DNA ladder实验步骤
凋亡DNA Ladder快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书
凋亡DNA Ladder快速提取试剂盒目录号：DN16目录编号包装单位DN1601 20次DN1602 50次适用范围：适用于快速提取凋亡DNA Ladder试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存20次50次裂解/结合液CB 室温 6 ml 15 ml漂洗液WB 室温6 ml 15 ml第一次使用前按说明加指定量乙醇洗脱缓冲液EB 室温15ml 15 ml吸附柱AC 室温20个50个收集管（2ml）室温20个50个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:1.裂解/结合液CB低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：细胞发生凋亡时，染色质DNA在核小体之间发生断裂，最终形成200bp整数倍的DNA片段，这些DNA片段被提取后，经电泳及溴化乙锭染色后形成梯子状外观，谓之DNA Ladder。
血液和组织培养细胞在裂解/结合液中裂解后，释放出来的DNA片段在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将DNA Ladder 片段从硅基质膜上洗脱。
产品特点：1.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
2.本公司独有的裂解/结合液配方有效裂解细胞，使用本试剂盒不需要加入昂贵的蛋白酶K处理，大大降低了使用成本和加快了处理速度。
3.节省时间，简捷，单个样品操作一般可在10分钟内完成。
注意事项1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。
3.裂解/结合液CB含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。
生物化学与分子生物学实验：实验十 聚合酶链式反应(PCR)及酶切鉴定转化产物
2.9 变性温度和时间
模板DNA充分变性是PCR顺利进行的前提。
在PCR扩增开始的第一次变性时， 应给予足够的时间 和温度，使基因组DNA充分变性。
对于扩增哺乳动物基因组中单拷贝序列，模板DNA的 加入量一般为0.2-2μg。
对于质粒DNA模板只需要20ng。模板量过多，会增加 非特异性扩增机会。
2.7 Mg2+浓度：
Mg2+是维持Taq DNA聚合酶活性所必需的，还影响 DNA的Tm值、产物的特异性及引物二聚体的形成
Mg2+浓度过低时，酶活性显著降低，使产量降低； 过高时，易生成非特异性扩增产物。
产量降低，过高则导致非特异性扩增。
2.5 耐热DNA聚合酶
通常Taq DNA聚合酶用量为0.5-5U/100μl，酶量过
大会导致非特异产物的增加；
传统使用的Taq DNA聚合酶的一个致命缺点是不具
备 3′→5′校正外切酶活性，错配率高。
大约每聚合9000个核苷酸发生一次错误掺入，经过 约 20 个 循 环 后 ， 扩 增 产 物 中 随 机 突 变 率 大 致 为 1/400-1/900，
目前，限制性内切酶被广泛运用于基因分子克隆技术 中，是体外剪切DNA 片段的主要工具。
由于外源DNA 片段插入质粒中，是在两个限制性内切 酶酶切位点中进行的，因此，可以使用单酶切或双酶 切手段对转化筛选得到的重组子进行鉴定。
三、实验材料
微量移液器，硅烷化的PCR管，PCR仪，琼脂 糖凝胶电泳所需设备，台式离心机，凝胶 成像仪，制冰机以及塑料离心管、枪头等。
《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验
《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验【实验目的】1、掌握实用的分子生物学基本操作技术；2、提高处理DNA样品的操作技能；3、学会使用限制性内切酶对DNA样品进行酶切；4、学会配制琼脂糖凝胶；5、学会使用电泳技术分析和鉴定DNA分子。
【实验原理】1、质粒DNA的限制性酶切DNA的酶法操作是DNA重组技术中一项最常用的工具。
特别是一系列限制性内切核酸酶的使用，能够在特异性位点切割DNA，对从分子水平上认识基因的结构与功能和进行重组DNA技术研究是非常有用的。
限制性内切酶来源于细菌，能够在特异性的目标序列中（即限制性酶切位点）切割双链DNA，从而产生特定的DNA片段（即限制性酶切片段）。
内切酶是细菌限制与修饰体系中的一员，能够使细菌细胞免受外源性DNA的侵害，即通过切割噬菌体DNA中的特异性位点来限制细菌噬菌体的繁殖，从而抑制噬菌体对细菌细胞内的入侵。
细菌通过修饰限制酶的识别位点来防止限制酶破坏其自身的DNA，通常是利用对识别位点中1个碱基的甲基化修饰来实现的。
历年来，从细菌细胞内分离纯化的限制性内切酶的种类在不断增加，并越来越多的被分子生物学家应用到DNA的体外操作中。
