高速逆流色谱法.ppt
高速逆流色谱法
HSCCC进样体积可达到柱体积的20%，广泛用于制备 性分离。
参数
固定相 机理
溶质与固定相作用
上样量 分离效率
操作 费用 危险性
HSCCC
色谱分离是依据被分离物在两相中分配系数的不同而 进行；
逆流色谱是利用物质在两相液体中分配系数的不同实 现分离；
分离也可以依据被分离物在一个含有沉淀剂的浓度梯 度变化的单一溶剂中的溶解度的不同而实现。
（前提：沉淀剂浓度梯度移动的速度远低于溶剂流速）
溶解度具有很小差异的物质，经过在柱中反复的沉淀 和溶解即可达到分离。
二、基本原理
现代逆流色谱仪器体系： 1. 流体静力学平衡体系
2. 流体动力学平衡体系（HSCCC体系） 仪器的两个特征：
a 有一个或多个缠绕有多层聚四氟乙烯管的线轴； b 没有旋转密封接头，有一个安装有两个旋转轴的齿轮传动装置，
能产生一个可变的离心力场。
通过公转、自转（同步 行星式运动）产生的二 维力场，保留两相中的 其中一相作为固定相；
广义定义： 1. 任何利用两相不混溶液体的色谱技术； 2. 其中一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管
或一系列的腔体中； —— 固定相 3. 同时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。
—— 流动相
减少了溶质分子与固体支撑体之间各种复杂的相互作 用；
不仅可以获得高纯度的分离组分；
同时具有较高的回收率和重现性。
离心沉淀色谱（centrifugal precipitation chromatography, CPC）是一种建立在类似于逆流色谱 的不用固体支撑体的开放性通道基础上的沉淀和溶 解色谱。
逆流色谱ppt课件
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手性分离和分析的重要性
★ 获取单一对映体化合物 ★ 对于涉及分子手性分析的领域要采用高对映 体选择性的分析方法
手性分离的特殊性
在非手性环境中，对映体的物理化学性质（如熔点、 沸点、折射率、蒸气压、溶解度、红外、核磁谱和质 谱等）大都相同，这就造成对映体分离的困难。
手性添加剂法拆分苯基琥珀酸
O
OH OH O
(±)-PSA可采用光 活性的番木鳖碱或
(-)-脯氨酸拆分
15 mmol/Lβ-CD + 3% CH3CN + 0.05 %CF3COOH
0.30 mmol/L TM-β-CD +16%CH3CN +0.05%CF3COOH
Nova-pak C18色谱柱
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CH3
+3.82o , mp 25.8oC -3.82 o , mp 25.8oC
右旋乳酸 , d-或(+)-
左旋乳酸 , l-或(-)-
图1 乳酸分子的镜像关系
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沙利度胺（Thalidomide）
--------天使还是魔鬼？
俗名“反应停”，早期作为 怀孕妇女的止呕药使用
50年代末，在欧洲出现数千例短肢 畸胎新生儿，一度震惊全世界
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逆流色谱技术的特点
1．逆流色谱不用固态支撑体; 2．两相处于离心力场中，成液滴装、样品在
其表面分配； 3．无死体积，柱子体积大，制备量大； 4．分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对流
穿透过程。
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基本操作
• 溶剂系统的选择： • 样品溶解：等量的预先平衡的上下相； • 溶剂分离：如线圈为300ml,则实验一次要
高速逆流色谱高速逆流色谱高速逆流色谱高速逆流色谱
