ａ ａｉｎ ｏ ｅ Ａｃｉｅ Ｉ ｇ ｅ ｉｎ ｎ Ｓ ｐ ｒ ｔ ｆｔ ｔ ｎ ｄ ｅ ｔ ｏ ｈ ｖ ｒ
Ｇｕ ｏ“ ｌ，．ｊ ｉｇ ｈ ｎ，Ｃａ ｎ ｉ 】ｕＪ ｓ ｅ ｇ Ｌ ｎ ｉ Ｄａ
（ ｏｌｇ ｆ ｏ ｄ Ｓ ｉｎ ｅａ ｄＥｎ ｉｅｒｎ ， Ｊｌ ｎ ｕｔｒｌＵｎｖ ｒｉ ， Ｃｈ ｎ ｃ ｕ Ｃ ｌ ｅｏ ｏ ｃｅ ｃ ｎ ｇｎ ｅ ｇ ｉｎＡｇ ｃ ｌ ａ ｅ Ｆ ｉ ｉ ｕ ｉｅｓｔ ｙ ａ ｇｈ ｎ， Ｊｌ １ ｉｎ １ ０１ Ｃ ｉａ ｉ ３ ８， ｈｎ ） Ａｂ ｔ ｃ： Ｔ ｅＨｉｈ ｓ ｅ ｄｃ ｕ ｔｒｕ ｒｎ ｈｏ ｔｇａ ｈ （ Ｃ Ｃ） ｗａ ｅ ｉｕｄ ｌ ｕｄ ｄｓｒ ｕｉｎｃ ｒｍａｏ ｒｐ ｙ Ｉ ｓｒ ｔ ｈ ｇ — ｐ ｅ ｏ ｎｅｃ ｒｅ ｔｃ ｒｍａｏ ｒｐ ｙ ＨＳ Ｃ ａ ｓａ ｎ ｗ ｌ ｉ－ ｉ ｉ ｉ ｉ ｔ ｈ ｏ ｔｇａ ｈ ． ｔ ｑ ｑ ｔｂ ｏ
高速逆流色谱法一次性分离制备藏药蓝玉簪龙胆中的三个化合物
高速逆流色谱法一次性分离制备藏药蓝玉簪龙胆中的三个化合物李姗;赵野;刘圆;张志锋【摘要】目的:通过高速逆流色谱法(HSCCC)从藏药材蓝玉簪龙胆中分离制备得到三个高纯度化合物.方法:选择乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶0.5∶5,v/v/v)为二相溶剂系统,上下两相分别作为固定相、流动相,主机转速设置为900 r/min,流动相溶剂流速为2 mL/min,紫外检测波长为254nm,柱温为20℃.所采集的组分减压浓缩后烘干得到龙胆苦苷、异荭草素、异牡荆苷,应用ESI-MS/MS分析鉴定,并用HPLC测定其质量分数.结果:在260 min内可一步纯化150 mg藏药材蓝玉簪龙胆水粗提物中的龙胆苦苷、异荭草素、异牡荆苷,三者完全分离,纯度分别达到98.2％、94.5％、96.0％.结论:利用高速逆流色谱法可快速、简单、高效地富集蓝玉簪龙胆中龙胆苦苷、异荭草素、异牡荆苷三种化合物.【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(042)006【总页数】5页(P660-664)【关键词】高速逆流色谱;蓝玉簪龙胆;龙胆苦苷;异荭草素;异牡荆苷【作者】李姗;赵野;刘圆;张志锋【作者单位】西南民族大学药学院,四川成都610041;西南民族大学药学院,四川成都610041;西南民族大学青藏高原研究院,四川成都610041;西南民族大学青藏高原研究院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】R284藏药蓝玉簪龙胆为龙胆科龙胆属植物蓝玉簪龙胆(Gentianaveitchiorum Hemsl.)的干燥地上部分，藏语学名为“邦见温保”[1-2].性寒、味苦；归肝、胆经；具清热解毒功效；现代药理研究表明蓝玉簪龙胆可减轻肝肺部的炎症，保护肝肺功能，抑制肝肺纤维化的形成[3-4].龙胆中主要化学成分是裂环烯醚萜苷及黄酮类化合物，杨红澎等使用传统分离方法从蓝玉簪龙胆花中分离鉴定了2α-羟基熊果酸、落干酸、远志脑苷(polygalacerebroside)、熊果酸、龙胆苦苷、异荭草素-3′-甲醚、异牡荆苷和异荭草素等化合物[5-6].高速逆流色谱(HSCCC)[7]是一种连续高效的快速液-液分配色谱分离技术，具有回收率高，连续高效，制备量大等特点，可直接用于分离制备粗提物[8-9].该法中化合物的分离只依赖于溶解性的不同，由此避免了因不可逆性吸附造成的样品损失及由于表面化学等诸因素引起的化学分析物变性，因而广泛应用于天然产物中活性物质的分离制备[10-11].本实验采用高效逆流色谱建立分离制备蓝玉簪龙胆中的三种化合物的方法，该操作简单，分离时间短，产物纯度高，对蓝玉簪龙胆化合物的分离及其药理药效的进一步研究具有重要意义.1.1 仪器与试剂高速逆流色谱仪(TBE-300B，TBE-20A，上海同田生化技术有限公司)；Waterse2695高效液相色谱仪，含Waters 2489紫外/可见光分光光度检测器，Empower色谱工作站、自动进样器、四元梯度泵、柱温箱. UHPLC–PDA–QTOF–MS为Waters Acquity UHPLC I-Class系统(Waters，USA).