高速逆流色谱原理及应用
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高速逆流色谱在天然产物分离提取中的应用ppt课件
离苷元。主要包括黄酮、异黄酮、二氢黄酮、儿茶 在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。
蒽醌类化合物是广泛存在的重要天然色素，在高等植物和真菌、地衣等低等植物中尤为普遍，中药中则以蒽醌及其衍生物最为重要， 具有泻下、抗菌、抗癌等生理活性。
精、花色素等及各种衍生物。利用H S C C C 技术 利用HSCCC分离黄酮类化合物
1.2 发展史
• 二十世纪六十年代，首先在日本，随后在美国国 家医学研究院发现了一种有趣的现象：即互不相 溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小孔径管子里分段 割据，并能实现两溶剂相之间的逆向对流。
• ITO及其后来者在此基础上研究并设计制造出了一 系列逆流色谱装置，早期的是封闭型的螺旋管行 星式离心分离仪CPC（coil planet centrifuge），用 于分离染料，蛋白质和细胞粒子。数年后ITO把流 通机制引入到螺旋管柱体系中，使逆流色谱和现 代色谱一样可以实现连续的的洗脱、分离、检测 和收集，并建立了两个基本的流通体制。
1.3 HSCCC的技术特点
1．应用范围广，适应性好
与HPLC相比： 2．操作简便，容易掌握
a.分析成本低 a.溶剂消耗多
3．回收率高
b.易于操作 c.进样量大
b.检测限较低
4．重现性好
5. 分离效率高，分离量较大
1.4 HSCCC溶剂体系的选择
HSCCC成功分离天然产物的关键就是选择合 适的溶剂体系。
原料 吴茱萸 黄花乌头 附子 金果榄
绿茶
溶剂体系 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (5∶5∶7∶5) 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.2mol/L HCl (1∶3.5∶2∶4.5) 氯仿-甲醇-0.3mol/L 盐酸 (4:3:2) 氯仿-甲醇-0.2mol/L 盐酸 (2:1:1) 氯仿-甲醇-0.2mol/L 盐酸
蒽醌类化合物是广泛存在的重要天然色素，在高等植物和真菌、地衣等低等植物中尤为普遍，中药中则以蒽醌及其衍生物最为重要， 具有泻下、抗菌、抗癌等生理活性。
精、花色素等及各种衍生物。利用H S C C C 技术 利用HSCCC分离黄酮类化合物
1.2 发展史
• 二十世纪六十年代，首先在日本，随后在美国国 家医学研究院发现了一种有趣的现象：即互不相 溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小孔径管子里分段 割据，并能实现两溶剂相之间的逆向对流。
• ITO及其后来者在此基础上研究并设计制造出了一 系列逆流色谱装置，早期的是封闭型的螺旋管行 星式离心分离仪CPC（coil planet centrifuge），用 于分离染料，蛋白质和细胞粒子。数年后ITO把流 通机制引入到螺旋管柱体系中，使逆流色谱和现 代色谱一样可以实现连续的的洗脱、分离、检测 和收集，并建立了两个基本的流通体制。
1.3 HSCCC的技术特点
1．应用范围广，适应性好
与HPLC相比： 2．操作简便，容易掌握
a.分析成本低 a.溶剂消耗多
3．回收率高
b.易于操作 c.进样量大
b.检测限较低
4．重现性好
5. 分离效率高，分离量较大
1.4 HSCCC溶剂体系的选择
HSCCC成功分离天然产物的关键就是选择合 适的溶剂体系。
原料 吴茱萸 黄花乌头 附子 金果榄
绿茶
溶剂体系 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (5∶5∶7∶5) 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.2mol/L HCl (1∶3.5∶2∶4.5) 氯仿-甲醇-0.3mol/L 盐酸 (4:3:2) 氯仿-甲醇-0.2mol/L 盐酸 (2:1:1) 氯仿-甲醇-0.2mol/L 盐酸
