发育生物学——发育生物学研究技术

Transgenic technique
1) 将外源基因注射到受 精卵的细胞核中， 缺点 是无法控制外源基因的 插入情况， 只能通过后 代检查DNA。 2) 将外源基因转化到ES 中，同gene knockout 3) 小鼠杂交。
发育遗传学技术
• 反向遗传学技术：
通过抑制性因子抑制目的基因的功能
示踪基因：GFP和LacZ基因
染料细胞标记
荧光细胞标记
细胞移植
DNA/蛋白芯片
目的：高通量筛选不同胚胎细胞或组织中基因/
蛋白表达图谱，获得不同时期或组织差异表达的 基因或蛋白。
分类：
• DNA chip • Protein chip • microRNA chip
应用DNA microarrays 研究基因表达
插入诱变筛选
利用转座子(transposon)或病 毒载体做诱变剂。果蝇中为P-因 子，可以随即插入基因组中，并 可以在基因组中移动，包括特殊 序列和转座酶，后代生殖细胞中 ，转座酶就会诱导P-因子在基因 中随即转座造成基因突变。
突变基因的克隆
突变体获得后，克隆引起该突变的基因
• 插入突变：利用P-因子序列作为探针，从突变体目的：观察胚胎的内部组织学结构
分类：
• 石蜡组织切片：石蜡包埋，切片机切片 • 冷冻切片：低温包埋剂包埋，低温切片机切片，对样 品中核酸的保存较好，但切片的质量差。
分子生物学技术
目的：检测目的基因或蛋白质在某一发育 时期或特定组织中的表达 分类：
• Polymerase chain reaction (PCR): DNA amplification • Real-time quantitative PCR: RNA 定量
DNA插入诱变法
由含 GFP 基因的反转录病毒插入引起突变
正常胚胎 突变胚胎
X 基因
GFP 基因
完整的 X 基因使胚胎正常发育
X 基因被 GFP 基因破坏后胚胎异常发育
DNA插入诱变法
反转录病毒插入引起的突变的鉴定
病毒注射 F0 WT
F1
F2
大规模诱变筛选
突变后的表型改变： • 致死性 • 功能丧失：最常见。突变后的蛋白质比野生 型活性差；某一蛋白质完全失活的突变为无效 突变 (null mutation) • 功能获得：如某些受体突变后活化
胚胎细胞中，如运用细胞标记技术对胚胎早期卵 裂球分化命运图谱的研究。在小鼠和果蝇中常用 于转基因分析。
细胞标记物分类：
早期：活体染料如尼罗蓝或中性红，不能标记胚胎内部组织 现在：细胞外-亲脂性荧光染料如DiI/Dio，不适于组织切片
细胞内-荧光标记葡聚糖和HRP，需显微注射，通过荧光 显微镜或组织化学方法进行定位。
基因类型？ 影响途径？ 底物？
影响器官？ 胞内分布及靶位？
空间结构？
发育遗传学技术
发育生物学基本任务之一：
研究基因在胚胎发育中的作用
• 正向遗传学技术：大规模随机诱变，产生发育 异常的突变个体，然后再寻找突变的基因。 1. 大规模诱变筛选; 2. 插入诱变筛选;
3. 突变基因的克隆;
从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因
分类：
•
光学(optical)显微镜:
•
•
体视显微镜: 组织分离用
荧光显微镜：
显微镜技术
激光共聚焦显微镜 (laser confocal)：荧光标记，对 胚胎或细胞中的特定蛋白质或mRNA的分布进行定性 或定量研究；图像采集的效果很好；细胞或组织的三 维重塑 (reconstructing)
组织切片技术
中筛选出含P-因子的克隆，从而确定其插入点及被阻断
的基因。 • 化学诱变或射线突变：定位克隆 (positional cloning)—根据目的基因在染色体上的位置进行基因分 离的。通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来 确定突变基因的染色体位置。常用的分子标记包括单核 苷酸多态性 (SNPs)。
Dectection: autoradiography, fluorescence microscope, enzyme-substrate reaction
原位探测基因表达
原位探测基因表达
Distribution of mRNA for the growth factor Vg-1 in the amphibian egg. In situ hybridization with a radioactive probe. (yellow signals)
发育生物学研究技术
常用发育生物学研究技术简介
• 显微镜技术 (成像imaging); • 组织切片技术 (经典解剖形态学morphology);
• 生化分子生物学;
• 原位杂交技术 (in situ hybridization);
• 显微注射;
• 报告基因技术;
• 细胞标记技术;
显微镜技术
目的：观察胚胎个体
发育遗传学技术
