Westernblot一、实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的
Westernblot法检测大鼠肝组织清蛋白的表达实验
蛋白质的分离与电泳
蛋白质的分离与电泳是Westernblot法的关键步骤之一。通过电泳，将复杂的蛋白质混合物根据分子量大小进行分离，以便 后续的转膜和检测。
常用的电泳方法包括SDS-PAGE和Native-PAGE，前者利用SDS将蛋白质变性并带负电荷，根据分子量大小分离；后者则在不改变 蛋白质天然电荷和形状的情况下进行分离。
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详细描述
实验结果表明，清蛋白在正常大鼠肝组织中高表达， 而在肝损伤大鼠肝组织中表达量明显降低。这可能是 因为清蛋白合成减少或降解增加导致其在肝损伤大鼠 肝组织中的表达量降低。此外，我们还发现清蛋白表 达量与肝组织病变程度呈负相关，这提示清蛋白可能 对肝组织的保护作用。因此，我们推测清蛋白可能通 过某种机制参与了肝组织的保护作用，具体机制需要 进一步研究。
处理肝组织样本
将肝组织样本进行匀浆处理，以充分破碎细胞，释放出细胞内的清蛋白。
蛋白质的提取与定量
蛋白质提取
利用细胞裂解液将处理后的肝组 织样本中的蛋白质提取出来。
蛋白质定量
利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对 提取出的蛋白质进行定量，以确 保后续实验的准确性。
电泳与转膜
电泳
将提取出的蛋白质进行SDS-PAGE电泳分 离，以便将不同大小的蛋白质分开。
荧光染料等）。
通过免疫杂交，目标蛋白质与特异性抗体结合，形成 复合物。
显色反应是利用标记物催化底物生成有色产物，从而 在膜上显示出目标蛋白质的位置和量。常见的显色反
应包括酶促反应和化学发光反应。
03
实验步骤
肝组织样本的收集与处理
收集大鼠肝组织样本
在实验动物大鼠处死后，迅速取出肝组织，并立即放入液氮中冷冻保存。
western blot原理
western blot原理
Western Blot是一种常用的分子生物学实验技术，旨在检测和
分离特定蛋白质的方法。
该技术基于蛋白质的分子量差异和亲和性分离效应。
首先，蛋白质样品需要经过电泳分离，通常是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离。
SDS-PAGE中，样品中的
蛋白质会被不带电的SDS包膜所覆盖，使得蛋白质带有负电荷。
之后，这些带有负电荷的蛋白质会被电场引力依据其分子量大小而迁移，从而在聚丙烯酰胺凝胶上分离得到。
然后，将经过分离的蛋白质转移到一个膜上，通常是聚乙烯二醇或聚维尼尔丙烯酰胺膜。
这个过程被称为电转移。
转移到膜上的蛋白质保持了相同的排列方式，以便进行后续的检测。
接下来，膜被孔隙充满的非特异性蛋白质、胶原蛋白等阻塞物浸泡，以防止非特异性的蛋白质与特定抗体非特异地结合。
在这之后，将特定的一抗（一种针对感兴趣蛋白质的抗体）加入膜上与特定的蛋白质结合形成复合物。
经过洗涤，使非特异性抗体被彻底洗除。
为了检测复合物，通常需要给予一抗一个标记。
通常使用放射性同位素（如^125I），酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记剂。
标记剂的选择取决于进一步检测的方法。
最后，利用放射活性计数器、酶连显色法或荧光显微镜等设备
对膜进行成像，可量化检测特定的蛋白质。
总之，Western Blot技术利用蛋白质的分子量差异和亲和性分离效应，将蛋白质分离、转移到膜上、与特定抗体结合，并通过标记剂检测来获得特定蛋白质的信息。
这是一种广泛应用于生物学研究中的分析工具。
蛋白质印迹法westernblot应用介绍
定量Western Blot技术
定量Western Blot技术能够准确定量蛋白质的表达水平，为比较不同样品之间的蛋白质表达差异提供 了可靠的工具。
该技术采用了同位素标记、荧光染料标记等方法，通过与标准品进行比较，计算出蛋白质的相对表达量。
该技术的应用范围广泛，包括药物靶点筛选、疾病标志物 发现、蛋白质相互作用研究等领域。
Western Blot与其他蛋白质分析技术的联用
Western Blot可以与其他蛋白质分析技术联用，如质 谱技术、免疫共沉淀等，以获得更全面的蛋白质信息。
通过将Western Blot与质谱技术联用，可以获得蛋白 质的氨基酸序列和修饰信息，有助于深入了解蛋白质
缺点
操作繁琐、耗时长、成本较高、对实验条件和操作技能要求较高。
02 Western Blot在科研中 的应用
验证抗体特异性
抗体特异性验证
通过Western Blot，可以验证抗体的 特异性，确保抗体只针对目标蛋白进 行反应，而不与其他非目标蛋白发生 交叉反应。
抗体稀释度测试
通过Western Blot，可以测试抗体的最 佳稀释度，以获得最佳的检测效果。
定量Western Blot技术的应用范围广泛，包括生物标志物发现、药物作用机制研究、疾病发病机制研究 等领域。
蛋白质组学与Western Blot的结合应用
蛋白质组学与Western Blot的结合应用能够实现大规模蛋 白质组学研究与特异性蛋白质检测的有机结合。
通过将Western Blot技术与蛋白质组学技术相结合，可以 同时获得蛋白质的特异性和丰度信息，为深入了解蛋白质 的功能和作用机制提供有力支持。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
1. 引言1.1 概述Western blot技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于检测、定量和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达和相互作用。
它具有高灵敏度、高特异性和较为准确的测量能力，因此在医学科研领域中得到广泛应用。
1.2 文章结构本文将详细介绍Western blot技术的原理、方法、注意事项以及在医学科研中的应用。
首先，我们将阐述免疫检测原理、蛋白质分离与转移原理以及免疫染色与检测原理，帮助读者全面了解该技术的基本原理。
其次，我们将描述样品制备与电泳条件设置、蛋白质转移与固定方法以及免疫染色及可视化方法，为读者提供详细的实验步骤。
随后，我们将介绍实验室操作要求及安全措施、样品处理和保存注意事项以及技术参数调整和结果解读注意事项，以保证实验的准确性和可重复性。
最后，在医学科研领域中的应用方面，我们将以蛋白质表达水平检测、蛋白质亚细胞定位分析以及蛋白质相互作用和功能分析为例，展示Western blot技术在疾病诊断和药物研发等方面的重要应用。
1.3 目的本文的目的是为读者提供对Western blot技术全面了解，并指导其在医学科研中正确应用该技术。
通过详细介绍该技术的原理、方法和注意事项，读者将能够准确地进行实验操作并正确解读结果，同时也能够认识到其在医学科研中的重要性和广泛应用价值。
2. Western blot技术原理2.1 免疫检测原理Western blot技术是一种常用于检测特定蛋白质的免疫学方法。
它基于抗原与抗体的特异性结合关系，通过将蛋白质溶液经过电泳分离、转移到固体载体上，并使用特异性抗体识别目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质的定性和定量检测。
在Western blot中，首先需要将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。
然后，通过将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶或其他固体载体上，在固相载体上形成一个被称为“Western blotting”的蛋白质模式。
western blot 显影原理