逆流sepu1
HSCCC发展情况
国际方面：
• 40年代：非连续式逆流分溶装置；
• 60年代：日本人在美国研制出“螺旋管行星式 离心分离仪”；
• 70年代：液滴逆流分溶仪（DCC）-流体静态 平衡体系；行星式逆流层析仪（CPC）-流体动 态平衡体系； • 80年代：日本人Y. Ito研制HSCCC仪;
• 90年代: Y. W. Lee发明双向逆流色谱仪 (DuCCC);
1．选择用于高速逆流色谱仪的溶剂系统时， 应注意以下几方面：
（1） 不造成样品的分解或变性；
（2） 足够高的样品溶解度；
（3） 固定相能实现足够高的保留; （4） 两相分层时间少于三十秒; （5） 两相体积基本相等; （6）样品组分在溶剂系统中的分配比K接近于1。
在溶剂系统的选择中，样品组分的 分配比及固定相的保留比的测定是两项重 要的准备工作。
高速逆流色谱法及其应用
高速逆流色谱法（HSCCC） High Speed Countercurrent Chromatography • 概述：发展情况、特点、与其他色谱技 术比较； • 仪器与工作原理； • 高速逆流色谱法条件的选择； • 高速逆流色谱法的应用。
高速逆流色谱法（HSCCC）
是一种高效、快速、无载体的液-液 分配色谱技术。它利用聚四氟乙烯螺旋管 行星式运动，产生一种特殊的流体动力学 现象，使不相溶的两相溶剂在螺旋管内高 速运动，充分混合和逆流传递，使样品中 各组分由于分配系数的差异而得到有效分 离的一种方法。 HSCCC是当今国际分离科学技术的一 个新颖的分支。
高速逆流色谱法分离制备中草药 有效成分对照品
一 高速逆流色谱法分离纯化芦荟甙 和芦荟大黄素对照品 二 高速逆流色谱法分离纯化银杏黄 酮对照品山奈素和异鼠李素
最新 高速逆流色谱研究进展
高速逆流色谱分离原理及特点
图( b)则表示将对应于不同位置( Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ)的螺旋管拉直，以更明显地表示混合区域在螺旋 管内的移动，即每个混合区带都向螺旋管的首端行 进,其行进速率和管柱的公转速率相同。这表明，当 流动相恒速通过固定相时，在管柱内部的两溶剂相 都以极高的频率经历着混合和沉积分配过程。在 800rpm的转速下，混合和沉积的频率可达到13次/s。
高速逆流色谱分离原理及特点
2.2 特点
HSCCC技术所有的优点都源于其不用固体固定相，具有广 泛的溶剂体系可供选择。其优点有： ①避免了样品在分离过程可能存在的变性问题； ②滞留在柱中的样品可以通过多种洗脱方式予以完全回收； ③粗样可以直接上样而不会对柱子造成任何损害； ④柱子可以用合适的溶剂很容易地洗清，可重复使用； ⑤通过改变溶剂体系，实现对不同极性物质的分离； ⑥比高效液相色谱的制备量大，而且费用低，因为其不需要 昂贵的色谱柱。
高速逆流色谱分离原理及特点
2.1
分离原理
HSCCC是利用螺旋柱在类行星运动时产生的 离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其 中的一相(固定相) ，利用恒流泵连续输入另一相(流 动相) ，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反 复分配，按分配系数的大小次序被依次洗脱。在流 动相中分配比例大的先被洗脱，在固定相中分配比 例大的后被洗脱。
高速逆流色谱分离原理及特点
HSCCC仪器的装置示意图如下，它的公转轴为 水平设置，螺旋管柱在距公转轴R 处安装，二轴线 平行。通过齿轮传动，使螺旋管柱实现在绕仪器中 心轴线公转的同时，绕自转轴作相同方向相同角速 度的自转。
•HSCCC仪器装置示意图
高速逆流色谱分离原理及特点
高速逆流色谱应用及发展
2 抗生素
用HSCCC 分析抗生素时，进样量一般为 1mg~5g，分离度和样品回收率高的优势，使 得 HSCCC 在抗生素单组份标准品的制备和多组分同 系物的分离纯化得到更为广泛的应用。 在HSCCC 中，一般用疏水性体系分离抗生素。 对于强极性组分用含有正丁醇的体系，中等疏水体 系用含有氯仿的体系，疏水性用含有正己烷的体系。
较小：多次萃取
逆流分配法，20世纪40年代,创始人Craig
