定量PCR 简介
定量pcr的方法
定量pcr的方法定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是一种在实验室中常用的分子生物学技术，旨在定量测定DNA或RNA分子的相对丰度。
本文将详细介绍定量PCR的原理、操作步骤以及应用领域。
一、定量PCR的原理定量PCR的原理基于聚合酶链反应（PCR）技术，该技术通过复制模板DNA 或RNA分子的特定片段来实现特异性扩增，从而产生大量复制产物。
在定量PCR 中，引入一种特定的荧光探针，该荧光探针与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的数量与初始模板分子量成正比，因此可以通过测量荧光信号的强度来定量PCR产物中的特定DNA或RNA分子序列的相对丰度。
二、定量PCR的操作步骤1. 制备PCR反应体系：将反应缓冲液、模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶、核苷酸和水混合制备反应体系。
反应体系中的核苷酸是用来提供DNA 或RNA的基本成分。
2. 热循环条件设置：选择合适的PCR仪，并设置合适的热循环条件。
热循环的三个步骤包括变性、退火和扩增。
3. 变性步骤：将反应体系加热至高温，通常为94-98，使DNA或RNA解性，即DNA双链分离，RNA变性为单链，使模板分子可供扩增。
4. 退火步骤：降低温度到引物特异性结合的温度，引物会与模板分子特异性结合，这通常在50-65之间进行。
5. 扩增步骤：将退火的反应体系加热至合适的温度，通常为72，此时聚合酶开始合成新的DNA链，延伸引物。
该步骤重复多次，每次扩增会产生两倍数量的DNA或RNA分子。
6. 荧光检测：在PCR反应进行过程中，荧光探针会与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的强度与扩增产品的数量成正比。
7. 数据分析：使用特定的软件来分析荧光信号数据，将其转化为反应物的初始模板浓度。
可以通过比较不同样本的荧光信号强度来定量比较DNA或RNA的相对丰度。
定量PCR技术
定量PCR技术定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术有广义概念和狭义概念。
广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。
广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：（1）外参法+终产物分析。
所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。
这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。
（2）内参法+终产物分析。
所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。
这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。
（3）外标法+过程监测。
这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。
（4）内参法+过程监测。
由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竟争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。
（5）外标法+过程监测+内对照。
这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。
这种类型是应该提倡的。
PCR过程的监测有多种检测模式。
最常用的有三种检测模式：（1）R Green I 检测模式。
温度循环为94—55—72°C三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。
通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。
（2）解探针模式（Taqman）Hydrolysis Probe 。
温度循环为94—60°C二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。
在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。