每种限制酶都能识别1段特异的DNA序列，其中最常见的是长度为4-6 bp的回文序列（反向重复序列）。
同时，不同种类的限制酶在识别的切割位点是不同的，有些可能是在识别位点的中间切开，产生平末端（钝末端）；而另一些限制酶可能是将识别位点错位切开，生成5’或3’突出末端（黏性末端）。
表2列举了本实验中所使用的2种限制酶的识别位点和切割位点。
表2 2种限制酶的识别位点和切割位点注：↓或↑：表示酶切位点。
2、DNA限制性内切酶酶切图谱（1）图谱简介DNA限制性内切酶酶切图谱，又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。
在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）技术更是建立在它的基础上。
PH0017 DL2000 DNA ladder (100-2000bp)操作手册
PH0017|DL2000DNA ladder(100-2000bp)Catalog No：PH0017Size：☐100T(2×250μl)Storage：Store@-20℃◆简介本DL2000是由6条带状双链DNA条带组成，适用于琼脂糖凝胶电泳中DNA条带的分析。
DL2000中已含有1×loading buffer，可根据实验需要，直接取2-5μl电泳，使用方便，电泳图像清晰。
6条带的大小分别为100，250，500，750，1000，2000bp。
其中750bp条带为100ng/5μl，显示加亮带，其余条带浓度50ng/5μl。
◆保存4℃保存，有效期6个月（长期保存置于-20℃）◆使用参考1.取2-5μl DL2000加入到琼脂糖凝胶的加样孔中就行电泳。
【注】根据梳子的厚度和宽度进行上样。
每1mm×1mm（厚度×宽度）加样孔上样1μl。
窄齿梳子（一般为1mm×2mm）上样2μl；宽齿梳子（一般为1mm×5mm）上样5μl。
如果使用厚齿梳子或宽于5mm的梳子，可以适当调整上样量。
2.建议电泳条件：凝胶浓度为1.5-2.0％，凝胶长度5-7cm，电泳电压4-10v/cm，电泳时间15-20分钟。
3.通过EB染色后紫外灯下观察条带。
【注】如果使用Goldview等染料就行染色，由于灵敏度比EB低，请酌情增加Marker的上样量。
◆注意事项1.琼脂糖的质量对DNA的电泳有很大影响，电泳时请尽量使用质量优等的琼脂糖。
2.请使用新鲜配制的电泳缓冲液和新鲜配制的琼脂糖凝胶进行电泳，以保证Marker良好的分离效果。
3.该Marker适用于DNA片段大小的确定和对DNA含量的精确定量。
----------------------------------2％琼脂糖凝胶电泳图梳子尺寸：1mm×5mm上样量：5μl凝胶长度：5cm电泳电压：8v/cm缓冲液：0.5×TBE电泳时间：20分钟。
DNA LADDER检测细胞凋亡的讨论
DNA LADDER检测细胞凋亡的讨论例一gongyulai：我用的是药物诱导癌细胞凋亡，做DNA Ladder（用的是北京鼎国的动物细胞凋亡梯子提取试剂盒）。
跑出来的电泳不是一条条带，而是每条很长的拖尾现象，Marker到是出来了。
我是按说明书上0。
8%的琼脂糖。
我用的是60v电压。
不知道什么原因？郁闷。
说明书上说混合温和是什么意思，我又没用力摇。
我还想问收集凋亡细胞时离心时转速多少比较好？chujun_hust：（1）“跑出来的电泳不是一条条带，而是每条很长的拖尾现象”：可能是由于你点样时，时间太长了，导致样品扩散；还有一个原因是你设置的电压太高，最好是2~4v/cm，跑4～6小时比较合适（2）“我是按说明书上0。
8%的琼脂糖”：凝胶浓度太低了，把凝胶浓度加大到2％，放心做，没问题的（3）“说明书上说混合温和”：那是怕你混匀太剧烈导致细胞基因组DNA断裂啊，注意很轻轻的混匀（4）“收集凋亡细胞时离心时转速”：我在实验室中是5000rpm，离心5min，我觉得足已mmyycc：我的ladder总是只有一条带，与对照组差别不大，用的是100v,1-1.5h,不知道是不是这个原因？溴酚兰跑到什么位置合适呢？chujun_hust：电压设置太高了啊，溴酚兰一般跑到蓝色离胶顶2cm左右吧。
附上我刚刚做的DNA LADDER图象，我用的不是试剂盒，是按照《细胞实验指南》上做的，效果不错啊具体见：/bbs/post/view?bid=66&id=495351&sty=1&tpg=1&ppg=2&age=0#518411lwk2003：请问做DNA LADDER时选择处理后细胞多长时间就可以提取细胞DNA比较合适？我看有的文献是处理细胞3天后提取DNA的，是不是时间太长了？gongyulai：我觉的根据不同情况吧。
如果我是同一浓度不同时间测和不同浓度同一时间应该不一样的。
【生化实验】DNA提取与电泳