高速逆流色谱High Speed Countercurrent Chromatography（HSCCC）逆流色谱是利用溶质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同，应用色谱层析的方法，将不同溶质分离。
逆流色谱的发展从逆流分配、液滴逆流色谱直至现在的高速逆流色谱，经历了近60年的历程，技术和设备均已日益成熟，现越来越多地应用于中药及天然药物的研究开发。
高速逆流色谱特点：! 无不可逆吸附# 液—液层析系统，无样品与固定相之间的不可逆吸附! 高回收率# 流动相和固定相均为液体，样品可全部回收! 操作简便# 固定相为液体，体系更换、平衡方便、快捷。
高速逆流色谱原理：高速逆流色谱是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相（固定相），利用恒流泵连续输入另一相（流动相），随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。
在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脱。
图1是螺旋柱中互不相溶的两相溶剂在行星运动时的流体动力学运动及分配示意图。
上图，在达到稳定的流体动力学平衡态后，柱中呈现两个截然不同的区域：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域（混合区）呈现两相的激烈混合。
其余区域（静置区）两溶剂相分成两层：较重的溶剂相在外部，而较轻的溶剂相在内部，两相形成一个线状分界面。
下图，I到IV的展开柱，分别与上图中I到IV位置相对应，每一混合区以跟柱旋转速度相同的速度向柱头端移动（与海面波的运动相似）。
在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂都在反复进行混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，当柱以800rpm旋转时，频率超过13次/秒，流动相则不断地穿过固定相。
所以高速逆流色谱在一个较宽的流动相流速范围内，仍有相当高的分配效率。
图1 螺旋柱中两溶剂相流体动力学运动及分配高速逆流色谱应用：1. 旋转速度在逆流色谱中，留在柱中固定相的量是影响溶质峰分离度的一个重要因素，一般说来，高保留量会大大改进峰分离度。
高速逆流色谱
400
流速: 2.0 ml 转速：800 rpm 样品量：150 mg 粗提物 机型：TBE-300A 固定相保留： 60% Ⅰ：花椒毒素 95.0％ 7.6 mg Ⅱ: 异茴芹素 99.6％ 7.6 mg Ⅲ: 佛手苷内酯 99.7％ 9.7 mg Ⅳ: 欧前胡素 100％ 60.5 mg Ⅴ: 蛇床子素 100％ 50.6 mg Ⅵ:未知化合物 98.1％ 10.2 mg min-1
实例3 白花败酱异戊烯基黄酮的分离
溶剂系统: 正己烷-乙酸乙酯－甲醇-水 (5:6:6:6) 流动相：下相 流速: 1.0-2.0 ml min-1 转速：850 rpm 样品量：400 mg 粗提物 固定相保留： 65% 分离温度: 25°C 机型：TBE-300A Ⅰ: orotinin （牡荆苷）99.2％ 38.2 mg Ⅱ: orotinin-5-methyl ether 98.5％ 19.8 mg Ⅲ: licoagroachalcone B 97.6％ 21.5 mg Journal of Chromatography A,1102(2006)44-50
两相溶剂体积选择
• 色谱理论,样品分离的必要条件是合适的分配系数。溶剂 体系的选择对于HSCCC十分关键,通常来说,两相溶剂体系 应满足以下要求: • (1)为保证固定相保留值合适(不低于50% ) ,溶剂体系的分 层时间要小于30 s。 • (2)目标样品的分配系数K接近于1,容量因子应大于1. 5。 • (3)上下两相的体积大致相等,以免浪费溶剂。 • (4)尽量采用挥发性溶剂,以方便后续处理,易于物质纯化。 • Ito博士根据在螺旋管中行星运动的溶剂流体力学特性将溶 剂分为疏水性、中等疏水性和亲水性体系 。
Absorbance(mAU)