质谱为双重四级杆飞行时间质谱和电喷雾电离质谱(ESI)(Waters MS Technologies，UK).藏药蓝玉簪龙胆采于四川省红原县，由四川大学张浩教授鉴定为龙胆科龙胆属植物蓝玉簪龙胆(Gentianaveitchiorum Hemsl.)全草；HSCCC分离所用的乙酸乙酯、正丁醇均为分析醇；HPLC分析中所用甲醇为色谱醇，水为超纯水；D101大孔树脂(西安蓝晓科技有限公司).1.2 方法1.2.1 蓝玉簪龙胆粗提物的制备将干燥的蓝玉簪龙胆2 kg粉碎，用75%乙醇浸泡3次，每次3 d，料液比为1∶20；过滤，滤渣纯水回流提取两次；滤液过D101大孔树脂，依次用水，10%，30%，50%，70%，100%六个梯度乙醇-水洗脱，分段收集洗脱液；减压浓缩.将浓缩得到的浸膏冷冻干燥至粉末，得到乙醇粗提浸膏及水粗提浸膏，干燥器中保存备用.准确称取150 mg水粗提物溶解于10 mL下相，4℃下保存备用.1.2.2 HPLC及UHPLC-PDA-QTOF-MS色谱分析条件采用HPLC法对HSCCC分离的各组分进行检测，并按照面积归一化法判断各组分的纯度.色谱柱: YMC-Triart C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇(A)-水(B)为流动相梯度洗脱(0～50 min，20%～50%A)；进样量为10 μL；流速:1 mL·min-1；检测波长:240 nm；柱温:35℃.采用UHPLC–PDA–QTOF–MS为结构鉴定，根据二级质谱碎片推测化合物结构.色谱柱:Acquity HSS C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，0.1%乙酸水(A)和甲醇(B)为流动相，0～15 min，20～50%B梯度洗脱；进样量为1 μL；流速:0.2 mL· min-1；检测波长240 nm；柱温:35℃.质谱量子范围，m/z100～1 500；干燥气体的流量(N2)、800 L/h；干燥气体温度450℃；氮气，30 L/h；离子源温度100℃；毛细管电压2 500 V和筒内压力40 V.1.2.3 溶剂体系选择根据待分离物质的物理性质及溶剂极性，确定选用乙酸乙酯-正丁醇-水为两相溶剂体系，配置两相溶剂不同体积比(7∶0∶5，4∶0.5∶5，4∶1∶5，7∶1∶5)的溶剂体系.上相为固定相，下相为流动相，充分混匀后平衡6-10h，超声脱气20min，紫外检测波长为254nm.根据文献[12]计算分配系数K＝Aupper/Alower，K值结果见表1.1.2.4 高速逆流色谱分离制备经过优化筛选出乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，将其充分混匀后再静置分层，上下两层分别为固定相、流动相.固定相溶剂以20 mL/min的流速泵入HSCCC螺旋管柱中，等到固定相溶剂流出约20 mL后停泵.主机设置为正转，转速调至900r/min，再以2 mL/min的流速泵入流动相溶剂，待流动相溶剂流出且达到两相动态平衡时，将100 mL水粗提物样品注入HSCCC仪中，打开色谱工作站采集数据:检测波长为254 nm，柱温为20℃.监测色谱图并收集各组分，浓缩后烘干.2.1 蓝玉簪龙胆水相粗提物的HPLC分析由图1可知，HPLC外标法分析蓝玉簪龙胆水相粗提物，测得提取物中三个化合物的含量分别为33.2%，36.5%，24.0%.2.2 HSCCC分离制备结果由表1可知乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶0.5∶1)为最优溶剂体系，经微调后直接进行制备，分离谱图见图1，在该条件下，可分离出三个化合物，且重现性良好.2.2 纯度分析及结构鉴定组分I，II，III，IV减压浓缩后烘干分别得到23.2 mg，11.6 mg，5.1 mg，6.8 mg粉末，精确称取各组分3 mg，甲醇溶解后制成1 mg/mL样品，以1.2.2节中的色谱条件对收集的各组分进行检测，采用HPLC外标法测定，得到组分I为杂质，组分II纯度98.2%，组分III纯度94.5%，组分IV纯度96.0%.