高速逆流色谱操作
高速逆流色谱技术
l 高速逆流色谱是液相色谱的一种新技术，无需载体，从几种色谱原理方法可以清晰说明。
大约50年前，根据对两种液体进行分配的理念，产生了两种相似的方法：逆流分配技术和液-液色谱分配技术，即：逆流色谱和液相色谱。
30年前，日本Sanki Engineering Ltd.利用前一种技术开发出了高性能的逆流色谱仪（HPCPC），它结合了液相色谱中的快速、高效和先进技术。
HPCPC尤其在利用色谱技术进行半制备和全制备的应用中倍受瞩目，它和采用色谱柱技术的液相色谱在四个方面具有显著优势：● 无样品损失：因为流动相和固定相都是液体，样品可以全部回收。
● 大容量和高的分离能力：流动相和固定相的体积比明显很高，从而无需更大的理论塔板数，就可以获得更大的容量和更高的分离能力。
● 十分灵活的两相系统：（两种、三种、四种溶剂混合）为了获得一种纯的化合物，实验中需要比较灵活的更改流动相，HPCPC可以很方便地调整两相的极性。
● 溶剂消耗少：相对于色谱柱制备系统，对于同样的制备量，HPCPC的溶剂消耗量只有十分之一，使用逆流色谱在实验室完成分离后，可以直接放大到生产规模。
● 固定相价格低：另一个显著优点是逆流色谱的固定相是溶剂，相比色谱柱中的填充材料价格低很多；而且固定相可以很容易再生，一些添加的物质如手性选择剂或复杂的配位体可以无损失地回收，国际上出版的论文可以提供十分有用的信息和应用参考。
新型的高速逆流色谱仪HPCPC广泛地应用于化学领域的纯化，如抗生素、缩氨酸、丹宁酸、皂角苷、油脂、药品等，将来的发展可以预见更大规模和产量的HPCPC设备出现，在化学领域将更加广泛地应用，如手性药物分离等。
与传统制备液相的优势● 逆流色谱仪HPCPC十分快速由于固定相溶剂通过离心力保留在分配通道中，可以不用顾及分离精度的高低要求而让流动相的流速保持很高。
● 明显优于传统制备液相由于逆流色谱仪HPCPC不需要固定相，不会出现对十分昂贵的样品产生不可逆转的保留，而在传统色谱柱的液相色谱中，经常出现的变性和分解现象在逆流色谱不会产生，同时保留了原来的生物活性。
高速逆流色谱法快速分离制备雷帕霉素工艺研究
种 发 酵 水 平 低 下 和 生 产 提 取 路 线 复 杂 ， 由于 雷 帕霉
经活 性炭 脱色 后 ，减压 浓缩 得 雷帕 霉素粗 提 取物 。
２２ ． ＨＳ Ｃ 分 离 雷帕霉 素粗提 物 Ｃ Ｃ
ｓ ｐ ｒ ｔ ｎ ａ ｄ ｐ ｒｆ ａ ｉ ｎ ｏ ｐ ｍｙ ｉ ｏ ｆｒ ｎ ａ ｉ ｎｂ ｏｈ ｉ ｒ ｅ ｓ ａ ｅ ｅ ａ ａ ｉ ｎ ｕ ｉ ｃ ｔ ｆ ａ ａ ｃｎ ｆ ｍ ｅ ｍｅ ｔｔ ｒ ｔ ｌ ｇ — ｃ ｌ ｏ ｉ ｏ ｒ ｒ ｏ ｎ ａ
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高速逆流色谱法
HSCCC进样体积可达到柱体积的20%，广泛用于制备 性分离。
参数
固定相 机理
溶质与固定相作用
上样量 分离效率
操作 费用 危险性
HSCCC
色谱分离是依据被分离物在两相中分配系数的不同而 进行；
逆流色谱是利用物质在两相液体中分配系数的不同实 现分离；
分离也可以依据被分离物在一个含有沉淀剂的浓度梯 度变化的单一溶剂中的溶解度的不同而实现。
（前提：沉淀剂浓度梯度移动的速度远低于溶剂流速）
溶解度具有很小差异的物质，经过在柱中反复的沉淀 和溶解即可达到分离。
二、基本原理
现代逆流色谱仪器体系： 1. 流体静力学平衡体系
2. 流体动力学平衡体系（HSCCC体系） 仪器的两个特征：
a 有一个或多个缠绕有多层聚四氟乙烯管的线轴； b 没有旋转密封接头，有一个安装有两个旋转轴的齿轮传动装置，
能产生一个可变的离心力场。
通过公转、自转（同步 行星式运动）产生的二 维力场，保留两相中的 其中一相作为固定相；
广义定义： 1. 任何利用两相不混溶液体的色谱技术； 2. 其中一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管