高速逆流色谱技术
高速逆流色谱技术目录介绍 (1)高速逆流色谱的原理 (1)1.系统描述 (2)1.1主机 (2)1.2恒流泵 (2)1.3紫外检测器 (3)1.4恒温循环器 (3)1.5色谱工作站 (3)2.主机描述 (3)2.1操作 (4)2.1.1传感器控制面板 (4)2.1.2电源开关 (4)2.1.3样品进样口及样品出样口 (4)2.1.4进口 (4)2.1.5出口 (4)2.2六通阀 (4)2.3进样步骤 (8)2.4控制面板 (9)2.4.1功能键介绍 (9)2.4.2控制面板的操作 (9)2.5TBE-300B高速逆流色谱的工作流程 (10)3.安装 (10)3.1检查包裹 (10)3.2安装环境 (10)3.3连接管 (10)3.4连接保温系统的管路 (11)3.5连接信号线 (12)4.操作 (12)4.1准备 (12)4.2操作程序 (12)4.3系统平衡 (13)4.3.1单泵平衡 (13)4.3.2双泵平衡 (14)4.4样品分离 (14)5.维护 (14)5.1清洗系统 (14)5.2警告 (15)6.系统特性及工作参数 (15)附录A (15)附录B (16)附录C (17)同田生物介绍逆流色谱（CCC）是一种无固体载体支持的液-液分配色谱技术。
与其他柱色谱相比，逆流色谱不会导致不可逆吸附，样品，变性，污染及等问题。
除此之外，它能够分离分子量从小变到大的化合物，甚至一些生物大分子。
高速逆流色谱（HSCCC）是逆流色谱中的最新的发展。
高速逆流色谱不仅减少的分离时间，而且也极大地提高了分离度和制备能力。
高速逆流色谱的应用：1、制备性地分离毫克到克规模的样品；2、从粗样品中分离目标化合物；3、分离放射性同位素。
高速逆流色谱在分离天然产物中的优势：1、更加方便和迅速；2、不需要对样品进行前处理；3、液-液分配容积系统的选择广泛；4、因为没有固体载体，所以无死吸附，无污染；5、高的重现性及重复性。
《逆流色谱技术》课件
广泛应用
在中药、生物医药、食品添加剂 等领域，逆流色谱技术被广泛应 用于天然产物的分离和纯化。
在药物分离中的应用
药物分离
逆流色谱技术在药物分离中具有重要作用，能 够分离和纯化药物中的有效成分。
药物质量控制
该技术可用于药物质量控制，确保药物的有效 性和安全性。
药物研发
逆流色谱技术还可用于药物研发，帮助研究人员发现新的药物候选物。
逆流色谱技术的应用范围
01
逆流色谱技术在生物医药领域应用广泛，可用于分离纯化蛋白 质、酶、核酸等生物大分子。
02
此外，逆流色谱技术在天然产物提取、食品分析、环境监测等
领域也有广泛应用。
由于逆流色谱技术具有分离效率高、样品回收率高、操作简便
03
等优点，因此在科研和工业生产中得到了广泛应用。
02
逆流色谱技术的分类
原理
基于溶质在固定相和流动相之间的水动力学 作用进行分离。
优点
分离效果好，可实现连续分离。
应用
适用于分离和纯化大分子化合物，如DNA、 RNA和蛋白质等。
缺点
操作条件较为严格，有时需要大量有机溶剂 。
03
逆流色谱技术的实验设备
分离柱
分离柱是逆流色谱技术中的核心部件，其作用是提供固定相和流动相的相 对运动，从而实现混合物的分离。
素。
03
泵的性能参数如流量、压力等对分离效果有很大影响，需 要精确控制。
检测器
检测器的作用是检测和记录 分离过程中各组分的浓度变
化。
常用的检测器有紫外可见光 检测器、荧光检测器、电导 检测器等。选择合适的检测 器需要考虑被分离物质的性
质和检测灵敏度。
检测器的性能参数如检测限 、线性范围等对分离效果有 很大影响，需要合理选择和 使用。
高速逆流色谱
高速逆流色谱综述高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography，简称HSCCC)，于1982年由美国国立卫生院Ito博士研制开发的一种新型的、连续高效的液液分配色谱技术。
该技术由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附引起的样品损失、失活、变性等问题，具有传统的液-固色谱所不具备的独特优势，特别适合于天然生物活性成分的分离。