当Taq酶在60°C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶5`—3`外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。
定量pcr
定量 PCR引言定量 PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种广泛应用于分子生物学研究领域的技术，用于准确测量目标DNA序列的拷贝数。
PCR技术是以体外放大DNA片段为基础的一种技术，通过多轮的循环反应来放大目标DNA序列，使得原本很少的DNA分子可以在较短时间内得到大量扩增，从而进行后续的定量分析。
PCR的工作原理PCR的工作原理基于DNA的分子复制，它是在体外模拟DNA的自然复制过程。
PCR技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，PCR反应体系中的DNA模板被高温（通常为95°C）使其变性断裂成两条单链。
此时，DNA的双链结构被解开，使其成为两条单链，这种状态被称为“变性”。
退火步骤中，反应温度降低至目标DNA片段的引物可以与DNA模板中的互补序列结合。
引物是一小段具有互补碱基序列的DNA段，作为PCR反应的起始点。
引物的设计需要考虑目标DNA的序列，以确保引物与目标DNA序列的互补性。
通过合适的引物设计，它们可以特异性地结合到目标DNA序列。
在延伸步骤中，温度升高至DNA聚合酶的最佳工作温度，通常为72°C。
此时，引物结合到目标DNA序列上，并将DNA聚合酶添加到反应体系中，启动DNA的合成。
DNA聚合酶能够在引物的引导下，沿着DNA模板链向前合成新的DNA链。
这个过程被称为延伸。
经过多轮的循环，原本只有一条DNA模板链的目标DNA序列，将得到大量的扩增。
定量 PCR 的原理与常规PCR 不同，定量PCR 不仅仅是扩增目标DNA序列，还可以准确测量目标DNA序列的拷贝数。
定量 PCR 通常需要引入内部参照物，也被称为标准物，以便与待测样品中目标DNA进行比较。
内部参照物是已知拷贝数的一段DNA序列，在PCR体系中与目标DNA同时扩增。
通过在PCR体系中引入不同浓度的标准物，我们可以构建一个标准曲线。
标准曲线是标准物浓度和PCR循环数之间的关系图，通过这个曲线可以确定待测样品中目标DNA的拷贝数。
定量PCR方法及数据分析
定量PCR方法及数据分析定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于测量特定DNA序列的相对数量。
它可以广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因拷贝数和染色体异常等研究领域。
本文将阐述定量PCR的基本原理，实验步骤和数据分析方法。
定量PCR的基本原理是依赖于DNA的扩增过程。
PCR反应需要一对引物，它们特异性地结合在目标DNA序列的两端，通过加热使DNA解旋，然后在适当的温度下引物与目标DNA序列互补结合，在酶的催化下进行扩增。
每一轮的PCR扩增会使目标DNA数量成指数型增加。
由于每一个目标序列的扩增效率可能不同，因此需要标准曲线来进行定量。
定量PCR的实验步骤分为两个阶段：前PCR和qPCR。
前PCR是标准曲线的制备阶段，通过将已知浓度的目标DNA进行PCR扩增，然后根据PCR产物的浓度制备一系列浓度梯度的DNA模板。
qPCR是主要实验阶段，将待测样品与合适的引物和探针（可选）混合，在PCR仪中进行扩增反应。
PCR反应后，根据荧光信号的强度，以及标准曲线计算得出待测样品中目标DNA的相对数量。
对于数据分析，常用的方法有相对定量和绝对定量两种。
相对定量是将待测样品与对照样品进行比较，计算出相对表达量。
这需要选择一个内部参考基因（housekeeping gene），其表达在不同条件下稳定不变。
通过将待测基因和内部参考基因的Ct值（cycle threshold）相减，得出差值。
差值较大表示待测基因表达高，差值较小表示待测基因表达低。
这种方法的优点是操作简单，但存在引物和探针设计的问题，以及内部参考基因选择的问题。
因此，有时候也需要进行多个内部参考基因的选择。
绝对定量是根据标准曲线计算待测样品中目标DNA的绝对数量。
标准曲线可以通过前PCR阶段制备的一系列DNA模板进行构建。
通过将已知浓度的DNA模板进行qPCR测定，得到Ct值和浓度之间的标准曲线。
PCR定量方法概述
PCR定量方法概述PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学研究中的技术，可通过扩增特定DNA片段数量来进行定量分析。