或一系列的腔体中； —— 固定相 3. 同时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。
—— 流动相
减少了溶质分子与固体支撑体之间各种复杂的相互作 用；
不仅可以获得高纯度的分离组分；
同时具有较高的回收率和重现性。
离心沉淀色谱（centrifugal precipitation chromatography, CPC）是一种建立在类似于逆流色谱 的不用固体支撑体的开放性通道基础上的沉淀和溶 解色谱。
高速逆流色谱
1.6 葛 Pueraria lobata 葛根素（puerarin）（黄酮） 1.7 苹果 Malus pumila 原矢车菊素(procyanidin)；Procyanidin A及procyanidin
B。 1.8 牛膝 Achyranthes bidentata 牛膝多糖 (多糖) 1.9 宽叶羌活 Notopterygium forbessi notopterol、isoimperatorin。 1.10 红豆杉粗提物 10-脱乙酰浆果紫杉素（10-deacelylbaccatin），紫杉醇
流速范围:0.1-30ml/min 分离流速：2.0-4.0ml/min； 压力:0-2MPa
紫外检测器波长：使用汞灯 - 滤光片选择 254 、 280nm ( 标配 )
多种滤光片可选： 313 、 365 、 405 、 436 、 546nm( 选购 )
温控模块（接循环水浴）：温度调控范围 15 ～ 40 ℃，精度 0.5 ℃ ，
轻的为上相，重的为下相），一相为固定相，另一相 为流动相。 b) 被分离物质的分配系数（K）范围在0.5-2。K=Cu/CL， Cu是上相中溶质浓度，CL是下相中溶质浓度。K＜＜ 0.5 会导致峰分离度的下降，而K＞＞2，会使保留时 间太长，样品峰过宽。
表 1 中列举了常用的溶剂系统。查找溶剂系统可以从左边
步骤2:溶剂系统的优化
区域
化合物极性
A
强极性
B
中极性
C
非极性
溶剂系统 正己烷/正丁醇/甲醇/水 正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水
正己烷/乙腈
步骤3:溶剂比例的优化
一次只改变一种溶剂的量 取少量样品在试管中进行分配系数实验 TLC或HPLC测定实验结果
高速逆流色谱法分离纯化丁公藤中东莨菪内酯
·药品检验·2012年9月第9卷第26期中国医药导报CHINA MEDICAL HERALD丁公藤，是旋花科植物丁公藤（Erycibe obtusifolia Benth.）或光叶丁公藤（Erycibe schmidtii Craib ）的干燥藤茎，全年均可采收，切段或片，晒干[1]，制成中药饮片，具有解表发汗、抗炎、疏风祛湿、舒筋活络、消肿止痛等功效。
丁公藤的化学成分主要有东莨菪内酯、东莨菪苷、咖啡酸和氯原酸等[2-3]，其中东茛菪内酯具有祛风、抗炎、止痛、抗真菌和抗肿瘤作用[4]，因此建立东莨菪内酯的分离提纯方法具有重要意义。
高速逆流色谱（high-speed counter-current chromatogra -phy ，HSCCC ）是近年来发展起来的新型、不使用固态支撑体或载体的连续液-液分配色谱技术，具有分离速度快、样品吸附低、分离重现性好等优点[5-6]，已被广泛应用于天然药物成分的分析鉴定及分离制备。
东莨菪内酯为香豆素类化合物，目前香豆素的传统分离多采用柱色谱和薄层色谱法，操作繁琐，本实验采用半制备型高速逆流色谱仪从丁公藤粗提物中成功分离纯化出东莨菪内酯，经高效液相色谱峰面积归一化法分析，纯度达到98.04%，为香豆素类化合物的高效、方便和快速分离提供了有效借鉴。