Western blot 显影原理引言Western blot 是一种广泛应用于分子生物学和生物化学研究中的实验技术，用于检测和定量特定蛋白质在复杂混合物中的存在和表达水平。
Western blot 显影是Western blot 实验的最后一步，通过显影剂的作用使蛋白质在凝胶上形成暗色带，以便于检测和分析。
显影原理Western blot 显影的基本原理是在蛋白质与检测抗体相互作用后，使用一种或多种显影剂使特定蛋白质形成可视化的暗色带。
显影剂可转化底物（比如酶）的活性，产生可见的信号。
显影步骤Western blot 显影通常包括以下几个步骤：1. 目标蛋白质与一级抗体结合在 Western blot 实验中，目标蛋白质首先与特异性一级抗体结合。
一级抗体通常是一只针对目标蛋白质的多克隆或单克隆抗体。
结合主要通过特异性的抗原-抗体相互作用实现。
2. 二级抗体结合一级抗体结合后，其未结合的部分会被洗去，然后添加特异性的二级抗体。
二级抗体是针对一级抗体的抗体，通常与酶（比如辣根过氧化物酶）或荧光物质标记。
二级抗体结合到一级抗体上，形成特异性的免疫复合物。
3. 添加显影剂在二级抗体结合后，显影剂被添加到免疫复合物上。
显影剂能与酶或荧光物质相互作用，发出可见的信号。
常用的显影剂有辣根过氧化物酶底物（TMB）、硝基蓝酶底物（NBT）和碱性磷酸酶底物BCIP。
4. 显影反应停止在蛋白质形成暗色带后，必须停止显影反应以防止进一步信号产生。
停止反应的方法通常是在显影溶液中添加酸、酒精或其他特定化合物。
这能够立即停止底物-酶反应，使免疫反应停止。
显影剂的选择选择适当的显影剂对 Western blot 的成功至关重要。
以下是一些常用的显影剂及其特点：1. 辣根过氧化物酶底物 (TMB)•TMB 是一种常用的显影剂，适用于辣根过氧化物酶标记的二级抗体。
•TMB 显影产生蓝色信号，可以通过观察暗色带的强度来定量蛋白质的表达水平。
Westernblot一、实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的
Western blot一、实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法。
二、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
三、操作步骤（一）样品处理1培养的细胞：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷ 12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
或收取细胞于EP管中加入适量的1×SDS，吹匀，100度5min,重复一次。
1200rpm ,10min.取上清定量。
3．组织：⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml 裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵ 12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。
对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交⽅法类似，但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。
经过PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基⼄醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：⽢氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容⾄1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O⾄1000 ml。
5. 膜染⾊液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；⼄酸2 ml；ddH2O118 ml。
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Western blot实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法。
原理与Southern 或Northern 杂交方法类似，但Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
三、操作步骤（一）样品处理1 培养的细胞：⑴ 去培养液后用温的PBS 冲洗2~3 遍（冷的PBS 有可能使细胞脱落）。
⑵ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶ 用细胞刮刮下细胞，收集在EP 管后超声（100~200w）3s，2 次。
⑷ 12000g 离心，4℃，2min。
⑸ 取少量上清进行定量。
⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2 天，每次上样前98℃，3min。
或收取细胞于EP 管中加入适量的1×SDS，吹匀，100 度5min,重复一次。
1200rpm ,10min.取上清定量。
3．组织：⑴ 匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg 加1ml 裂解液，肺100~200mg 加1ml 裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵ 12000g 离心，4℃，2min。
⑶ 取少量上清进行定量。
⑷ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。
提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM 及NaF 25mM）。
1×loading buffer配方：10% 甘油，50mM Tris ·Cl （pH6.8），2% β-巯基乙醇，0.2~0.5 ‰ 溴酚蓝，2%或5%的SDS。
Buffer 可配成2×~5×，注意SDS 终浓度勿超过10%。
对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。
）二）配胶1.注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O 冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP 及TEMED 外），过滤后作为储存液避光存放于4 ℃，可至少存放1 个月，临用前取出室温平衡加入10%AP 及TEMED.2.封胶：灌入2/3 的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10% 时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。
封胶后切记，勿动。
本实验室一般用水或异丙醇封胶。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O 冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS ，目的是通过降低张力清除残留水滴。
片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。
3.封好浓缩胶后1h 拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。
