人半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)试剂盒使用方法
caspase-3
(一)caspase家族Caspases是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。
Caspase一词是从Cysteine aspartic acid specific protease 的字头缩写衍生而来，就反映了这个特征，而这种高度的特异性，在蛋白酶中是很少见的。
由于这种特异性，使caspase能够高度选择性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数（通常只有1个）位点上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但从不完全降解一种蛋白质。
Caspase的研究源于线虫（C. elegans）细胞程序化死亡的研究。
线虫在发育过程中，有131个细胞将进入程序化死亡；研究发现有11个基因与PCD 有关，其中ced3和ced4基因是决定细胞凋亡所必需的，ced9基因抑制PCD。
线虫细胞程序化死亡的研究促进了其他动物特别是哺乳类动物中细胞凋亡的研究。
人们发现哺乳类细胞中存在着Ced3的同源物ICE（interleukin-1b converting enzyme），它催化白介素-1b的活化，即从其前体上将IL-1b 切割下来。
在大鼠成纤维细胞中过量表达ICE和Ced3都会引起细胞凋亡，表明了ICE和Ced3在结构和功能上的相似性；然而敲除ICE基因的小鼠其表现型正常，并未发现细胞凋亡发生明显改变。
进一步的研究发现，另一个ICE成员，后来被称为apopain，CPP32或Yama的半胱氨酸蛋白酶，催化poly（ADP-ribose）Polymerase（PARP），即聚（ADP-核糖）聚合酶的裂解，结果导致细胞的凋亡，因而认为apopain执行着与线虫中的ced3相同的功能。
Apopain被称为是“死亡酶”，而PARP被认为是“死亡底物”。
Apopain/CPP32/Yama是在1995年由两个实验室分别同时报导，时间上只有两周之差。
斑马鱼(Zebrafish)半胱氨酸蛋白酶3(Casp-3)ELISA试剂盒说明书
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断斑马鱼（Zebrafish）半胱氨酸蛋白酶3（Casp-3）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被半胱氨酸蛋白酶3（Casp-3）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的半胱氨酸蛋白酶3（Casp-3）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、3、6、12、24、48pmol/L试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
细胞凋亡中Caspase-3活性的检测
细胞凋亡中Caspase-3活性的检测关键词：细胞凋亡活性检测执行分子 2012-09-27 18:04 来源：互联网点击次数：5249Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。
Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。
但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→H RP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。
结果如下图2 荧光分光光度计分析原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。
根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。
在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。
根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC （caspase-3四肽荧光底物）?37°C反应1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。
人半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)试剂盒使用方法
人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）试剂盒使用方法本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T3 pmol/L -80 pmol/L使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）水平。
用纯化的人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3），再与HRP 标记的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。
TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）浓度。
试剂盒组成1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶 7 终止液 6ml×1 瓶2 酶标试剂 6ml×1 瓶 8 标准品（160 pmol/L） 0.5ml×1 瓶3 酶标包被板 12 孔×8 条 9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶4 样品稀释液 6ml×1 瓶 10 说明书 1 份5 显色剂A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 张6 显色剂B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
人胱天蛋白酶-3(caspase-3)说明书活性
人胱天蛋白酶-3（caspase-3）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中胱天蛋白酶-3（caspase-3）的活性。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人胱天蛋白酶-3（caspase-3）水平。
用纯化的人胱天蛋白酶-3（caspase-3）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入胱天蛋白酶-3（caspase-3），再与HRP标记的胱天蛋白酶-3（caspase-3）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的胱天蛋白酶-3（caspase-3）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人胱天蛋白酶-3（caspase-3）活性浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：18U/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
Caspase-3活性测定试剂盒
北京索莱宝科技有限公司
反应缓冲液μl
无样品 空白对照
95
待测样品μl
－
底物 μl
5
总体积μl
100
高酶活性 样品 85 10 5 100
低酶活性 样品 60 35 5 100
产品说明： 1、Caspase酶活力单位定义：参考 One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37 ºC under saturated substrate concentrations。即当底 物饱和时,一个Caspase酶活力单位定义为37 ºC 1小时水解pNA底物，产生1nmol游离pNA。根据pNA标准曲线 和样品OD值，可计算出Caspase酶活力单位。 2、除了处理组外，可设置阳性凋亡诱导剂组，阴性实验对照可包括不具有凋亡诱导作用的试剂(如 果能 得到)处理组、溶剂对照组、或凋亡诱导零时间点。
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×105个细胞或2个孔的12孔板细胞。勿用丝氨酸蛋白酶抑制剂如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。 1、（1）细胞裂解：1000g 5分钟收集细胞，吸尽上清。每2~10×106细胞加50~100µl裂解液震荡裂解，冰浴 10分钟，再次震荡。
