Caspase 3活性检测
Caspase活性检测说明书
Caspase活性检测（基于p NA标记底物的比色法）在caspase 的底物多肽上标记发色团如：p NA，可用于检测凋亡细胞中的caspase活性及筛选caspases的激活剂或抑制剂。
本操作步骤主要针对使用酶标仪进行读数而设计。
其中使用的细胞抽提物、底物、抑制剂及p NA的用量为每个样本140ul。
若您希望设计针对分光光度计读数的实验，建议对每种溶液体积进行进一步优化。
所需溶液、试剂及设备• Caspase底物• Caspase抑制剂• 细胞裂解缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 1mM DTT, 100uM EDTA • 检测缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 10mM DTT, 100uM EDTA, 10%Glycerol• PBS：将8g NaCl、200mg KCl和1.44g Na2HPO4溶于800ml蒸馏水；用HCl调至pH7.4；定容至1L• 酶标板和酶标仪其它试剂(推荐)• 纯化的Caspase（阳性对照）• p NA细胞抽提物的制备以适合的凋亡诱导剂对细胞进行诱导（参考前述操作方法），同时做阴性对照，包括未处理细胞、用诱导剂的无诱导活性类似物处理细胞（若可得到），或一个凋亡诱导处理“零时间”样品。
应保证有足够细胞进行重复实验，包含或不含抑制剂的对照以检测蛋白浓度。
一般来说，我们下面推荐的裂解前细胞数量可以产生足够蛋白浓度供酶标仪检测；然而不同大小、体积的细胞及蛋白浓度可能需要增加铺板密度。
当裂解2×107/ml细胞是，产生的蛋白浓度约为1-3mg/ml，体积10ul，含约10-30ug蛋白。
依据其细胞系，最少应有106个细胞，体积50ul的裂解缓冲液进行处理。
• 细胞计数，离心收集细胞。
以PBS缓冲液洗涤一次。
若细胞已被caspase抑制剂处理过，建议多洗几次以防止后继实验中可能造成的不利影响。
细胞凋亡中Caspase-3活性的检测
细胞凋亡中Caspase-3活性的检测关键词：细胞凋亡活性检测执行分子 2012-09-27 18:04 来源：互联网点击次数：5249Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。
Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。
但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→H RP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。
结果如下图2 荧光分光光度计分析原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。
根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。
在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。
根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC （caspase-3四肽荧光底物）?37°C反应1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。
人半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)试剂盒使用方法
人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）试剂盒使用方法本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T3 pmol/L -80 pmol/L使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）水平。
用纯化的人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3），再与HRP 标记的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。
TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）浓度。
试剂盒组成1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶 7 终止液 6ml×1 瓶2 酶标试剂 6ml×1 瓶 8 标准品（160 pmol/L） 0.5ml×1 瓶3 酶标包被板 12 孔×8 条 9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶4 样品稀释液 6ml×1 瓶 10 说明书 1 份5 显色剂A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 张6 显色剂B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
细胞凋亡的检测
细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。
细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。
一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1 光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。
三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。
紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS 稀释成终浓度为2~5mg/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。
储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。
结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。
3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。
凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
caspase-glo3 7assay
1.说明2.G8090成分1x2.5ml caspase 3/7 buffer，1瓶caspase 3/7底物（冻干）；置于-20度，避光。
4度3个月，常温4天。
96孔板25次100ul/孔384孔板100次25 ul/孔3.试剂的准备和储存a caspase 3/7 buffer和caspase 3/7底物用前置于室温；b 将caspase 3/7 buffer加入caspase 3/7底物瓶，混匀，使得caspase 3/7底物溶解，成为caspase glo-3/7试剂。
c caspase glo-3/7试剂4度可放置3天；4度放置1周可达到90%信号；4度放置4周可达到75%信号；caspase glo-3/7试剂-20度放置1周可达到75%信号；-20度放置4周可达到60%信号。
4. 检测细胞内caspase glo-3/7活性本实验caspase glo-3/7试剂和样品1：1混合。
（96孔板100ul caspase glo-3/7试剂+100ul 样品；384孔板25ul caspase glo-3/7试剂+100ul样品。
）需要准备的仪器a 光度计b 96孔板振荡器c 加样器d 96孔板4 A检测条件空白对照：caspase glo-3/7试剂+细胞培养液阴性对照：caspase glo-3/7试剂+培养细胞的细胞培养液实验孔：caspase glo-3/7试剂+处理后细胞的细胞培养液注意：a 96孔板中加入<20000细胞/孔；b 阴性对照和试验孔细胞数要一致；c 最高发光信号可能在1-2h达到，所以要在3h之内检测。
4 B 96孔板中培养的细胞caspase glo-3/7活性检测的标准方案a 检测前，把caspase 3/7 buffer和caspase 3/7底物置于室温，混匀；b 拿出96孔板，室温放置片刻；c 把caspase glo-3/7试剂100ul加入96孔板中（空白孔，阴性对照孔，试验孔）。
Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)
Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)产品简介：Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)家族在介导细胞凋亡过程的起着极其重要的作用，其成员包括Caspase1~11等,均属于蛋白酶家族。
Caspase 3又称CPP32、Yama、apopain、Caspase-3，属于CED-3亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。
Caspase 3 可以剪切procaspase 2、6、7和9，可直接特异性剪切许多Caspase底物（如PARP、ICAD等），并在细胞核凋亡过程中起到重要作用。