对三个组分采用ESI-MS/MS分析鉴定化合物(见图3-II)，组分II分子离子峰为[M-H＋COOH]－m/z 401.1084，分子式鉴定为C16H20O9，基于CID-MS2显示碎片峰为m/z 391.0801，376.0054，225.0128，179.0558，149.0548，112.9838质谱图数据与文献(13)中报道的龙胆苦苷质谱数据一致，分析鉴定结构为龙胆苦苷(如图3-II).组分III分子离子峰为[M－H]＋m/z 447.0925，分子式为C21H20O11，基于CID-MS2显示碎片峰为m/ z285.0393，可能为[M－H－162]－，即脱去一个糖；碎片峰m/z 429.0815可能为苯环上两个羟基的缩合；碎片峰m/z 327.0503是失去一分子水和一分子P-hydroxyPhenyl-prop-enyl后得到，质谱图数据与文献(14-15)中报道的异荭草素质谱数据一致，即鉴定结构为异荭草素(如图3-III).组分IV分子离子峰为[M－H]－m/z 431.0976基于CID-MS2显示碎片峰为m/z 311.0548，295.0601，283.0601，269.0441，161.0244，117.0335，与文献(16)中报道的异牡荆苷质谱数据一致，即鉴定结构为异牡荆苷(如图3-IV).本实验采用高效逆流色谱实现了蓝玉簪龙胆中三种主要成分龙胆苦苷，异荭草素，异牡荆苷三种不同化合物的完全分离.通过多次验证获得最佳HSCCC分离体系为乙酸乙酯-正丁醇-水(4:0.5:5，v/v/ v)，并成功通过一步纯化从150 mg蓝玉簪龙胆水相粗提物中获得龙胆苦苷，异荭草素，异牡荆苷三种不同化合物，纯度分别达到98.2%，94.5%，96.0%，分离时间260 min.龙胆苦苷是中国药典规定的龙胆类植物中的标志性成分，具有广谱的药理活性，黄酮类化合物也以成为国内外天然产物研究热点，本文中分离得到的两个黄酮类化合物在蓝玉簪龙胆水提物中含量很高，因此对蓝玉簪龙胆中的黄酮类物质研究具有较大的实用价值.本文方法可以一步纯化得到高纯度的龙胆苦苷和黄酮类化合物，更省时、简便，可为蓝玉簪龙胆的化合物纯化分离及其药理作用的进一步研究提供物质基础.【相关文献】[1]杨永昌.藏药志[M].西宁:青海人民出版社，1991.[2]帝玛尔·丹增彭措.晶珠本草[M].毛继祖，译.上海:上海科学技术出版社，1986.[3]侯颖，曹蔚，李涛，等.蓝玉簪颗粒治疗小鼠慢性支气管炎作用机理的研究[J].第四军医大学学报，2008，14:1331-1333.[4]ZHANG ZF，LIU Y，LU LY，et al.Hepatoprotective activity of Gentiana veitchiorum Hemsl.against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice[J].Chinese Journal of Natural Medicines 2014，12(7):0488-0494.[5]杨红澎，确生，吴锡冬，等.蓝玉簪龙胆中苷类成分的研究[J].中国中药杂志，2008，33(21):2505-2507.[6]邹琼宇，梁健，廖循，等.蓝玉簪龙胆的化学成分研究[J].华西药学杂志，2010，5:512-514.[7]ITO Y，BOWMAN R L.Countercurrent chromatography:Liquid-liquid partition chromatography without solid support[J].Science，1970，167 (3916):281-283.[8]邸多隆，郑媛媛，陈小芬，等.高速逆流色谱技术分离纯化天然产物中黄酮类化合物的研究进展[J].分析化学，2011，39(02):269–275.[9]成超，尹鹭，曹学丽，等.儿茶素和表儿茶素异构体的高速逆流色谱分离制备[J].食品化学，2012，33(15):140–143.[10]ITOY，CONWAY W D.High speed countercurrent chromatography [M].New York:John Wiley，1996.