• 4. 加样：在点样板上混合DNA样品和上样缓冲液（上样缓冲液的最 终稀释倍数应不小于1×），然后加入胶板的样品小槽内。在样品 一侧的样品小槽中加入分子质量标准（DNA Ladder）。注意加样前 要先记下加样的顺序，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防 污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
• 3.灌胶：待凝胶冷却至60℃左右加入溴化乙啶 (终浓度0.5μg/mL)， 混匀后小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃 板表面形成均匀胶层（应注意胶面平整，无气泡），室温下冷却凝 固。待完全凝固后，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入 电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液使之高出胶面1～3mm。
• 5. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压100V，样品由负 极（黑色）向正极（红色）方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板下 沿约1cm处时，停止电泳。
• 6. 观察照相：电泳完毕后，取出凝胶(戴手套)，紫外灯下观察， DNA存在则显示出桔红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。
实验一
组织细胞中基因组DNA的提取பைடு நூலகம்
实验二 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段
（水平潜水式）
实验一 原理
样品研磨或者匀浆后加入细胞核裂解液， 1、首先在强去污剂或者和蛋白酶K协同下裂解细
胞释放出基因组DNA； 2、接着加入RNase A去除RNA； 3、然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白； 4、最后纯净的DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于
9、加入100μl 溶解液，EP管做好标记，冰箱-20℃保存至下周。
操作步骤 二（接上周实验）
1、DNA溶液放置在65℃温育20min，中间不时轻弹管壁帮 助重新水化DNA；
实验二 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段（水 平潜水式）
DNA ladder 检测
干旱胁迫诱导苹果属植物细胞程序性死亡的检测一实验目的1.了解细胞凋亡的原理2.掌握DNA片断化检测的方法二实验原理细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩，内源性核酸酶被激活，染色体DNA链在核小体之间被切割，形成180～200个碱基或其整数倍的DNA片段，将这些DNA片段抽提出来进行电泳，可得到DNA梯状条带（DNA ladder）。
细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNAladder。
如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-A TP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。
二．实验材料及用品以八棱海棠（Malus robusta Rehd.）三年生实生苗为实验材料，材料取自潍坊学院生物工程学院校内大棚，选取干旱处理三周的苗子的幼嫩叶片GXZ智能型光照培养箱ES-315型自动蒸汽消毒柜琼脂糖凝胶电泳仪凝胶成像分析系统微量移液器低温水浴锅氯仿-异戊醇（24:1）无水乙醇75%的乙醇，2%的CTAB（CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，）三、实验方法（一）、叶片总DNA的提取及检测采用CTAB小样法提取叶片总DNA，其主要过程如下：（1）取约1cm3的幼嫩叶片于研钵，向研钵中加入600µl 2%的CTAB分离缓冲液，研磨成浆，倒入1.5ml的离心管中。
（2）将离心管置于65℃水浴30min，其间每隔10min轻轻摇晃离心管，使其充分混匀。
（3）加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），颠倒摇晃5min。
（4）12000r/min离心15min，收集上清。
（5）向上清中加入1.5倍体积预先冰冻的无水乙醇，置于-20℃冰冻30min。
（6）12000r/min离心15min，弃上清，加入75%的乙醇常温下静置5min，弃上清。
DNA-ladder-protocol细胞凋亡操作步骤
也希望大家批评指正!注:黑色字体部分为<细胞实验指南>P108~109的内容(完全一样),其中红色部分为我的改动以及一些建议,希望您能成功!三、DNA裂解分析凋亡的标准特征之一，是基因组DNA断裂为180-200bp的多条寡核小体片段。