Jimei Caspase 3活性检测试剂盒（比色法）(Caspase 3 Colorimetric A ssay Kit)的检测原理是利用Caspase 3催化底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide(Ac-DEVD-pNA)产生黄色的游离硝基笨胺pNA (p-nitroaniline)，通过测定分光光度比色法测定pNA在400~410nm处吸光值，从而间接获得Caspase 3的活性。
自备材料：1、水浴锅或恒温箱2、96孔板3、酶标仪或分光光度操作步骤（仅供参考）：1、制备标准曲线：①按照Caspase Lysis buffer：Assay buffer=1：9的比例配制适量的标准品稀释液。
②用标准品稀释液稀释pNA(10mM)，使pNA分别达到200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM，另外设置一般不加pNA仅含标准品稀释液作为零管，把以上系列浓度物质作为标准品。
③取pNA浓度分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、0的标准品各100μl加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl的比色杯，测定405nm处吸光值即A405。
④用每一个标准品的A405 减去不含pNA的空白对照的A405，计算出实际的吸光值。
Western blot检测caspase3 的步骤及原理
蛋白免疫印迹检测caspase-3的活化原理及步骤
【原理】
蛋白免疫印迹技术是以某种抗体作为探针，使之附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原部位发生特异性反应，从而对复杂的混合物中的某些特定蛋白进行鉴别和定量。
基本过程：蛋白质样品先经SDS-PAGE分离，后通过电转移将凝胶上的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，经封闭后再用抗待检蛋白的特异性抗体作为探针与之结合，经洗涤后，将滤膜与辣根过氧化物酶偶联的抗IgG二抗结合。
辣根过氧化物酶可催化鲁米诺氧化并发光，试剂中的增强剂能使发光增强1000倍。
当加入免疫印迹化学发光剂后，鲁米诺发生氧化发光，并发射波长为428nm的光，此光可经X光胶片感光记录下来。
以此确定抗原-抗体-抗抗体复合物在滤膜上的位置及丰度。
【步骤】。
比色法检测Caspase-3相对活性
材料和方法11试剂caspase3底物acdevdpna购自biomol公司4羟乙基哌嗪乙磺酸hepes33胆酰胺基丙基二甲氨基丙磺酸盐chaps乙二胺四乙酸edta二硫苏糖醇dtt聚乙二醇辛基苯基醚tritonx100二甲基亚砜dmso购自amresco公司达氏修正依氏dmem高糖培养基购自gibco公司胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司bradford蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程研究所氯化钠nacl甘油glycerol碳酸氢钠nahco等试剂均购自天津市化学试剂三厂
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Caspase 3 活性检测试剂盒
产品组成：
产品组成 BB-4106-1 BB-4106-2 BB-4106-3
规格 20 assays 50 assays 100 assays 裂解缓冲液 5ml 10ml 15ml
Ac-DEVD-p NA 200ul 500ul 1ml
检测缓冲液 5ml 10ml 15ml
DTT 100ul 150ul 250ul
产品简介：
Caspase 3 活性检测试剂盒(Caspase 3 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中Caspase 3酶活性或纯化的Caspase 3酶活性的试剂盒。
Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。
Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3或caspase3，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。
Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。
Caspase-3在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；但在细胞发生凋亡阶段，Caspase-3被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。
Caspase 3可以剪切procaspase 3、6、7和9，并可以直接特异性剪切许多caspase 底物，包括PARP，ICAD，gelsolin和fodrin等。
这些由caspase 3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。
另外，caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，包括染色质固缩，DNA片段化等。
同时caspase 3对细胞起泡也起到关键作用。
本Caspase 3 活性检测试剂盒是基于casepase 3可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA，pNA在405nm附近有强吸收，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3的活性。
本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测，可用于培养细胞或新鲜组织样本的caspase-3检测。
使用方法：
一、裂解缓冲液和检测缓冲液配制
根据待测样品数准备裂解缓冲液和检测缓冲液，每1ml缓冲液中加入10ul DTT。
二、样品处理
A．细胞样品
1.收集2-5×106个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，
尽可能吸干，收集细胞。
2.用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3.在细胞中加入100μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。
4.置冰上15分钟，每隔5分钟高速涡旋振荡15秒。
5.在4℃，500×g条件下离心5分钟。
6.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
B．组织样品
1. 取适量组织样本剪碎，按照50mg/100μl冷的裂解缓冲液，用组织匀浆器匀浆至
无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置15分钟，小心将上清吸入另
一预冷的干净离心管。
1.在4℃，500×g条件下离心5分钟。
2.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
三、对上述处理过的上清用Bradford法进行蛋白定量。
四、Caspase 3活性检测
1、取10ul大约含20-50ug蛋白的裂解上清，加入90ul检测缓冲液。
2、再加入10ul Ac-DEVD-p NA （使用前请混匀），在37℃下避光反应1-2小时，有
黄色颜色产生即可进行检测，如果颜色变化不明显，时间可以延长，甚至孵育
过夜。
部分样品中激活的caspase-3水平较低，颜色变化不明显，直接上机检
测，与对照组样品产品变化即可。
3、测定A405nm或A400nm。
4、根据凋亡诱导的细胞的吸光值与空白对照细胞的吸光值的比值计算相对的
Caspase 3活性程度。
参考文献：
●Yakun Ge et al. Silibinin Causes Apoptosis and Cell Cycle Arrest in Some Human
Pancreatic Cancer Cells
International Journal of Molecular Sciences 2011, 12(8) （IF=2.279）
●Zhixiong Pan et al. Effects of palmitic acid on lipid metabolism homeostasis and apoptosis
in goose primary hepatocytes
Molecular and cellular biochemistry 2010 Volume 350 （IF=2.168）
●Zhixiong Pan et al. Screening and identification of differentially expressed genes in goose
hepatocytes exposed to free fatty acid
Journal of Cellular Biochemistry 2010 Volume 111, Issue 6 （IF=3.122）
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