[11]曹学丽.高速逆流色谱分离技术及应用[M].北京:化学工业出版社，2005.[12]MAN DAVA N B，ITOY.Counter current chromato graphy，theory andpractice[M].New york:Marcel Dekker，1998:443.[13]DANIIL N，OLENNIKOV，NINA I，et al.Iridoids and Flavonoids of Four Siberian Gentians:ChemicalProfile and Gastric Stimulatory Effect [J].Molecules，2015，20:19172-19188.[14]WANG EJ，MA YB，ZHANG XM，et al.Five alkaloids from vine stems of Diploclisia affinis[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2008，33:2505-2507.[15]N SASAKI，Y NISHIZAKI，E YAMADA，et al.Identification of the glucosyltransferase that mediates direct flavone C-glucosylation in Gentiana triflora[J].FEBS Letters，2015，589:182-187.[16]HUANG MQ，ZHANG YP，XU SY，et al.Identification and quantification of phenolic compounds in Vitexnegundo L.var.cannabifolia(Siebold et Zucc)ingliquid chromatography combined with quadrupole time-of-flight andtriple quadrupole mass spectrometers[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2015，108:11-20.。
药学本科《天然药物化学》汇集各章习题、试卷及参考答案
一、名词解释
1、正相色谱
2、反相色谱
3、超滤技术
4、化学位移
答：
1、流动相的极性是非极性的，而固定相的极性是极性的。
2、固定相的极性小，而流动相的极性大。
3、是指在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜分离介质，以错流方式进行过滤、使溶剂及小分子物质通过，高分子物质和微粒子如蛋白质，水溶性高聚物、细菌等被膜阻流，从而达到分离的目的的一种分离技术。
4、色谱法是分离中药成分单体最有效的方法（）
5、铅盐沉淀法常用于中药生产中除去杂质。（×）
6、植物成分的生物转化，可为一些化合物的结构修饰提供思路，提供新颖的先导化合物。 （）
7、在活性筛选方法的指导下进行化合物的分离提取要求分离工作者与活性测试人员两个方面的配合。（）
8、聚酰胺层析原理是范德华力作用。 （×）
天然药物化学
各章习题及答案
第一章（一）
一、名词解释
1、高速逆流色谱技术
2、超临界流体萃取技术
3、超声波提取技术
4、二次代谢过程
答案
1、它是依靠高速行星式旋转产生的离心力使无载体支持的固定相稳定地保留在蛇形管中，并使流动相单向、低速地通过固定相，由于不同的物质在两相中具有不同的分配系数，其在柱中的移动速度也不一样，从而实现样品的一种分离方法。
5、原存于植物体中的苷。
6、原始苷被部分切去糖后生成的苷。
7、由十个以上单糖通过苷键连接而成的糖称为多聚糖。
8、由2~9个单糖通过苷键结合而成的直链或支链聚糖。
二、以下每一道考题下面有A、B、C、D、四个备选答案。请从中选择一个最佳答案。
1、A；2、C；3、B；4、A；5、D
1、.Molish试剂的组成是：
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