1仪器与试剂1.1仪器TBE 300B 高速逆流色谱仪（上海同田生物技术有限公司），AKTA prime 泵及检测系统（美国通用电器医疗集团），LC-20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），HH-1型数显恒温水浴锅（江苏省荣华仪器制造有限公司），9312A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂），DFT-100J 型手提式高速中药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司），C3860型超声波清洗器（河南省巩义市英峪予华公司），Milli-Q Academic 超纯水器（法国密理博有限公司）。
1.2试剂东莨菪内酯标准品（购自中国药品生物制品检定所，批号：110768-200504），粗提物的制备及高速逆流所用的有机溶剂正己烷、乙酸乙酯和甲醇均为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司），HPLC 分析用甲醇为色谱纯（美国Fisher 公司），实验室用水是自制的超纯水。
应用高速逆流色谱分离中药中有效成分及质谱结构研究
应用高速逆流色谱分离中药中有效成分及质谱结构研究I. 研究背景在中医药学的发展过程中，中药已经成为了人们日常生活中不可或缺的一部分。
随着科技的进步，人们对中药的研究也越来越深入，尤其是对中药中有效成分的提取和分离技术。
高速逆流色谱(HSLC)作为一种高效的分离技术，已经在中药研究领域得到了广泛应用。
本研究旨在通过HSLC技术分离中药中的有效成分，并利用质谱技术对其进行结构解析，以期为中药的现代化研究和开发提供理论依据和技术支撑。
在过去的几十年里，我国中医药事业取得了世界公认的辉煌成果。
然而随着现代医学的发展，中医药面临着前所未有的挑战。
为了更好地传承和发扬中医药文化，我们需要不断地对中药进行创新研究，提高其药效和安全性。
高速逆流色谱作为一种新兴的分离技术，具有操作简便、分离效率高、适用范围广等优点，为中药的有效成分提取和分离提供了有力保障。
质谱技术作为现代分析科学的重要手段，已经在生物医药领域取得了显著的应用成果。
通过对中药中有效成分的结构解析，我们可以更深入地了解其药理作用机制，为新药的研发提供理论依据。
此外质谱技术还可以用于中药的质量控制和评价，确保药品的安全性和有效性。
中药中有效成分的研究意义及现状在我们的日常生活中，中药已经成为了许多人的日常调理和疾病治疗的重要手段。
而其中最让人着迷的，莫过于中药中那些神奇的有效成分。
这些成分不仅能够治病救人，还能够为我们的生活带来诸多健康益处。
因此研究中药中有效成分的意义不言而喻。
然而尽管中药有着悠久的历史和丰富的经验，但在现代科学技术的发展下，我们对中药中有效成分的认识仍然有限。
这主要是因为中药中的有效成分种类繁多，分离提取难度较大，而且很多成分的结构性质尚不清楚。
因此如何高效、准确地从中药中提取出这些有效成分，成为了一个亟待解决的问题。
近年来随着高速逆流色谱等现代分离技术的不断发展，我们对中药中有效成分的研究取得了一定的进展。
通过对大量中药样品的分析，我们已经发现了许多具有潜在药用价值的化合物。
高效逆流色谱仪操作规程
高效逆流色谱仪操作规程一、开机：依次打开以下电源1. 恒流输液泵；2. 紫外检测器；3. 高效逆流色谱仪主机；4. 电脑；5. ECW工作站软件（待紫外检测器自检通过后——面板显示“ON”）；6. 恒温水循环器（待高效逆流色谱仪开始旋转后）。
进样前的准备二、恒流输液泵排气泡：1. 拧松泵上灰白色螺母；2. 恒流输液泵分为A泵和B泵，泵吸液管对应的溶剂如下：1）A泵：上相溶剂；2）B泵：下相溶剂；3. 排气泡流速控制：1）Analytical：5 mL/min；2）Preparative：10 mL/min；注意：1）排气泡时注意泵的压力变化，超压时（＞15MPa），降低流速，看压力是否下降，或者停泵检查各接口是否堵塞；2）所用溶剂粘度较大时，可适当降低流速排气泡；4. 排气泡时间：1-2 min，排液管流出溶剂无气泡即可。
三、选择高效逆流色谱仪操作模式：高效逆流色谱仪主机侧板NP/RP旋钮，根据分离方法选择：1. NP：正相；2. RP：反相。
