土壤中分离霉菌
土壤中微生物的分离与鉴定实验报告
Sdu微生物大实验土壤微生物的分离纯化与鉴定【实验目的】1、从各地区土壤中筛选含几丁质酶的真菌及含果胶酶的菌株；2、通过从土壤中分离纯化菌株，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的筛选、分离纯化方法和无菌操作技术。
3、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。
4、掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。
【实验原理】1、微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：a.选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。
b.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。
微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。
前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。
2、霉菌：霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。
霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。
霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3-10μm ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。
观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本实验采用载玻片培养观察法。
3、果胶酶筛选培养基：配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。
刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。
霉菌的分离实验报告
霉菌的分离实验报告引言霉菌是一类真菌，广泛存在于自然界的土壤、空气、植物等环境中。
它们以分解有机物质为生，在自然界中具有重要的生态作用。
然而，霉菌也是一种常见的病原微生物，能够引起多种人类和动植物的感染疾病。
为了更好地了解霉菌的特性和传播途径，本实验旨在通过分离方法获取纯净的霉菌菌株，并初步分析其形态特征。
实验材料和方法实验材料：- 手套- 剪刀- 无菌培养基（琼脂）- 玻璃棒- 离心管- 蒸馏水- Petri 洁净培养皿- 测量瓶实验方法：1. 霉菌样品的收集：在潮湿的环境中选择具有明显霉斑的表面进行采样，避免采集到周围环境中的杂菌。
2. 实验场所的准备：在无菌条件下完成所有操作，保持实验环境的卫生。
3. 样品处理：带着手套使用剪刀将具有霉斑的样品剪下，并将其放入离心管中。
加入20 ml 的蒸馏水，将离心管盖好，摇匀样品，使其充分悬浊。
4. 稀释与分离：取0.1 ml 的上述悬浊液加入测量瓶中，再加入9.9 ml 的蒸馏水进行10倍稀释。
取1 ml 的稀释液加入离心管中，再加入9 ml 的蒸馏水进行10倍稀释。
依次取样进行稀释，最后取适量稀释液均匀涂布在无菌琼脂培养皿上。
5. 培养条件：将琼脂培养皿孵育在恒温培养箱中，温度为25 ±2，培养时间为48 - 72小时。
6. 菌落形态观察：在培养箱中取出培养皿，通过目测观察霉菌菌落的形态特征，如颜色、形状、凸起程度等。
实验结果经过培养箱中的恒温孵育，在培养皿上出现了多个菌落。
根据其形态特征，选取了三个菌落用无菌棉签分别划线后进行传代。
菌落1- 颜色：灰白色- 形状：圆形- 表面：粗糙- 边缘：光滑菌落2- 颜色：绿色- 形状：不规则- 表面：绒毛状- 边缘：锯齿状菌落3- 颜色：黑色- 形状：扁平- 表面：光滑- 边缘：光滑结论通过实验，成功分离得到了三种霉菌菌株，并对其进行了初步的形态特征分析。
菌落1为灰白色、圆形，表面粗糙，边缘光滑；菌落2为绿色、不规则形状，表面绒毛状，边缘呈锯齿状；菌落3为黑色、扁平形状，表面光滑，边缘光滑。
实验六 土壤中真菌纯化、分离和培养
土壤稀释液的制备和稀释液的取样
2、分离方法 采用稀释平板分离法。又可分为两种 方法。
混菌法和涂抹法。
混 菌 法
涂 抹 法
3、培养
将上述接种土壤悬液的平板 倒置于28℃培养3-5d。
4、挑菌纯化 5、计数
6、菌种保存
将分离到的真菌转接到PDA斜面上培 养，待长好后，置于冰籍中保存，必要时 进行深入研究。
?4挑菌纯化?5计数?6菌种保存将分离到的真菌转接到pda斜面上培养待长好后置于冰籍中保存必要时进行深入研究
实验六
土壤中真菌分离、纯化和培养
一、目的要求
掌握从土壤中初步分离培养真菌的方法， 从而获得真菌纯培养技能；了解基本接 种技术。
二、实验原理
土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发 现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。 不同土样中各类微生物数量不同，一般土 壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。 本次实验从土壤中分离真菌。
三、仪器和材料
样品：新鲜土壤 培养基：加有2ml链霉素的PDA培养基。 无菌水：装有9mL无菌水的试管4支。 其它：无菌培养皿4皿、无菌吸管、酒精 灯、培养箱等 。
四、真菌纯种分离的操作方法
1、土壤稀释液的制备
用“稀释平板计数法”中的方法 进行，将土样稀释至10－5。