高速逆流萃取：利用螺旋柱在行星运 动时产生的多维离心力场，使互不相溶的 两相不断混合，同时保留其中的一相（固 定相），利用恒流泵连续输入另一相（流 动相），随流动相进入螺旋柱的溶质在两 相之间反复分配，按分配系数的次序，被 依次萃取分离出。 在流动相中分配比例大的先被洗脱， 反之，在固定相中分配比例大的后被洗脱， 从而实现分离。
（ 1 ）天然产物已知有效成分的分离纯化 （ 2 ）化学合成物质的分离纯化 （ 3 ）中药一类、五类新药的开发 （ 4 ）中药指纹图谱和质量控制研究 （ 5 ）抗生素的分离纯化 （ 6 ）天然产物未知有效成分的分离纯化及新 化合物开发 （ 7 ）海洋生物活性成分的分离纯化 （ 8 ）放射性同位素分离 （ 9 ）多肽和蛋白质等生物大分子分离以及手 性分离等
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③相对于错流萃取和逆流萃取等传统的溶 剂萃取技术，具有适用范围广、操作灵活、 快速、制备量大、费用低、环保高效等优 点。 ④由于不需要固体支撑体，物质的分离依据 其在两相中分配系数的不同而实现，因而 避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、 失活、变性等，不仅使样品能够全部回收， 回收的样品更能反映其本来的特性，特别 适合于天然生物活性成分的分离。 ⑤由于被分离物质与液态固定相之间能够充 分接触，使得样品的制备量大大提高，是 一种理想的制备分离手段。
高速逆流色谱仪的优势
高速逆流色谱仪的优势高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography，简称HSCCC）是一种较新型的液—液分配色谱,由美国国立健康研究院（National Institute of Health, U.S.A.）Ito博土最先研制开发后由北京市新技术应用研究所在国内开展研发和推广工作。
其原理是基于样品在旋转螺旋管内的互不混溶的两相溶剂间分配不同而获得分离，因而无须任何固体载体或支撑体，能达到在短时间内实现高效分离和制备，并且可以达到几千个理论塔板数。
与其他柱色谱相比较，它克服了固定相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形施尾等缺点[3]。
目前此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域[5]。
我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。
美国FDA及世界卫生组织（WHO）都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定，90年代以来，高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。
1. 高速逆流色谱仪原理及特点HSCCC利用了一种特殊的流体动力学（单向流体动力学平衡）现象。
具体表现为一根100多米长的螺旋空管，注入互不相溶的两相溶剂中的一相作为固定相，然后作行星运动；同时不断注入另一相（流动相），由于行星运动产生的离心力场使得固定相保留在螺旋管内，流动相则不断穿透固定相；这样两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。
由于样品中各组分在两相中的分配比不同，因而能使样品中各组分得到分离。
2. HSCCC的优点HSCCC主要具有以下几个方面的优点。
2.1 应用范围广，适应性好。
由于溶剂系统的组成与配比可以是无限多的，因而从理论上讲HSCCC适用于任何极性范围的样品的分离，所以在分离天然化合物方面具有其独到之处。
并因不需固体载体，而消除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质和其它具有生物活性的物质。
高速逆流色谱法-
第9章 高速逆流色谱法
High Speed Countercurrent Chromatography HSCCC
一、概述
Ito, 70年代提出, 80年代提出CCC, 一种液液色 谱分离技术
逆流分配→液滴逆流色谱→高速逆流色谱
参考书