生药
HPLC法测定分配系数
AUi 2 VL AUi 2 VL Ki Ki A A V Ui 1 Ui 2 U A A V
Ui1 Ui 2 U
生药
溶剂系统选择的基本步骤
(1)首先预测要分离物质的极性, 溶解性特点，粗 选几个溶剂体系。 (2)建立目标化合物的TLC、HPLC分析条件。 （3）利用HPLC测定K，并计算容量因子a，2>K>0.5, a>2，能够获得理想的分离。 （4）制备性分离。
利用一种特殊的流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂(固定
相和流动相)在螺旋管中高效地接触、混合、分配和传递
其中固定相以一种相对均匀的方式分布在一根聚四氟乙烯管 绕成的螺旋管中 流动相以一定的速度通过固定相，并按照被分离物质分配系 数的不同依次洗脱而获得分离
特殊的流体动力学
生药
固定相的保留
缺点：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程 长，需要几十小时才能完成一次几个组分的分离．
生药
3.高速逆流色谱的原理
利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不 相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相，利用恒 流泵连续输入另一相，溶质在两相之间反复分配，按 分配系数的次序，被依次洗脱。
生药
液－液分配色谱
利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产生的二维 离心力场形成的单向性流体动力学平衡（HDES） 从而实现流动相高速移动时固定相的保留
生药
混合区：在靠近离心轴
心大约有四分之一的区 域，两相的激烈混合
静置区：两相溶剂分成
两层，重相在外部，轻 相在内部来自以1000转/分的速率进行旋 转，在二维力场的作用下 分离管柱内混合和传递的 频率可达到17次/S，从而 实现高效的分离
生药
－ 上层 － 下层
体系 目标物质 分配系数K 300BHSCCC保留时间
氯仿/异丁醇/甲醇/水 4：0.25：3：2 芦荟未知物 0.9 2.3h 芦荟甙A 1.9 4.0h 芦荟甙B 2.3 5.3h
生药
样品的HSCCC分离图谱
生药
• 通过HPLC方法筛选HSCCC溶剂条件 的优势在于 1、提高效率 2、节省溶剂用量 3、可获得相对合适的溶剂条件
生药
● 影响逆流色谱应用的因素
●
溶剂系统的选择是应用逆流色谱的关键。
● 对于其溶剂系统的选择，目前尚无充分的 理论依据，一般根据实验积累经验。 ● 对于一个定型的机器来说，制备分离能力 决定于溶剂系统的选择和仪器参数
生药
HSCCC的溶剂条件选择
• HSCCC采用液-液分配原理，增加了固 定相选择环节，因此它的溶剂条件选择 方法与其他色谱技术不同。
● 建立高速逆流色谱的反应器, 反应与分离耦合
生药
高速逆流色谱 在中药现代化中的应用
单体化合物 用于制药中间体的质 量控制
成药质量控制 指导原药材种植/ GAP基地建设
指纹图谱
天然产物 中等极性(氯仿溶解)
（香豆素、醌类、苯丙 素、生物碱、黄酮等）
弱极性(正己烷溶解)
（萜类、甾体、脂肪酸等）
生药
溶剂条件的筛选方法
1、文献报道的溶剂条件 经典体系1：氯仿-甲醇-水：4-3-2 经典体系2：正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水：1-1-1-1 2、TLC方法初步筛选 初步判断样品在上、下相中的分配情况 3、HPLC方法分析分配系数 分析目标组分在两相中的分配系数K值 4、利用分析型HSCCC 时间短、溶剂消耗少等优点
生药
逆流色谱简介
生药
逆流色谱
逆流色谱(countercurrent chromatography, CCC)是 一种无固体载体的连续液-液分配色谱技术，在离心 力场的作用下使液体保留于柱中作为固定相。最初 由美国国立健康研究院(NIH)的Ito教授研制开发。
Ito Y, Bowman R L. Science, 1970, 167: 281-283.