四、选择高效逆流色谱仪色谱柱：高效逆流色谱仪主机侧板Analytical / Preparative旋钮，根据上样量选择：1. Analytical：分析柱，上样量：0.5-2 mL；2. Preparative：制备柱，上样量：3-12 mL。
五、选择高效逆流色谱仪样品环：根据上样体积选择相应的样品环：0.5、1、2、3、6、12 mL。
六、进固定相溶剂两个柱体积：1. 两个柱体积：1）Analytical：60 mL；2）Preparative：300 mL；2. 流速：1）Analytical：5 mL/min；2）Preparative：15 mL/min；注意：1）泵压力超压时（＞15MPa），降低流速或停泵检查各接口是否堵塞；2）用量筒接排除溶剂，溶液出现分层即可停泵。
七、进流动相溶剂：1. 运行高效逆流色谱仪，待转速稳定（1600 rpm）后，泵入流动相溶剂；2. 流速：若超压（＞15MPa），降低流速或停泵检查各接口是否堵塞1）Analytical：1 mL/min；2）Preparative：10 mL/min；3. 量筒内排出的溶液分层即可，分层时固定相溶剂体积：1）Analytical：≤15 mL；2）Preparative：40-50 mL；注意：1）正相：固定相为下相溶剂，流动相为上相溶剂；2）反相：固定相为上相溶剂，流动相为下相溶剂。
高速逆流色谱操作步骤
高速逆流色谱操作步骤高速逆流色谱（High-Performance Counter-Current Chromatography，HPCCC）是一种液-液色谱技术，通过在两种不同的不溶溶剂相之间的弯曲螺旋柱中建立逆流运动，实现分离和纯化化合物。
以下是一般的高速逆流色谱的操作步骤：1.系统准备：•确保逆流色谱系统（HPCCC系统）处于良好状态，所有连接都紧固，管路无泄漏。
•根据实验需要选择合适的溶剂相，并准备好两相的溶液。
2.填充柱体：•将两相的溶液分别注入到弯曲螺旋柱的两个相对侧。
柱内建立液-液平衡。
3.样品加载：•在逆流色谱系统中加入待分离的混合物样品。
4.逆流运行：•开始逆流运行，通过外部离心力或其他手段，让两相的流动方向相反。
这样，溶液就会在弯曲螺旋柱中形成逆流。
5.分离：•样品成分在两相中根据其在两相之间的分配系数进行分离。
相对溶剂流动的方向，样品在柱内依次进入高和低浓度的相中，实现分离。
6.收集分离产物：•根据需要，通过调整逆流色谱系统的操作参数，收集某个时间点或某个分离峰的产物。
7.监测：•监测分离过程，可以使用检测器如紫外可见光谱仪（UV-Vis）等进行在线监测。
8.系统维护：•在实验过程中，注意监测溶剂消耗情况，必要时进行补充。
对于柱体的维护和清洗也需要定期进行，以保证仪器的正常运行。
需要注意，高速逆流色谱是一种相对复杂的色谱技术，具体的操作步骤可能会因为使用的设备和实验条件而有所不同。
在进行高速逆流色谱实验时，建议参考具体的仪器操作手册和相关文献，确保按照正确的步骤进行操作。
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高速逆流色谱操作步骤和要点操作步骤：1 配液。
超声脱气约20min，脱气后静置冷却至室温后泵液。
2 打开恒温水浴，将温度升至设定温度。
3 泵固定相。
以10-20mL/min流速泵入固定相，检测器出口端流出固定相约20-50 mL后停泵。
4 平衡。
打开紫外检测器开始预热，正转转动主机至900 rpm（FWD为正转，REV 为反转），同时以3 mL/min流速泵入流动相，至出口端流出流动相且此时紫外信号稳定，体系基本己平衡。
5 进样。
以体系的上、下相溶解一定量的样品，超声溶解均匀后，在装样注射器中倒入样品溶液，将进样六通问切换至load，推排气泡后吸液至样品全进入进样圈中，将load切换至inject，检测器、工作站调零开始记录。
6 接收流分。
工作站记录，设备运行时间为如5 min，保存后采集数据，保存。
7清洗。