PCR定量方法的发展使得我们能够更加准确、快速地测量和定量目标DNA序列或基因表达水平。
本文将概述PCR定量方法的原理、步骤和应用。
一、PCR定量方法的原理PCR定量方法是基于PCR技术的扩增效率与起始模板浓度成正比的原理。
在PCR反应中，模板DNA以指数级倍增，而每个PCR周期后，扩增效率会逐渐降低。
通过确定PCR周期数和目标序列浓度之间的关系，可以利用定标曲线或计算方法来定量目标DNA的起始浓度。
二、PCR定量方法的步骤1. DNA提取：从样本（如细胞、组织或血液）中提取DNA，并纯化得到高质量的模板DNA。
2. 靶序列选择：根据需要定量的目标序列，设计引物和探针，保证其特异性和高效性。
3. PCR反应设置：根据目标序列的长度和特性，确定PCR反应体系中的引物和探针的浓度，优化反应条件（如温度和时间）。
4. 制备标准曲线：通过系列稀释的已知浓度的标准品，构建定标曲线，用于后续定量计算。
5. PCR扩增：将模板DNA与引物和探针加入PCR反应体系中，进行一系列PCR循环，扩增目标序列。
6. 实时监测：利用实时荧光PCR仪或其他检测方法，监测PCR反应过程中探针的荧光信号强度。
7. 数据分析：根据定标曲线和荧光信号强度，计算出目标DNA的起始浓度。
三、PCR定量方法的应用1. 基因表达分析：通过比较不同样品中目标基因的表达水平，研究基因在生理和病理过程中的变化。
2. 病原体检测：定量PCR可用于检测和定量病原体DNA，用于快速诊断与预后评估。
3. 肿瘤检测：通过定量PCR检测肿瘤标志物，提供肿瘤早期诊断和治疗效果监测。
4. 遗传病筛查：利用PCR定量方法可以检测和定量与遗传病相关的突变或多态性位点。
5. GMO检测：定量PCR可用于识别和量化转基因生物的成分和含量。
6. 受精能力评估：通过检测精子和卵子中特定基因的数量，评估生殖健康和受精能力。
1定量PCR基本原理
1定量PCR基本原理定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测和测量DNA或RNA分子数量的分子生物学技术。
它是常用的基因表达和检测技术。
以下是定量PCR的基本原理。
定量PCR的基本原理可以分为三个主要步骤：扩增反应、检测荧光信号和标准曲线计算。
第一步是扩增反应。
PCR反应通常在一个热循环中进行，每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤通过高温将DNA双链分离成两条单链。
然后，在退火步骤中，引物通过与目标DNA序列特异性碱基配对，使其结合到模板DNA上。
最后，在延伸步骤中，DNA聚合酶将新的DNA链合成为与模板DNA相匹配的互补链。
这个循环过程被重复多次，每个循环使得目标序列的数量翻倍，从而进一步扩增目标DNA序列。
第二步是检测荧光信号。
PCR反应中通常会引入一个特定的探针或染料，其结构包括与目标DNA序列特异性结合的引物，并带有一个发光染料和一个参考染料。
扩增反应进行时，DNA聚合酶会催化探针与模板DNA结合，并释放出发光信号。
发光信号的强度与目标DNA序列的数量成正比。
参考染料发出的信号用于校正可能因扩增反应条件变化而引起的信号差异。
第三步是用标准曲线计算目标序列的数量。
标准曲线是通过基于已知浓度的一系列标准样品构建的。
这些标准样品包含与待测样品相同的目标序列，但其浓度已知。
将标准曲线上的荧光信号强度与标准样品的浓度进行比较，可以建立一个线性关系模型。
然后，通过将待测样品的荧光信号强度与标准曲线进行比较，可以计算出待测样品中目标序列的初始浓度。
定量PCR的结果可以用于不同的应用，如基因表达研究、病原体检测、遗传病诊断等。
通过定量PCR，可以准确测量目标序列的数量，并比较不同样品之间的差异。
总结一下，定量PCR通过扩增反应、检测荧光信号和标准曲线计算三个主要步骤来定量测量DNA或RNA分子的数量。
这种技术在许多生物学研究和医学诊断中发挥着重要作用。
定量pcr的技术原理
定量pcr的技术原理定量PCR（quantitative polymerase chain reaction）是一种用于DNA分子的定量分析技术。
它通过特定的引物和荧光探针来放大目标DNA序列，并结合荧光信号的强弱来确定初始DNA的数量。
其技术原理基于PCR（聚合酶链式反应）的基本步骤。
PCR 由三个主要步骤组成：变性、退火和延伸。
在定量PCR中，这些步骤与传统PCR相似，但引入了一种特殊荧光探针。
首先，通过热变性步骤将待测DNA样本的双链DNA分离为两个单链DNA。