拨出梳子后用ddH2O 冲洗胶孔两遍以去除残胶即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
（10%的AP 最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。
30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉.）各种分离胶三)电泳1．上样前将胶板下的气泡赶走。
2．在需要的地方加入marker (Fermentas)3ul,所有蛋白样品调至等浓度后上样或上等量的蛋白，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer 上样，Marker 也用1×loading buffer 调整至与样品等体积。
2．以初始电压为100V 强度进行电泳，当marker 分开后换用150V 至距胶下缘1cm 以上结束。
1．电泳结束前10 min 戴上手套开始准备：浸泡NC 膜：将NC 膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。
PVDF 膜则在M-OH 中浸泡20min 以上后转入转移液中。
将滤纸也浸入转移液中。
2．取胶：将胶卸下，保留30-100KD 或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。
注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）3．转膜：湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入转膜液。
将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。
降温，将电泳槽置于冰水混合物中。
100 伏80min 左右，注意不同蛋白的要求不同。
干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2 凝胶面积转移1-2h。
负载电压不宜超过1V/cm2 胶面积。
（五）封闭5%脱脂奶，室温1h。
（六）免疫反应1用TBST洗膜×3/5min.2加入一抗，4℃ 放置12hr 以上。
3弃一抗，用TBST 洗膜×34加入辣根过氧化物酶偶联的二抗平稳摇动，室温1h。
弃二抗，用TBST 洗膜×3/5min.（七）显色现常用的有底物化学发光ECL 和底物DAB 呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
本实验室用FUJI 仪器进行扫描膜（具体见仪器使用说明）四、主要试剂1、烯酰胺和N，N'-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N ，N'-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH 不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O 去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液: 1.5mol/LTris-HCL(pH8.8):18.17gTris 、水75ml再加HCL 至pH8.8，加水稀释到100ml 终体积。
4、浓缩胶缓冲液: 1mol/LTris-HCL(pH6.8):12.11gTris 溶于75mlH2O 中，用HCL 调至pH6.8 加水稀释到100ml 终体积。
这两种缓冲液必须使用Tris 碱制备，再用HCL 调节PH 值，而不用Tris.CL。
5、TEMED 原溶液：实验室有商品化的可直接用。
6、2 ×SDS 加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris 缓冲液8ml ，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml 混匀备用。
按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min 混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g 甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L 甘氨酸电极缓冲液。
临用前稀释10 倍。
8、转移缓冲液：配制1L 转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml 甲醇，加水至总量1L。
或10×转膜液：Tris 碱30.28，甘氨酸150.14 至800ml.9、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10 倍即成丽春红S使用液。
使用后应予以废弃。
10、脱脂奶粉5%(w/v) 。
11、BST20mmol/LTris/HCL(pH7.5) ，500mmol/NACL.Tween 按1：1000 加入。
12、过化物酶标记的二抗。
五．常见问题1.如何选择最合适的蛋白杂交膜？解答：蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。
选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。
根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。
硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。
在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。
在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。
因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
但是膜孔径如果小于0.1mm，蛋白的转移就很难进行了。
因此，我们通常用0.45 μm和0.2μm两种规格的硝酸纤维素膜。
大于20kD的蛋白就可以用0.45 μm的膜，小于20kD 的蛋白就要用0.2 μm的膜了，如果用0.45 μm的膜就会发生“Blowthro μg的h”现象。
从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。
硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素，因而降低了蛋白的结合量。
S&S 公司采用的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150μg/cm2。
由于100%的纯度，因而也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。
其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。
常规的硝酸纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用。
PVDF 转移膜：PVDF 是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。
PVDF 膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为硝酸纤维素膜在Edman 试剂中会降解，所以就寻找了PDVF 作为替代品，虽然PDVF 膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。