将1瓶土壤菌液（称取土样10g放入盛90 mL无菌水）和4管9mL的无菌水排列好， 按10-1、10-2、10-3、10-4及10-5依次编号。 在无菌操作条件下，用lmL无菌移液管吸 取lmL10-1浓度的菌液于一管9mL无菌水 中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓 度菌液。同样方法，依次稀释到10-5。 注意：在土壤稀释过程中，吸取不同梯 度的菌液需换用不同的吸管。
细菌 、放线菌 、酵母菌及霉菌的分离与纯化
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。
2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
4. 学习平板菌落计数法。
二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。
要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。
表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～37 1～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号28 5～7土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～30 3～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～30 2～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。
3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。
4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。
4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。
（一）系列稀释平板法1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法
土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法微生物因为体积小、质量轻、适应性强、繁殖能力强等特点，广泛分布于自然界中。
它们存在于食品、化妆品、饲料、环境等人们能触及的各个角落中。
某些微生物对产品的污染，不仅影响到产品本身的质量，更严重的是它危及消费者的健康和安全。
科标检测研究院凭借多年的微生物检测经验，可提供快速、高效、权威的第三方微生物检测服务，赢得社会业内广泛认可。
主要针对食品、医药、化妆品、农产品、一次性产品以及工业产品等进行微生物检测以及产品微生物污染分析。
以下介绍几种菌的分离方法：一、从土壤中分离放线菌1.制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
2.称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。
振荡10分钟，制成10-1菌悬液。
按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。
3.用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。
然后将培养皿倒置于25-30℃温箱中，培养7-10天，培养基上会出现微生物菌落。
如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。
4.挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。
二、从土壤中分离霉菌1.制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。
将培养皿中，凝成平板，待用。
2.称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。
3.取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。
然后将培养皿倒置于2 5-30℃温箱内培养3-4天。
培养基上会出现微生物菌落。
霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。
4.挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上三、从饮水中分离大肠杆菌1.制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
2.用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1:10稀释。
土壤中霉菌的分离
Martin 培养基的配制
用量
1L
240ml
20g
4.8g
10g
2.4g
5g
1.2g
1g
0.24g
0,.5g
0.12g
100ml
24ml
900ml
216ml
——
——
115℃ 30min
0.03g
0.0072g
备注
待链霉素加入前，需将培养基冷却到 55℃~60℃，最终含量为 30ug/ml 5 移液管包装：6 支
6.加压蒸汽灭菌 操作者
温度
时间
备注
（二）．实验操作步骤 稀释涂布平板法. 1.倒平板，加入链霉素后，摇匀，趁热倒平板，凝固后，并做好标记，10-3,10-4,10-5,10-6,每梯 度 3 个平板。
2.制备土壤稀释液 待 90ml 无菌水降至室温，称取土样 10g，置入盛有 90ml 无菌水的三角瓶中，震荡，摇匀，