接下来，将温度降低，使引物（由两个短DNA片段组成）与待测DNA序列上的特定区域结合。
这称为退火步骤，可选择性地将引物定位到目标序列。
然后，引物承担引导延伸的作用。
在延伸步骤中，通过添加DNA聚合酶酶和适当的碱基（dNTPs），引物沿待测DNA序列定向添加互补的碱基。
这样，每个引物在反应中逐渐延伸，生成新的DNA链，并将之前分离的双链DNA恢复成双链状态。
在定量PCR中的一个关键步骤是引入荧光探针。
这些荧光探针具有一个荧光染料和一个荧光猝灭器，其能力在其未结合目标序列时发出荧光信号。
在PCR过程中，当引物逐渐与目标序列结合并延伸时，荧光探针能特异性地与目标序列结合，导致荧光染料和荧光猝灭器之间的距离缩短，猝灭效应减弱，从而大大增加荧光信号的强度。
通过PCR反应进行若干循环，每一个循环都会使目标DNA序列的数量呈指数级增加，同时也会使荧光信号不断增强。
定量PCR的关键是要确定荧光信号的阈值，也就是荧光信号强度达到一个特定的临界值，被定义为测定阈值（Ct，Cycle threshold）。
Ct值与最初待测DNA的数量成反比，因此，Ct值越小，待测DNA的初始数量越多。
最后，通过与标准曲线比较Ct值，可以通过插值法确定待测样本中目标DNA的初始浓度。
定量PCR是一种快速、高效、灵敏且准确的DNA定量分析方法，广泛应用于基因表达研究、疾病诊断、病原体检测等领域。
1定量PCR基本原理
1定量PCR基本原理定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种利用DNA复制技术进行定量测定DNA数量的方法。
它是PCR技术的一种改进，在遗传学、疾病诊断、药物研发等领域有广泛应用。
以下是定量PCR的基本原理的详细介绍：1.反应体系组成：定量PCR所需的反应体系包括DNA模板、引物、荧光探针、聚合酶、缓冲液、dNTPs和MgCl2等组分。
DNA模板是待测DNA的起始材料，引物是用于扩增特定DNA片段的寡核苷酸引物，荧光探针则会结合到PCR产物上生成荧光信号用于检测和计量。
2.PCR扩增步骤：定量PCR扩增过程包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
首先，将反应体系加热至95°C，使DNA双链解开变性为两条单链。
然后，将温度降低至特定的温度，使引物能够与DNA靶序列结合。
引物结合后，聚合酶开始在两条单链DNA上合成新的DNA链。
这一过程称为延伸。
随着循环的进行，PCR产物的数量呈指数增加。
3.荧光信号检测：定量PCR中使用特定的荧光探针来检测扩增产物的数量。
这些荧光探针一般由两个部分组成：探针序列和荧光染料。
探针序列与待测DNA的靶序列互补配对，而荧光染料则位于探针的末端。
在PCR过程中，引物扩增到接近探针的位置时，3'末端荧光染料会与5'末端的荧光信号发生共振能量转移（FRET），从而发出荧光信号。
通过测量这些信号的强度，可以推断PCR产物的数量。
4.标准曲线和计量：为了进行定量测定，标准曲线是必不可少的。
标准曲线是一系列已知浓度的标准品所构建的，通过对标准品进行PCR扩增并测量荧光信号的强度，可以建立起PCR产物浓度与荧光强度之间的关系。
通过测量待测样品的荧光强度，并根据标准曲线进行插值计算，可以得出待测样品中特定DNA序列的浓度。
5.分析和解释结果：定量PCR的结果可以通过多种途径进行分析。
一种常见的方法是计算待测样品和标准样品之间的CT值差，通过该差值来比较两者的浓度。
定量pcr的名词解释
定量pcr的名词解释引言：随着科学技术的不断发展，分子生物学领域的研究取得了长足的进展。
其中，定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术作为一种用于快速、敏感和准确测定特定DNA序列数量的方法，成为了该领域中最重要的分子生物学工具之一。
本文将对定量PCR的原理、应用和优势进行阐述，并探讨其在医学、生态学和食品安全等领域中的重要性。
1. 定量PCR的原理定量PCR是基于传统PCR技术的基础上进行改进而成的，它通过不断倍增特定DNA序列来实现对目标DNA的定量测定。
相较于传统PCR，定量PCR引入了一种特殊的荧光探针，这种荧光探针可以结合到PCR反应体系中的目标DNA序列上，并释放出荧光信号。
2. 定量PCR的应用2.1在医学领域中的应用定量PCR技术在医学领域具有广泛的应用价值。
例如，在疾病的早期诊断中，可以利用定量PCR技术快速检测出少量的病原体DNA，从而提高疾病的准确性。
此外，在肿瘤学研究中，定量PCR技术也被用于检测肿瘤标志物的表达水平，既可以评估肿瘤的发展程度，又可以指导治疗方案的制定。