• 反向遗传学技术：
其它手段：
1. 显性抑制 (dominant negative): 通过过量表达显性抑制 型蛋白 (是通过某种修饰或加工，可以抑制野生型蛋白功能 的缺陷型蛋白) 以阻断内源蛋白的活性，研究其功能的方法 。如将某些信号传导受体的膜内区域缺失等。
2. 基因捕获 (gene trap) 与增强子捕获 (enhancer trap):
或功能获得 (gain of function) 实验，研究胚胎个
体所产生的表型而分析目的基因的功能。
基因修饰
1. 基因敲除;
2. 条件基因敲除;
3. 转基因;
Constructing knockout mice
获得携带有特定基因 突变个体的技术，研 究基因在发育中功能 的重要方法。 1) 构建用于基因重 组的突变基因结构 2) 重组基因导入胚 胎干细胞 (ES) 3) 注射ES入胚胎中 以获得杂合性小鼠 4) 小鼠杂交获得纯 合体小鼠并进行表型 分析。
自发突变 (spontaneous mutation)
Recessive mutation (纯合体状态) /Dominant (杂合体状态) /semidominant
自发突变 (spontaneouse mutation)
semi-dominant mutation (半显性突变)
从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因
GFP pA
利用大分子间的相互作用克隆新的基因
利用DNA与蛋白质间的相互作用
鉴定可与蛋白质结合的DNA序列 分离靶蛋白质，（可采用gel-shift assay) 克隆靶蛋白的表达基因。
分离时空特异性表达基因的方法 利用蛋白质之间的相互作用
酵 母 双 杂 交 法
显微注射及细胞标记技术 目的：将外源DNA、RNA或标记物等导入早期
常用报道基因分类：
• 绿色荧光蛋白 (GFP): 分布用荧光显微镜观察 • lacZ基因: 编码 β-半乳糖苷酶, 用特异底物显色研究其产物分布 • 荧光素酶 (luciferase): 常用体外基因表达活性分析，近年开始 体内研究
启动子活性检测法 表达载体的构建：Promoter/enhancers
• RT-PCR/Northern blotting: mRNA expression
• Western blotting: protein expression • 免疫共沉淀 (Co-IP): protein-protein interaction
Northern Blotting Analysis
从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因
获得突变体的方法
自然群体中的突变体； 化学诱变剂处理，如亚硝基－乙脲－乙亚硝基脲
(N-nitroso-N-ethylurea ethylnitrosourea, ENU)；
外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、转座
子利用等；
X－射线或 r－射线照射
化学诱变法
斑马鱼上ENU化学突变研究的成就(1996)
德国 Tubingen 美国 Harvard 初选突变体总数 保存的突变体总数 已确认的不同基因数 4264 1163 372 2383 695 220
大规模诱变筛选
通过射线或化学 诱变剂处理父本 个体，在其生殖 系细胞中产生随 机突变，然后与 wild-type母本个 体杂交，F1个体 中可能携带有基 因突变。F1与野 生型，F2 (50% 杂合突变体)群体 内杂交，F3 (25%)可出现纯 合突变个体，发 育异常
原位探测基因表达
mRNA的检测
利用原位杂交技术研究基因表达的时空谱
FISH 探测基因表达
报道基因 (reporter gene) 技术
目的：用于启动子/增强子的分析研究。采用一些产
物易于检测的基因(报道基因)与待研究的表达调控序列 串联，通过转基因技术导入胚胎体内，分析报道基因产 物的表达来研究目的片断的转录调节活性。
是一种报道基因转基因技术，用于获得在某些组织中特异性 表达的基因。如报道基因转入体内，如附近有内源性增强子 ，就可启动报道基因的启动子激活。
Gene expressing guiding development
When and where particular genes are active Intact embryos or sections of embryos
In situ hybrid: probesradioactive isotope, fluorescence tag or an enzyme
1. RNA干扰;
2. 吗啉代寡聚核苷酸 (MO): 利用反义寡聚核苷
酸抑制特定mRNA (5’-UTR) 的翻译而阻断目的基
因功能的方法。主要应用在斑马鱼和爪蟾研究中，