1.《逆流色谱技术》张天佑, 北京科学技术出版 社, 1991年
6
7
柱: 长的软管(如聚四氟乙烯管)绕制成 载体: 无 固定相: 液体。用某一种有机／水两相溶剂体系或双水和 溶剂体系的上层或下层作为色谱过程的固定相，用离心 力场来支撑住柱内的液态相。 流动相: 若用溶剂体系中的另一层作为流动相，带着混合 样品由泵的压力推入分离管柱，样品就会穿过两个液相 对流的整个管柱空间。 分离: 溶剂萃取过程成千上万次地、高效地、自动连续地 予以完成。各个组分也就会按其在两相中的分配系数分 离开来。
8
大家有疑问的, 可以询问和交流
可以互相讨论下, 但要小声点
9
四、方法特点
1. 固定相、流动相均为液体，完全排除了载体对样品组分的吸附、 玷染、变性、失活等不良影响，能避免不可逆吸附造成的色谱峰 拖尾现象，实现高回收。 2. 分离柱容积可大， 没有填料，柱内空间均为有效空间。因此， 样品负载量较大，制备量可从毫克到克量级。 3. 逆流色谱不用填料，分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对流 穿透过程。溶剂用量少，成本低。 4. 逆流色谱的分离效率比不上气相色谱和高效液相色谱等技术， 不宜进行复杂混合物的全分析。 5. 适合用于分离纯化，预处理条件宽松，回收率高，制备量大。
12
13
黄连生物碱的分离
14
10
四、高速逆流色谱的溶剂选择
溶剂体系的选择原则 不造成样品的分解或变性 足够高的样品溶解度 样品在系统中有合适的分配系数 固定相能实现足够高的保留 溶剂应该进行分层实验, 实验结果决定流速和洗脱
High Speed Countercurrent Chromatography HSCCC
一、概述
Ito, 70年代提出, 80年代提出CCC, 一种液液色 谱分离技术
逆流分配→液滴逆流色谱→高速逆流色谱
参考书
1.《逆流色谱技术》张天佑, 北京科学技术出版 社, 1991年
6
7
柱: 长的软管(如聚四氟乙烯管)绕制成 载体: 无 固定相: 液体。用某一种有机／水两相溶剂体系或双水和 溶剂体系的上层或下层作为色谱过程的固定相，用离心 力场来支撑住柱内的液态相。 流动相: 若用溶剂体系中的另一层作为流动相，带着混合 样品由泵的压力推入分离管柱，样品就会穿过两个液相 对流的整个管柱空间。 分离: 溶剂萃取过程成千上万次地、高效地、自动连续地 予以完成。各个组分也就会按其在两相中的分配系数分 离开来。
8
大家有疑问的, 可以询问和交流
可以互相讨论下, 但要小声点
9
四、方法特点
1. 固定相、流动相均为液体，完全排除了载体对样品组分的吸附、 玷染、变性、失活等不良影响，能避免不可逆吸附造成的色谱峰 拖尾现象，实现高回收。 2. 分离柱容积可大， 没有填料，柱内空间均为有效空间。因此， 样品负载量较大，制备量可从毫克到克量级。 3. 逆流色谱不用填料，分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对流 穿透过程。溶剂用量少，成本低。 4. 逆流色谱的分离效率比不上气相色谱和高效液相色谱等技术， 不宜进行复杂混合物的全分析。 5. 适合用于分离纯化，预处理条件宽松，回收率高，制备量大。
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黄连生物碱的分离
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10
四、高速逆流色谱的溶剂选择
溶剂体系的选择原则 不造成样品的分解或变性 足够高的样品溶解度 样品在系统中有合适的分配系数 固定相能实现足够高的保留 溶剂应该进行分层实验, 实验结果决定流速和洗脱
高速逆流色谱
2 溶剂体系选择的步骤
预测要分离物质的极性，粗选一个溶剂体系； （1）预测要分离物质的极性，粗选一个溶剂体系； 取少量样品于上下相各 毫升的溶剂体系中 的溶剂体系中， （2）取少量样品于上下相各2毫升的溶剂体系中，用 TLC进行检验，可加入甲醇 乙醇、醋酸乙酯等来调节 甲醇、 TLC进行检验，可加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯等来调节 进行检验 溶剂体系的极性，直到样品在上下相中的分配比K为 溶剂体系的极性，直到样品在上下相中的分配比K 0.5~2为止； 为止； 为止 HPLC测定 测定K （3）用HPLC测定K值； 分析型HSCCC进行预分离，再用制备型高速逆 HSCCC进行预分离 （4）用分析型HSCCC进行预分离，再用制备型高速逆 流色谱进行分离。 流色谱进行分离。 进行分离