2.2在生态学研究中的应用定量PCR技术在生态学研究中的应用也越来越受到关注。
与传统的实验室方法相比，定量PCR技术可以更快速、准确地测定环境中某一种类的特定基因在不同时期的丰度变化，进一步研究生态系统的结构和功能。
这项技术在生物多样性保护和生态系统健康评估方面有着重要的推动作用。
2.3在食品安全中的应用食品安全一直是人们关注的焦点，定量PCR技术在食品安全中的应用也备受重视。
比如，生产商可以利用定量PCR技术检测食品中的病原微生物，从而确保食品质量的安全性；政府部门也可以通过定量PCR技术对食品中的农药残留、转基因成分和掺杂品等进行快速检测和准确测定。
3. 定量PCR的优势3.1 高度灵敏和快速相比传统的PCR技术，定量PCR具有更高的灵敏度和检测速度。
其可以在短时间内对样本进行高通量的定量检测，且能够有效避免由于实验误差带来的不确定性。
定量PCR基本原理
定量PCR基本原理定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于测定DNA样品中特定序列的数量的技术。
它是通过扩增目标DNA序列并将其与已知浓度的标准样品进行比较来实现的。
以下是定量PCR的基本原理。
1.反应组分准备：在定量PCR中，需要准备一系列的反应组分，包括DNA模板、引物、酶和缓冲液。
引物是专门设计用于扩增目标序列的短片段DNA，它们会在PCR反应中与DNA模板结合并使其扩增。
酶是一种聚合酶，用于将单链DNA合成为双链DNA。
缓冲液用于提供适当的pH和离子浓度，以维持PCR反应的稳定性。
2.PCR反应步骤：定量PCR通常包括三个主要的温度周期：变性、退火和扩增。
-变性：在初始变性步骤中，PCR反应体系中的DNA双链会被加热至95-98°C，使其解离为两条单链DNA。
这个步骤一般持续数秒至数分钟。
-退火：在退火步骤中，PCR反应体系中的温度会降低至45-68°C，这样引物就可以与DNA模板结合起来。
引物将寻找目标DNA序列中的互补序列，并结合在其上。
这个步骤一般持续数秒至数分钟。
-扩增：在扩增步骤中，PCR反应体系中的温度会升高至64-72°C。
聚合酶会结合到DNA模板上，并在引物指导下合成新的DNA链。
这个步骤一般持续数分钟至数小时。
3. 反应过程监测：定量PCR通常通过监测反应过程中累积的产物数量来确定目标序列的浓度。
有多种检测方法可供选择，包括荧光探针、SYBR Green染料和分子质量测定。
-荧光探针：荧光探针是由一个荧光染料和一个荧光猝灭器构成的DNA探针。
当荧光探针与目标序列结合时，它会在PCR反应中被降解并释放出荧光信号。
通过监测荧光信号的强度，可以确定目标序列的浓度。
- SYBR Green染料：SYBR Green是一种荧光染料，它可以结合到所有双链DNA上。
当SYBR Green与扩增产物结合时，它会发出荧光信号。
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定量PCR简介聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是微量核酸扩增的有效工具，由于其灵敏、特异、快速等优点，在医学上已广泛应用与病毒、细菌病原体及遗传病、肿瘤的早期诊断。
随着PCR技术的发展，特别是病毒或肿瘤的治疗监测、疾病的诊断、机体基因表达调控方面，不仅需要检测其存在是否；而且还需要得知扩增前标本中的模板的数量，因而必须对PCR进行定量检测，即定量PCR技术，本文将对定量PCR的定量原理、技术类型以及相关进展方面综述如下：一、定量PCR的基本原理：在PCR实验条件下（Mg++、缓冲液、Taq酶、dNTP、引物、模板），经变性→退火→延伸的一个循环，引物在退火阶段与相应的模板结合，在延伸阶段进行复制，此时产物为：Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n个PCR循环后PCR产物的分子数；Yn-1:为n-1个热循环后PCR产物的分子数；Ev:为扩增效率,0≤Ev≤1；若n个热循环中其Ev是一致的话，经n个循环后的扩增产物的分子数（Y）和反应物中原始分子数（X）之间关系，可描述为：Y=x×(1+ Ev)n。