断开泵与主机的连接，将主机进口与气管出口连接，吹气；将主机中溶剂吹出后，泵入约50 mL清洗液，吹气，重复此过程2~3次；最后一次长时间（1小时左右直至吹干）吹气时将主机内液体吹尽。
8 关机。
操作要点：本仪器适用于有机溶剂，316L不锈钢及PTFE材料可耐受的酸碱溶液。
1 本设备可承受的压力限制为2 MPa，请勿泵入不可溶解的固体颗粒。
2 设备运行前先检查连接管路是否正确，是否紧密；检测器波长是否正确。
3 配液时溶剂应混合均匀，自然分层澄清后可超声脱气，脱气时间不宜过长，脱气后如溶剂有温热则最好冷却静置至室温后使用。
4 样品溶解可为体系上相或下相，或同时两相溶解；不可以单一的溶剂来溶解进样，以免破坏主机内的体系平衡。
5 每次做完实验请及时清洗设备，一般清洗液为甲醇、乙醇等，如体系内含有酸、碱、盐等溶剂，建议先以纯净水清洗l~2次后，再以清洗液清洗。
6 日常清洗完设备后；如需继续进行实验，请设备放置2小时后重新平衡。
7 操作中如有气泡、流失或其他异常现象，可致电上海同田生物技术有限公司技术支持部2附件1：仪器性能检验苯酚、间苯二酚的分离体系：正已烷：乙酸乙酯：乙醇：水=1：1：1.2：0.8把溶剂按比例配制好，混合均匀后分相，上相用作固定相，下相用作流动相，分别超声脱气约20 min。
样品为苯酚、间苯二酚，各30 mg溶于5 mL上下混合溶剂中 1、主机分离管路体积的测定用量筒取500毫升上相，用泵泵入主机管路内，当上相从管路的出柱口流出后，继续泵至上相流出30毫升，停泵，记录下量筒内剩下的上相体积，及收集到的流出上相的体积；总体积的计算：V总=500-V剩余-V流出 (1)式中： V总——管路测定总体积（mL）；V剩余------泵入固定相的体积后，剩余在量筒中的体积（mL）；V流出------流出固定相的体积（mL）。
2、固定相保留率的测定以900 rpm的转速正向旋转已被上相充满管路的主机，同时以3.00 mL/min的流速往分离管路内泵入流动相，当主机出柱口管路流出流动相后，量出被流动相推出的上相体积（V出）；固定相保留率的计算：保留率= ×100% (2)式中：V总――管路总体积（mL）V出――流动相推出上相体积（mL）V环――进样环的体积（mL）保留率大于等于40%为合格。
3、标准峰的验证通过六通阀往上、下相已经平衡了的管路内加入溶解好的样品，用流动相以3.00 mL/min流速洗脱，直至标准峰的出现，整个过程须用色谱工作站记录谱图。
TBE-300A高速逆流色谱仪说明书高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液－液分配色谱分离技术。
它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立的一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。
由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，目前已广泛应用于多种领域。
HSCCC的应用领域：1、天然产物有效成分的分离纯化;2、多肽，蛋白质和多糖等生物大分子分离3、抗生素的分离纯化4、化工和化学合成物质的分离纯化5、食品功能成分的分离纯化6、农药残留物质分离分析7、中药指纹图谱和质量控制研究8、海洋生物活性成分的分离纯化HSCCC的独特优势：1、高效提纯；2、大制备量；3、低使用成本；4、高科研价值；5、易工艺放大；6、高回收率。
1、系统构成：由TBE-300A型高速逆流色谱分离仪组成的分离分析系统，一般包括：泵、主机、检测仪、恒温循环器（选购件）、数据处理系统、溶剂选择系统。
如图1所示1.1TBE-300A主机主机是实现样品分离的场所，样品在主机内分离，并随着流动相按分配比的大小依次流出；主机包括：转速控制器、双六通阀、螺旋柱、恒温套等部分。
1.2恒流泵以恒定的流速向主机管路内泵入固定相和流动相；使用时，应注意泵的过滤器应浸在液面以下，以防止泵入空气，影响主机的分离效果。
（附：泵设定的保护压力应为2兆帕。