此现象可用常规琼脂糖凝胶电泳检测，是凋亡的特征。
由于该技术只能提供细胞死亡的定性分析，一般要结合定量的方法以确定样品的凋亡程度。
另有需注意的重要之处，一些细胞类型或细胞系(如K562，10T1/2，Raji)在凋亡时不是以此种方式断裂DNA，另外在坏死细胞中也不发生这样的DNA裂解。
这不是凋亡细胞的限定性试验，但不论在何系统中，这都是确定细胞死亡有用的特性。
DNA裂解测量有几种方法，包括FACS分析和完整的标记DNA的检测。
另一种方法TUNEL，需DNA末端标记，用于单个细胞DNA裂解的测定。
凋亡常常伴随有DNA的裂解，这些技术在凋亡测量中都有意义。
(一)琼脂糖凝胶电泳1)将5×105细胞移人无菌的 Eppendorf管中，4℃ 2000 r／min离心5分钟，弃上清。
注意不要使用过多的细胞，否则随后的酶解可能不完全，形成很黏稠的DNA溶液。
储军注:①细胞接种数:我一般是将细胞按照5×105细胞/35mm平皿接种,然后培养两天(因为接种后的细胞有部分会死亡,所以培养一天的细胞可能会少,个人觉得培养两天比较合适,细胞不要太多了!!!!),然后再加药物处理,处理时间看您药物的类型和剂量,不过建议您做几个梯度,同时进行,这样可以看出剂量和时间对细胞凋亡的影响程度,我当时做的是每隔8h,测量一次,太累,建议您每隔12h或者24h测量一次②离心速度:我是4℃ 2000 r／min离心5分钟,按照我实验室离心机换算RCF(相对离心力)为367g③细胞收集:贴壁细胞需要把漂浮细胞和贴壁细胞（胰酶消化）一起收集，离心，然后用预冷的PBS再洗涤一次,注意丢弃上清液要小心,注意不要把细胞吸走了,我一般使用1ml和两个移液枪来操作的,1ml取走大部分上清夜,把剩余的小心取走!2)加入20µl溶解缓冲液[20 mmol/L EDTA，100 mmoll/L Tris，，％(w/v)SDS] 。
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1.105-107个细胞0.5ml 胰酶消化后，转入
2.0ml离心管，加冰冷的PBS至1.5ml，1600rpm
离心5min，弃上清，收集细胞。
2.细胞重悬于1ml冰冷的PBS，转入1.5ml离心管。
1600rpm离心5min，漂洗2次，离
心收集。
3.加入0.5ml含100ug/ml蛋白酶K和20ug/ml RNase A的DNA提取缓冲液（蛋白酶K和
RNase A用前加），混匀，50℃水浴3h或37℃过夜，期间不时旋转混匀。
裂解液配方：
Tris-cl 10mM
EDTA 0.1M DNA提取缓冲液1.5ml
SDS 0.5%
蛋白酶K母液（20mg/ml）7.5ul
RNase A母液（10mg/ml） 3 ul
4.冷却到室温后加等体积的（酚，氯仿，异戊醇25:24:1），缓慢颠倒混匀5-10min。
5.6600r/min离心15min，取上清。
6.用等体积的（氯仿，异戊醇24:1）抽提一次，取上清。
若蛋白多可重复抽提1-2次。
7.加入0.1倍体积的3mol/L 乙酸钠（pH 5.2）与2倍体积-20℃预冷的无水乙醇。
-20℃放
置20min-1h。
8.12000r/min，室温离心20min，弃上清。
9.用1ml 70%的乙醇洗沉淀2次（12000rpm离心2-5min），室温下干燥5-15min。
（不做其
它实验此步可省）。
10.溶于50 ul TE 中。
11.用1.2%的琼脂糖凝胶（0.3g琼脂糖+25ml TAE配制）检测DNA质量。
一般样品上样量
5 ul + 1 ul loading buffer；Marker上样量5ul。
注意：
1.枪头剪掉一截，防止移液时DNA断裂。
2.所配试剂pH要准确，酚的pH值必须接近8.0.以防离心后DNA滞留于水酚双相的交界
面（主要为蛋白质）上。
3.测定DNA样品在260nm和280nm处的光吸收，A260/A280之比应大于1.75，低于此
值表明制备物中存留有显著的蛋白质。
4.对于细胞裂解液中加入较高浓度的胰RNase A（20ug/ml），可省去传统方法中DNA抽
提后再加RNase A处理的步骤。
5.DNA抽提液中的EDTA浓度宜为0.1M，可有效抑制DNA酶且易与酚分层。
【原理】
将分散好的真核生物组织、细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质。
破坏细胞膜、核膜，SDS可使组织蛋白与DNA分子分离，EDTA能抑制细胞中DNase的活性，使DNA分子完整地以可溶形式存在于溶液中，再用酚、氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质，氯仿可除去DNA溶液中微量酚的污染，异戊醇还可减少蛋白质变性操作过程中产生气泡，得到的DNA溶液经乙醇沉淀进一步纯化，为获得高纯度DNA，操作中常加入RNase除去RNA，此法可获得100-200bp的DNA片段，适用于构建真核基因组文库，southern blot分析。