1. 终点法定量原理：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同的前提下，根据扩增产物的量可以计数出反应物中原始分子数，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即：lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数)2. 实时检测法定量原理：在最佳实验、相同Ev以及相同扩增产物的情况下，反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即：LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)3. 扩增效率（Ev）的影响因素：以上所述的定量原理均假定反应体系中扩增效率是不变，但是，实际上，Ev在不同的扩增管之间和同一扩增管的不同循环次数之间是不同，如何控制及解决Ev的变异以及标本制备的可靠性是PCR定量的可靠性所在，也是定量PCR的发展方向，那么，Ev的影响因素有：a. 引物和靶序列的结合能力（G+C%及突变），扩增产物的长度，G+C含量。
b. 模板的含量、DNA聚合酶、反应液成分变化。
c. 不同临床标本间DNA聚合酶抑制物的存在情况。
d. 循环扩增仪上不同位置的差异。
二、定量PCR方法的分类：目前对标本的靶DNA或基因的相对或绝对含量是不同样品的PCR产量检测而推算出来，根据标本中是否加入内标物，将分成以下两种：（一）外标法定量PCR：一个已知含量的标准品（通常用质粒）经一系列的稀释后与待检标本一起进行扩增，制作PCR 扩增产物和靶核酸含量的标准曲线，根据待检标本的扩增产物量即可推算出靶核酸的绝对含量；上述已提及不同标本间的扩增效率（Ev）的差异，对样本间PCR产量作比较会产生很不准确的结果；以外还应考虑“平台效应”对结果的影响，因为“平台期”PCR产物量并不受初时模板量的影响；导致结果的准确性和重复性差，因此采用外标法应该注意：a、注意标准化操作，优化最佳实验条件，减少标本间Ev的差异导致对结果的影响。
b、标准品的稀释因存在随机分布而导致结果的不准确。
c、注意“平台效应”对实验结果的影响。
特别是后面提及的终点法检测PCR产物的方法中。
d、由PCR方法很灵敏，特别RT-PCR方法，没有内标存在的情况下，标本的污染而对实验结果产生很大的影响。
e、标本处理对结果的影响。
（二）内标法定量PCR：由于上述提及的外标法存在不同标本间的Ev差异和标本的提取（特别是RT-PCR）的微小变化都将导致扩增产物的巨大差异。
为了清除此种影响，国内外都推重采用内标法。
内标法是用PCR 技术进行准确定量的基础和今后的发展方向，根据采用内标品的不同，又分为非竞争内标定量PCR（quantitative PCR with noncompetitive intenal standands）和竞争定量PCR（competitive quantitative PCR）1、非竞争内标定量PCR从细胞类标本中提取靶基因（核酸）时，同时会提取大量与靶基因无关的DNA或RNA；可以把这些靶基因无关DNA或RNA作为内标与靶基因同步扩增，即在同样的反应条件下，在一个反应试管内同步扩增来自同一标本的一段靶基因序列和另一段无关的内标序列，不享受同一引物和引物结合位点，内标序列扩增可校正诸如DNA含量、标本内PCR聚合酶抑制物，不同反应管间扩增效率的差异，通过比较两种序列和内标序列的扩增产物即可对靶基因相对定量该方法目前主要用于检测靶基因在体内的含量前后变化，用于疾病的治疗检测。
这种方法应注意靶序列和内标序列的扩增效率差异和初始模板DNA含量比例关系和循环次数所导致的“平台效应”对结果的影响。
该法的主要优点是简便（不需构建内标品操作），可以消除反应管之间差异和一定程度上消除标本间变异。
2、竞争定量PCR（competitive quantitative PCR）竞争定量PCR是先构建一个与靶基因相同的扩增效率和引物结合位点仅探针结合位点不同的内标，在同一反应管内，靶基因和内标物和引物（primer）竞争性结合，进行同步扩增，由于竞争作用，当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物相对逐渐减少，但两种扩增产物的比值和两种初始状态时模板分子数的比值是一致的。
根据标准品的准确含量制作标准曲线，从而进行准确核酸定量。
由于内标品构建中特别要求是Ev与靶基因扩增效率一致，如果靶基因序列和内标相同，那么扩增过程中两者的实际扩增效率就接近一致，就可以对靶基因进行绝对定量，即确定样品中靶基因准确分子数，否则只能相对定量，即确定样本间靶基因分子数的差异，总体上说，加入内标物，消除PCR扩增过程中于反应管和反应管间以及标本之间存在差异。
因此，内标法是目前PCR定量方法中最准确的方法，但构建内标物是建立本方法的关键。
构建内标物的基本原则是内标物具有靶基因的相同扩增条件和相同扩增效率。
和可区别于靶基因探针结合位点与不干扰靶基因的扩增。