）1.3紫外检测仪检测经分离后样品中各组分的吸光度，然后将吸光度转变成电信号，并传送给色谱工作站，操作详见其说明书。
(附：紫外、ELSD等通用检测器都能连用。
)1.4恒温循环器向恒温套提供温度相对恒定的传热介质，达到稳定分离场所的温度的作用。
1.5色谱工作站将紫外检测仪传送过来的电信号，转换成数字信号，并通过相应的软件，将数字信号记录下来。
2、主机说明2.1 功能键说明2.1.1 变频器控制面板调节和显示仪器的转速，rpm2.1.2 Power键电源开关，控制主机电源的接通与断开；仪器在不工作时，必须把电源断开，断开电源前，先要让主机完全停止转动。
往下按为接通电源，往上按为切断电源2.1.3 进样口进样口为注射器的针头，可将干净的注射器插入到注射针头口上，将分离样品样品装入注射器A里；再用干净的注射器B将注射器A里的样品抽入到样品圈里。
2.1.4 进样六通阀 Load档为载样的状态，当进完样品后将“进样六通阀”切换到Inject档即可完成进样操作。
出厂设置在inject档。
2.1.5 流路切换六通阀 1. 当该六通阀在In档时，HSCCC的洗脱方向是从首端尾端；2. 当六通阀在Out档时，HSCCC的洗脱方向是从尾端首端。
2.1.6 进柱口通过进柱口用连接管将泵的流路与分离管柱的入口端连接，工作时，流动相从进柱口进入分离管路内；在主机面板上用Pump表示。
2.1.7 出柱口通过出柱口，将分离管柱的出口端与检测器连接；参与过分配的流动相从出柱口流出分离管路，进入到检测器进行检测；在主机侧面板上用Detector 表示。
2.1.8 “恒温套入水口”、“恒温套出水口”：通过该接口将恒温循环器的循环流路同主机的恒温套连接起来，以达到给主机分离管柱恒温的目的。
“恒温套入水口”连接恒温循环水浴的出水口，“恒温套出水口”连接恒温循环水浴的入水口。
2.2 六通阀详解本机配有两个六通阀，流路切换六通阀（1号）和进样六通阀（2号）。
*两个六通阀之间的连接及1号六通阀的工作流路情况如图所示：1、正向、反向工作示意图：2、进样工作示意图：2.3 进样步骤：1、称取待分离样品2、将样品溶解完全，无明显可见颗粒（样品既可用流动相或固定相溶解，也可用两相混合溶剂溶解。
）3、把2号六通阀的手柄拨到Load档（拨手柄时，速度要快，以防管路不通或暂时压力过高胀破进样圈管路）；4、装入样品，用注射器把样品圈尾部的气泡排除干净（见气泡冒出且进样注射器内液面上升，无气泡为宜）；将注射器回抽入定量环中（2号六通阀Inject 处有一个引出的管路，由此抽入样品）；5、把2号六通阀拨到Inject档；6、清洗六通阀进样管路；清洗的详细步骤如下：⑴、用注射器将清洗液从抽入到注射器中（2号六通阀Inject处有一个引出的管路，由此抽入清洗液）；⑵、将抽入到注射器中的清洗液中倒入废液瓶中；⑶、若管路还没有清洗干净，可重复上述操作再清洗一次。
*注：进样时，先用B注射器从进样口注入一小段空气，以排除溢出口处的空气；然后，抽动注射器活塞，把样品吸入进样圈中。
2.4.1 变频器功能键说明：“▲”“▼”键：调整仪器转速的设定；“▲”为增加数值，“▼”为减少数值；最小调整范围0.1 rpm“◄”键：数位移动键，将数位左向移动“PROG”键：记忆键，确认已设定好的转速数值“FWD”键：转速设定好之后，按“PROG”键确定；然后按“FWD”键开始旋转仪器，“正转指示灯”变亮，显示屏数值从“0000”迅速升至设定转速（此时不可非正常停机）。
“REV”键：转速设定好之后，按“PROG”键确定；然后按“REV”键开始旋转仪器，“反转指示灯”变亮，显示屏数值从“0000”迅速升至设定转速（此时不可非正常停机）。
“转速调节旋钮”：可调整仪器转速，向右增大转速，向左减少转速“STOP”键：按下此键，显示屏数值迅速减少至“0000”，表示结束工作，此时按下主机“POWER”键为“Off”位置，结束主机电源供应（属正常关机）。
“FUNC”键：为功能键，出厂时设为默认；用户禁止更改TBE-300A高速逆流色谱分离仪工作流程如下（以液压泵为压力源）：。