而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段，因此此项技术己被广泛应用于中药成分分离、保健食品、生物化学、生物工程、天然产物化学、有机合成、环境分析等领域[1]。
1 高速逆流色谱原理[1-2]图.1高速逆流色谱仪利用螺旋管的自转和公转同步同向行星式运动所产生的变化离心力场将固定相保留在螺旋管中，允许流动相快速流过螺旋管并与固定相进行连续高效的混合和分配，达到一种特殊的流体动力学平衡——单向流体动力学平衡，此时在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂都反复进行着混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，在800rpm转速下时，混合和分配的频率可以达到13次/s。
大大提高了两相溶剂的混合效率，可以极大地缩短分离时间，这就是高速逆流色谱分离效率高的原因。
如图.1。
2 高速逆流色谱(HSCCC)的特点及与制备型高效液相色谱（prep-HPLC）的比较[3-4]目前制备出高纯度的天然产物的方法中，制备型高效液相色谱是使用最为广泛的。
与其相比，高速逆流色谱具有以下一些突出的优点。
（1）HSCCC回收率高：由于HSCCC不需要固体支撑体，避免了样品在分离过程中的不可逆吸附、分解、变性等问题。
理论上，滞留在柱中的样品可以通过多种洗脱方式予以完全回收；实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。
粗样可以直接上样而不会对柱内固定相造成任何损害。
而prep-HPLC在样品吸附过程中会出现死吸附的现象，在制备高纯品的过程中，必然会以牺牲得率为代价，这是prep-HPLC不可避免的。
高速逆流色谱在天然产物分离提取中的应用ppt文档
a.仪器对保留值的影响（外因）
研究表明：螺旋管支持件的自转半径r与公转半 径R之比B值是一个影响两相互不混溶溶剂在旋转 螺旋管内保留的关键因素。用大直径的支持件使 值进一步提高，能导致亲水性溶剂体系的单向性 流体动力学分布反向；反之，用小直径的支持件 使值减小，能使疏水性溶剂体系的单向性流体运 动方向反向，而介于疏水性和亲水性溶剂之间的 中间极性溶剂，其两相分布状况则会受到离心力 条件的影响。
• 2.2.4 温度的影响
温度的提高溶剂的黏度有很大的影响，一般提高 温度会获得高的保留值，而相反降低温度则得到低 的保留值，但一般温度不可能提高太多，因为所用 的都是有机溶剂，沸点很低。
3.在分离天然产物中的应用
从天然产物中提取的活性成分是防治疾病和强身 健体的物质基础。从天然产物活性成分中发展新药 、寻找先导化合物并进行结构修饰是药物研发的重 要内容,目前,许多市场销售和进入临床阶段的抗肿瘤 和抗感染药物都来源于天然产物。
溶剂系统
正己烷-乙酸乙酯-乙腈-水（2：2:1:0.6:2） 乙酸乙酯-乙醇-水（15:1:15） 乙酸乙酯-水（1:1） 正丁醇-乙酸乙酯-水（2:8:5） 乙酸乙酯-水（1:1） 乙酸乙酯-乙醇-水（4:1:5） 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.2:0.8） 和石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.4:0.6） 梯度洗脱
1.2 发展史
• 二十世纪六十年代，首先在日本，随后在美国国 家医学研究院发现了一种有趣的现象：即互不相 溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小孔径管子里分段 割据，并能实现两溶剂相之间的逆向对流。
• ITO及其后来者在此基础上研究并设计制造出了一 系列逆流色谱装置，早期的是封闭型的螺旋管行 星式离心分离仪CPC（coil planet centrifuge），用 于分离染料，蛋白质和细胞粒子。数年后ITO把流 通机制引入到螺旋管柱体系中，使逆流色谱和现 代色谱一样可以实现连续的的洗脱、分离、检测 和收集，并建立了两个基本的流通体制。