数
均
均
均
均
每克 样品 总菌 数
每克样真菌数： s
x
0.1 10
*10^
n
稀释度为 10-n 平均菌落数 X
2，通过菌落形态的观察辨别出霉菌，并在平板底做好标记
六.参考书目
[1] 周德庆 . 微生物学教程 . 3 版 . 北京: 高等教育出版社, 2013 [2] 熊元林 , 姚小飞 . 赵为 . 微生物实验 . 2 版 . 华中师范大学出版社, 2014 [3] 周德庆 , 徐德强 . 微生物实验教程 . 3 版 . 北京:高等教育出版社, 2013 [4] 李兴杰 . 微生物学 . 北京:高等教育出版社 , 2013 [5] 车振明 . 微生物学 . 北京:科学出版社 , 2011
曲霉的分离问题回答
曲霉的分离曲霉是一种真菌，广泛存在于自然界中的土壤、水体和空气中。
它们具有很强的代谢能力，可以分解有机物质，是生物降解和有机废弃物处理的重要微生物。
此外，曲霉还可以产生一些重要的代谢产物，如抗生素、酶、有机酸等，在食品工业、医药工业、环境保护等领域具有广泛应用。
曲霉的分离是研究其代谢特性和产物合成机制的基础。
以下是关于曲霉分离的详细介绍：1. 分离方法（1）土壤样品法：从自然环境中采集土壤样品，将其加入含有适当营养成分的琼脂培养基中，在适当温度下培养并筛选出曲霉菌株。
（2）空气样品法：采用空气采样器采集室内或室外空气中的微生物样品，将其接种到含有适当营养成分的琼脂培养基中，在适当温度下培养并筛选出曲霉菌株。
（3）食品样品法：从食品中采集曲霉样品，将其接种到含有适当营养成分的琼脂培养基中，在适当温度下培养并筛选出曲霉菌株。
2. 培养条件曲霉的生长和代谢需要适宜的温度、湿度和营养物质。
通常情况下，曲霉的最适生长温度为25℃-30℃，最适生长pH值为5.0-7.0。
在培养基中添加合适的碳源、氮源和矿物质元素可以促进曲霉菌株的生长和代谢。
3. 筛选方法在分离得到曲霉菌株后，需要进行筛选以获得具有特定代谢特性或产物合成能力的菌株。
常用的筛选方法包括：（1）形态学特征：通过观察菌落形态、颜色、纹理等特征来鉴定不同种类的曲霉菌株。
（2）抗生素活性：利用抑制其他微生物生长的能力来筛选具有抗生素活性的曲霉菌株。
（3）酶活性：利用曲霉产生的酶来分解特定底物，通过观察底物的降解情况来筛选具有特定酶活性的曲霉菌株。
（4）代谢产物：通过检测曲霉菌株发酵液中的代谢产物来筛选具有特定代谢能力的曲霉菌株。
4. 保存方法分离得到的曲霉菌株需要进行保存以便后续研究。
常用的保存方法包括：（1）冷冻法：将曲霉菌株培养在含有10%-20%甘油或DMSO的琼脂培养基上，将其置于-80℃低温条件下保存。
（2）干燥法：将曲霉菌株培养在琼脂培养基上，将其置于干燥器中进行干燥处理，然后将其保存在低温、低湿度条件下。
如何从土壤中分离出微生物
如何从土壤（污水）中分离出微生物把污水加蒸馏水分别稀释10，100，1000倍，然后加入培养基中培养，如果培养出来菌落重合，菌非常多，无法分离，就加大稀释倍数，直至获得清晰可分离的菌落，有时甚至是非常小的菌落，要用倒置显微镜操作。
而培养基则根据要分离的菌的营养类型进行配置，若要获得多种微生物就要配置多种培养基进行如上操作。
对于土壤加水溶解，对溶解液进行如上操作，不溶的部分就不用管了1.取以少许土壤（一地表以下10cm处为宜）与适量无菌水混匀备用2.做浸出液的梯度稀释3 .涂平板4.划线分离5.接平板，接斜面6.检测从土壤中分离微生物环境工程（1）班一、试验目的1..学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数量和组成。
2初步掌握从土壤中分离细菌的基本技术。
二、实验原理土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件．所以土壤中微生物的数量和种类都很多。
它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。
此外，土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用。
因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是十分必要的。
三、实验器材(—)培养基肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌）高氏一号琼脂培养基（培养放线菌）查氏培养基（培养霉菌）(二)灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培养皿。
(三)土壤样品、天平、称旦纸。
（四）恒温箱、气体流量计四、试验程序1、倒平板将培养基加热融化，待冷至55—60℃时，混合均匀后倒平板；2、制备土壤稀释液准确称取土样10g，加入装有90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。
用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列稀释菌液3、涂布将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lml放入编号10-4的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。
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土壤中分离霉菌
培养基（ms加乳酸和抑菌物质）1ml量
土豆200g蔗糖30g 琼脂20g
大量元素母液50ml铁盐、微量元素、有机成分母液各10ml
乳酸5g氯霉素0.1g
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1、实验器材的准备与灭菌