(2) 组织裂解：3~10mg组织加100 µl裂解液放入小型玻璃匀浆器，上下匀浆30次。转移匀浆液于离心管。 2、4 ºC 12,000g 10分钟，取上清测定，或-70 ºC保存。 3、蛋白定量：用Bradford法测定蛋白浓度。裂解液含还原剂不宜采用BCA法。应使蛋白浓度达到1-3 mg/ml， 相当于每10 μl待测样品含10-30μg蛋白，否则应增加细胞用量。
半胱天冬酶3的裂解
半胱天冬酶3的裂解摘要：1.半胱天冬酶3的基本概念2.半胱天冬酶3的裂解过程3.半胱天冬酶3裂解的重要性4.应用与前景正文：半胱天冬酶3（Caspase-3）是一种重要的蛋白质，它在细胞凋亡过程中发挥着至关重要的作用。
Caspase-3的裂解是细胞凋亡的关键步骤，这一过程受到严格的调控，以确保细胞凋亡的顺利进行。
本文将介绍半胱天冬酶3的基本概念、裂解过程及其在细胞凋亡中的重要作用，同时探讨其在生物医学研究中的应用与前景。
一、半胱天冬酶3的基本概念半胱天冬酶3（Caspase-3）是一种属于半胱天冬酶家族的蛋白质，这个家族的成员在细胞凋亡过程中起到关键作用。
Caspase-3主要存在于细胞内，并在细胞凋亡信号传导途径中发挥作用。
当细胞受到内外因素的刺激时，Caspase-3会被激活，从而引发细胞凋亡。
二、半胱天冬酶3的裂解过程半胱天冬酶3的裂解是细胞凋亡的关键步骤。
在这一过程中，Caspase-3前体（Pro-Caspase-3）被激活，转变为具有活性的Caspase-3。
这个过程主要分为以下几个阶段：1.启动：细胞受到凋亡信号刺激后，激活一系列信号分子，如受体酪氨酸激酶、丝裂原活化蛋白激酶等。
这些信号分子进一步激活Caspase-3前体。
2.激活：活化的Caspase-3前体经过一系列的剪切，生成具有活性的Caspase-3。
这个过程中，半胱氨酸残基（Cys）被剪切，形成具有催化活性的Caspase-3。
3.执行：活化的Caspase-3进一步作用于细胞内的靶蛋白，如DNA损伤修复酶、线粒体复合物等，导致细胞功能丧失，最终导致细胞死亡。
三、半胱天冬酶3裂解的重要性半胱天冬酶3裂解在细胞凋亡过程中具有重要意义。
以下是几个方面的重要作用：1.调控细胞命运：Caspase-3的裂解可以决定细胞在凋亡信号作用下的存活或死亡，从而维持组织和器官的正常功能。
2.免疫调节：Caspase-3在免疫细胞凋亡过程中发挥作用，调控免疫应答，维持免疫平衡。
Caspase-3及Cleaved-Caspase-3在氟中毒大鼠肝脏中表达
Caspase-3及Cleaved-Caspase-3在氟中毒大鼠肝脏中表达李永宁;肖晶晶;赵建勇【摘要】目的探讨氟中毒大鼠肝脏组织中Caspase-3及Cleaved-Caspase-3的表达情况.方法选用36只健康SD大鼠分为对照组、低氟组、高氟组(饮用含氟量分别为＜1 mg/L、5mg/L及50 mg/L的自来水),每组12只(雌雄各半).饲养6个月后,股动脉放血处死,氟离子电极法检测大鼠尿氟含量;自动血生化分析仪检测大鼠肝功能;免疫组织化学法和蛋白印记(Western blot)法检测Caspase3及Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平.结果低氟组、高氟组大鼠尿氟[(1.85±0.13)、(2.23±o.10) mg/L均高于对照组[(1.63±o.11) mg/L] (P＜0.05);低、高氟组大鼠血清谷丙转氨酶及谷草转氨酶活性[(48.66±5.55)、(68.17±8.39)U/L及(142.57±16.21)、(165.89±28.26) U/L]均高于对照组[(38.49±2.98)、(117.98±9.88) U/L](P＜0.05);高过剂量氟组Caspase-3及Cleaved-Caspase-3蛋白表达[(98.08±13.08)、(106.33±9.14)]明显高于对照组[(53.92±6.36)、(59.78±7.54)l(P＜0.05).结论氟可促进Caspase-3及Cleaved-Caspase3蛋白的表达,其可能参与慢性氟中毒所致肝脏损伤发病过程.【期刊名称】《贵州医药》【年(卷),期】2016(040)003【总页数】3页(P239-240,封3)【关键词】氟中毒;Caspase-3;Cleaved-Caspase-3;细胞凋【作者】李永宁;肖晶晶;赵建勇【作者单位】贵州医科大学,贵州贵阳550004;贵州医科大学,贵州贵阳550004;贵州医科大学,贵州贵阳550004【正文语种】中文【中图分类】R392.11氟不仅可以导致骨质疏松、骨硬化、骨软化等一系列的骨相损害，还能造成中枢神经、心血管、消化、内分泌等多系统的非骨相损害[1]。
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人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）试剂盒使用方法本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T
3 pmol/L -80 pmol/L
使用目的：
本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）含量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）水平。
用纯化的人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中
依次加入半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3），再与HRP 标记的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。
TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）浓度。
试剂盒组成
1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶 7 终止液 6ml×1 瓶
2 酶标试剂 6ml×1 瓶 8 标准品（160 pmol/L） 0.5ml×1 瓶
3 酶标包被板 12 孔×8 条 9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶
4 样品稀释液 6ml×1 瓶 10 说明书 1 份
5 显色剂A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 张
6 显色剂B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 个
标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能
马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
80 pmol/L 5 号标准品 150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液
40 pmol/L 4 号标准品 150μl 的5 号标准品加入150μl 标准品稀释液
20 pmol/L 3 号标准品 150μl 的4 号标准品加入150μl 标准品稀释液
10 pmol/L 2 号标准品 150μl 的3 号标准品加入150μl 标准品稀释液
5 pmol/L 1 号标准品 150μl 的2 号标准品加入150μl 标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5 倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽
量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。
4. 配液：将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
10 分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。
测定应在加终止液后15 分钟以内进行。
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的
OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD 值大于标准品孔第一孔的OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计
算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
保存条件及有效期
1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6 个月__。