中等极性溶剂体系
强极性溶剂体系
两相由正己烷和水组成 可用甲醇 乙醇、 组成， 甲醇、 两相由正己烷和水组成，可用甲醇、乙醇、醋酸 等来调节溶剂系统的极性。 乙酯等来调节溶剂系统的极性 乙酯等来调节溶剂系统的极性。 典型的溶剂体系有 典型的溶剂体系有： 正己烷-醋酸乙酯-乙醇正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水 正己烷-醋酸乙酯-甲醇正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水
强极性溶剂体系的两相基本物质是正丁醇和水， 强极性溶剂体系的两相基本物质是正丁醇和水，可以 两相基本物质是正丁醇和水 加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯等溶剂来调节溶剂系统的 加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯等溶剂来调节溶剂系统的 甲醇 极性，也可以在氯仿水体系中调节pH值来增大极性, 极性，也可以在氯仿水体系中调节pH值来增大极性,或 pH 适量的酸和碱. 在异丁基甲醚水体系中加入适量的酸和碱 在异丁基甲醚水体系中加入适量的酸和碱.适合于极性 很强的生物碱类化合物的分离。 很强的生物碱类化合物的分离。 典型的溶剂体系: 典型的溶剂体系: 氯仿-甲醇氯仿-甲醇-HCl 异丁基甲醚有机相加三乙胺，水相加盐酸） 异丁基甲醚-水（有机相加三乙胺，水相加盐酸）
高速逆流色谱在天然产物分离提取中的应用ppt文档
a.仪器对保留值的影响（外因）
研究表明：螺旋管支持件的自转半径r与公转半 径R之比B值是一个影响两相互不混溶溶剂在旋转 螺旋管内保留的关键因素。用大直径的支持件使 值进一步提高，能导致亲水性溶剂体系的单向性 流体动力学分布反向；反之，用小直径的支持件 使值减小，能使疏水性溶剂体系的单向性流体运 动方向反向，而介于疏水性和亲水性溶剂之间的 中间极性溶剂，其两相分布状况则会受到离心力 条件的影响。
• 2.2.4 温度的影响
温度的提高溶剂的黏度有很大的影响，一般提高 温度会获得高的保留值，而相反降低温度则得到低 的保留值，但一般温度不可能提高太多，因为所用 的都是有机溶剂，沸点很低。
3.在分离天然产物中的应用
从天然产物中提取的活性成分是防治疾病和强身 健体的物质基础。从天然产物活性成分中发展新药 、寻找先导化合物并进行结构修饰是药物研发的重 要内容,目前,许多市场销售和进入临床阶段的抗肿瘤 和抗感染药物都来源于天然产物。
溶剂系统
正己烷-乙酸乙酯-乙腈-水（2：2:1:0.6:2） 乙酸乙酯-乙醇-水（15:1:15） 乙酸乙酯-水（1:1） 正丁醇-乙酸乙酯-水（2:8:5） 乙酸乙酯-水（1:1） 乙酸乙酯-乙醇-水（4:1:5） 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.2:0.8） 和石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.4:0.6） 梯度洗脱
1.2 发展史
• 二十世纪六十年代，首先在日本，随后在美国国 家医学研究院发现了一种有趣的现象：即互不相 溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小孔径管子里分段 割据，并能实现两溶剂相之间的逆向对流。
• ITO及其后来者在此基础上研究并设计制造出了一 系列逆流色谱装置，早期的是封闭型的螺旋管行 星式离心分离仪CPC（coil planet centrifuge），用 于分离染料，蛋白质和细胞粒子。数年后ITO把流 通机制引入到螺旋管柱体系中，使逆流色谱和现 代色谱一样可以实现连续的的洗脱、分离、检测 和收集，并建立了两个基本的流通体制。