*用报纸包扎好所需的培养皿等工具进行灭菌
*加热至160℃～170℃维持2小时
*用高压灭菌锅制备无菌水
*准备好取土的工具及酒精
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 2、药品的称量
*用分析天平准确称量元素和药品
*称量后溶解配制成母液
*在进行少量药品的称量
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3、其他药品的称量
* 用天平称取土豆100g
*蔗糖30g
*琼脂20g
*放入抑菌物质0.1g
*乳酸5g
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 4、培养基的制备
* 取少量的水加入切好的土豆煮沸后过滤
*加入蔗糖和琼脂煮沸至琼脂溶解
*放入取好的大量元素等搅拌
*放入抑菌物质和乳酸
*加水至1L煮沸后即可
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 5.培养基的分装
*把制作好的培养基倒入试管并进行包扎
*共倒入14支即可培养基为1/3到1/2之间
*剩下的倒入锥心瓶中
*包扎好准备灭菌
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6、灭菌
*打开高压灭菌锅加入适量的水
*把培养基放入锅内
*关闭灭菌锅后调整好压强和温度进行灭菌
*压力0.105pa121度20min
*灭菌后取出培养基
*取出后的试管放斜，锥形瓶中的进行培养皿倾倒
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
7、
*台面进行清理及灭菌后打开风扇及照明灯
*从包好的报纸中取出灭菌后的培养皿
*在酒精的火焰旁左手微微打开培养皿左手倾倒
养基
*倾倒完成后待培养基冷却后翻转培养基
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
8、无菌检测
*将倾倒好之后的培养皿和斜面放入恒温培养箱
*调节好温度28-30度
*培养1天后检查是否污染
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9、土样选取
*选三出距离超过200米的取样点
*把铲子和所需要的器具用酒精消毒
*把土壤挖开15厘米以下取一两勺土
*用灭菌后的纸包好
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 10、无菌水分装
*取灭过菌的试管和和移液管进行分装
*在超净工作台上进行分装
*每支试管7ml无菌水
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 11、泥土的稀释
*准确称取1g土样
*放入100ml无菌水中稀释
*震旦30min
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
12、菌液的稀释
*在工作台上用移液枪准确移去3ml土壤样液与第一
只试管震旦
*然后从震旦后的试管中移去3ml放入第二支试管震
旦
*依次类推
*直到第七支试管
注意：每次移取后更换枪头
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 13、涂布
*用移液枪移取1ml第七支试管内的溶液滴在培养
皿上
*然后用灭过菌的涂布三角在火焰旁进行涂布
*共涂布三个
*涂布后标记好浓度
*然后在依次涂布下一浓度液体
注意：每次移取后更换枪头
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 14、培养
*放入恒温培养箱内进行培养
*时间为2-3天
*温度28-30度
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 15、培养后观察
*培养2-3天后取出观察
*发现培养基内长满了细菌
*无法分辨菌落
结果：实验失败
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对比
失败（小组试验）成功（文库图片）
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失败原因分析：
1、抑菌药物添加错误
2、选择培养基用错
总结
能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。
在霉菌计数中，主要使用以下几种选择性培养基：
马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）：霉菌在PDA培养基上生长良好。
用PDA 作平板计数时，必项加入抗菌素以抑制细菌。
孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。
孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延生长。
在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌菌落的计数。
高盐察氏培养基：粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良好，它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作用。
所以选用时尽量选取孟加拉红（虎红）培养基，这个培养基对于杂菌的抑制效果较好，且利于后期的观察。
正确选择培养基和正确操作是细菌分离培养的关键。
作者：李莎莎
云南国防职业技术学院
2015年1月4日。