因此，理想的内标物应具备与靶基因序列待分析序列相同的引物结合位点，相似的或相同大小、相似的碱基排列顺序。
目前，内标法构建的方法有：靶基因扩增产物的突变；限制性片段的插入或缺失；含靶基因引物结合位点的非同源性DNA序列等，其中通过PCR方法构建的探针结合位点核苷酸直接突变构建的内标物是目前应用最多、最方便的方法。
三、PCR产物的检测与定量定量PCR检测靶基因核苷酸的含量最终是通过对其PCR产物的特异性检测和定量而推测算出来的，根据对PCR产物检测方式不同分为终点法（Terminal detection）和实时检测法(real time detection).(一) 终点检测法(Terminal detection）终点检测法就是PCR扩增反应结束后，对其产物进行分析和定量检测的一种方法，终点法检测要特别注意“平台效应”对实验结果的影响。
为了实现对PCR终产物的定量检测，必须对PCR产物进行预先标志。
目前标志物有：放射性同位素和非放射性标志物。
放射性同位素因放射性因素而目前很少用，后者包括螺旋结构染料（如溴化乙锭等）、地高辛、生物素以及荧光素（包括普通荧光素如Fam、TRAMA和镧系螯合物等），地高辛、生物素以及荧光素可以通过标志dNTP或引物的5’端从而掺入PCR扩增产物中，除荧光素标志产物可直接发光外，其余可与HRP或AKP 标志的抗地高辛抗体或亲和素反应，加入底物后产生颜色、发光或荧光信号，从而进行检测。
这些标志物进行标志的是检测时的捕获剂或是作为定量检测的指示剂；根据对PCR终产物的检测特异性不同又可分为：1. 琼脂电泳扫描检测法：PCR产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，用溴化乙锭进行染色然后进行扫描；预先用放射性标记的可进行放射自显影或特异性扩增琼脂片的放射性计数；预先荧光素标记核苷酸进行定量，DNA测序仪可克服琼脂电泳的序列非特异性检测问题，可用于内标和外标法检测，但是由于全自动DNA测序仪耗时及费用昂贵，目前仅限于实验室研究用。
2. 固相捕获法（solid phase capture）固相捕获法多数是利用亲和素或抗地高辛抗体包被聚丙烯酰胺微孔板或磁性小珠，利用亲和素和生物素或地高辛和抗地高辛抗体系统对预先标记生物素或地高辛的产物进行捕获然后与特异性标记的探针进行杂交或非特异性检测。
或是使生物素或地高辛化探针固相化，并与预先标记的PCR产物进行杂交，然后进行捕获信号显示，根据标记在探针或PCR产物终中的显示信号标志物的分分成不同的检测方法，如ELISA检测又称PCR-ELISA，电化学检测，电化学发光检测法，荧光检测法以及时间分辨荧光检测法，是目前终点法检测应用最方便的方法。
目前有三种设计模式：(1) 特异性捕获检测法（非探针杂交捕获）本法是非特异性检测PCR产物的一种方法，用生物素标记引物和地高辛标记duTP或用生物素和地高辛分别标记其引物。
经PCR扩增后，PCR产物中同时掺入了生物素和地高辛。
用生物素包被孔捕获PCR产物，用酶（AKP）标抗地高辛和产物反应，加底物显色进行定量，此法是非序列特异性检测，显色来自所有的扩增产物。
本法仅应用于非常特别的PCR扩增产物检测。
(2) 特异性探针捕获检测法由于PCR产物中存在非特异性扩增成分存在，用特异性探针能够特异性检测其PCR产物，提高方法特异性。
本法就是固相捕获、探针杂交相结合的一种特异性PCR产物检测方法，基本原理是用固相捕获分子和进行检测标记物分别位于不同核苷酸链上，通过核苷酸链相互杂交，靶两标记物结合在一起，其余方法同非特异性捕获法。
根据其固相捕获的方式不同，又分为固相捕获探针法、固相扩增产物法，前者就是通过生物素和亲和素系统把特异性探针结合在固相上（即固相化探针），与预先标记的PCR产物进行杂交，然后一系列反应后进行定量检测。
而后者就是生物素标记的PCR产物通过与预先包被在微孔板上亲和素反应而进行捕获，与地高辛标记探针杂交，标记抗地高辛抗体反应，加底物显色后呈色而进行定量检测。
3. HPLC检测法本法为非特异性PCR产物检测法，PCR产物直接上2.5μm离子交换柱分离后，用紫外检测器进行检测。
本法灵敏度可达fg水平，还可以用于长度不同的内标物检测，而且初始模板数和PCR 产物峰面积之间具有良好的线性关系。
（二）实时检测法实时检测法就是在PCR扩增的每一个循环后分别检测其PCR产量，借助计算机数据处理，可以描绘出PCR扩增循环过程中PCR产物变化曲线。
根据PCR 变化曲线计算出未标靶基因分子数。
由于实时检测，克服终点法检测过程中“平台效应”对结果的影响；实时检测仍然存在反应管之间和标本之间的扩增效率（Ev）的微小差异，导致结果的很大差异，故最好应用内标法进行较正。