生药
◆ 温度 不同的样品及不同的体系，温度的影响 可能都会不一样。可配置恒温装置，控制 实验因素。 ◆ pH值 可通过调节体系的PH值使样品的溶解 度达到合适的范围。 ◆ 进样量 进样量的大小及溶样体积多少的影响
生药
◇逆流色谱溶剂系统的研究 ● 开发双水相系统,进行生物大分子分离 ● 开发微胶束系统 ● 建立三相\四相逆流色谱体系
生药
K ＝ Cs/Cm
Cs Cm
生药
HSCCC的工作流程
生药
●逆流色谱的优点
A、无固相载体，避免了有效成分不可逆吸附和峰形拖 尾等缺点； B、粗提物可进样分离，分离纯化与制备可同步完成， 有机溶剂消耗少，无损失、高效、快速和制备量大等 优点; C、与HPLC相比，HSCCC进样量较大，最多可达几克， 是HPLC的104-105 倍; D、与常压和低压色谱相比，HSCCC的分离能力强，经 过1次分离就可以得到1个甚至多个单体，并且分离时 间短。
生药
HSCCC最合适的K值范围是0.5－2 当CS/CM＜＜0.5时，出峰时间太快，峰 之间的分离度较差，当CS/CM＞＞2时， 出峰时间太长，且峰形变宽
生药
实例 根据文献报道，筛选出芦荟甙HPLC分离的色谱条件，得到芦荟甙 提取物的HPLC图谱如下，1芦荟未知物，2芦荟甙A，3芦荟甙B
生药
HSCCC溶剂系统选择
Selection of solvent systems
水溶性和强极性
（皂苷、强心苷、黄 酮苷、多酚类等）
正丁醇-醋酸-水 正丁醇-甲醇-水(缓冲液) 正丁醇-乙酸乙酯-水(缓冲液) 乙酸乙酯-水(缓冲液) 氯仿-甲醇-水 乙酸乙酯-甲醇-水 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水) 正己烷-乙腈 正己烷-甲醇-水 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水)
生药
1 逆流色谱的原理及发展过程
分配定律：Nernst, 1891 年，Ｋ＝Ｃ1／Ｃ2 两组分K相差较大：一次萃取可得到分离
较小：多次萃取
逆流分配法，20世纪40年代,创始人Craig
生药
2.液滴逆流色谱(DCCC)
溶剂 泵
进样器
进样器
溶剂 约300根管柱 上行法 收集器
泵 收集器 约300根管柱 下行法
生药
影响高速逆流分离的其他因素
固定相保留率 转速及流速 温度 pH值 进样量
当体系选定后，在适当合理的调节这些 因素，样品可以达到有效的分离。
生药
◆ 固定相保留率 直接决定分离柱的有效长度，合适的
范围为30％～80％。在一定范围内，保留
率越高，分离越好。 ◆ 转速及流速 不同的机型可选择不同的转速及流速。 在一定范围内，转速提高，保留增加；流 速降低，保留增加。