神经生物学常用研究方法
神经生物学和神经科学的研究方法和应用
神经生物学和神经科学的研究方法和应用神经生物学和神经科学是两个密切相关的领域，它们都关注的是神经系统的结构和功能。
神经生物学主要研究神经细胞如何产生电活动、传输信息等基础生理学问题，而神经科学则更加综合，既涉及动物行为学、认知心理学等心理学方面的问题，也包括神经解剖学、生物化学等生物学方面的问题。
本文将主要从研究方法和应用两个方面入手，探讨神经生物学和神经科学的研究现状和未来发展趋势。
一、神经生物学的研究方法在神经生物学领域，科学家们使用的研究方法包括但不限于以下几种：1.神经记录技术：该技术可以记录神经元产生的电信号，通过测量电信号的强度和时序等参数，分析神经元的激动性和抑制性。
例如，著名的多电极阵列技术可以同时记录多个神经元的电信号，揭示神经元之间的相互作用。
2.神经成像技术：该技术可以通过光学或磁学方法成像神经元的活动。
如荧光成像技术用于实时观察神经元胞内钙离子浓度的变化；功能性磁共振成像技术可以在活体动物或人体中非侵入性地检测脑区活跃程度。
3.基因修饰技术：该技术可以在动物模型中特定地改变神经元的基因表达，进而研究基因对神经系统发育和功能的影响。
例如，利用转基因技术可以使小鼠产生类似于人类帕金森病的症状，从而研究该疾病的发病机制和治疗方法。
4.离体神经研究技术：该技术将神经元或神经组织从体外收集并进行实验，使研究人员可以更深入地探究神经元的生理和分子机制。
如单个神经元培养技术可以研究神经元的形态和功能发育；原代神经元培养技术可以用于研究神经细胞在疾病环境下的表达和适应。
二、神经科学的研究应用在神经科学领域，应用广泛，其中一些典型应用包括但不限于以下几个方向：1.神经疾病的研究和治疗：神经科学家们通过研究神经系统的功能和结构变化，探索各类神经疾病的原因，设计药物和治疗方案，例如阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中等常见神经疾病。
2.神经可塑性和学习记忆：神经科学家们研究神经元在学习和记忆形成过程中的变化和适应，揭示记忆在神经系统中的编码过程，发现神经可塑性的规律及其机制，为人工智能领域的发展提供了重要参考。
神经科学研究的方法及应用
神经科学研究的方法及应用神经科学是研究神经系统的结构、功能、发育和病理生理学的一门学科，其涉及的领域十分广泛，包括神经元的电生理学、计算神经生物学、分子与细胞神经生物学、神经系统发育和再生、神经系统疾病、神经影像学等。
要深入了解神经科学，一个关键问题是研究方法。
本文将介绍几种常用的神经科学研究方法及其应用。
1. 电生理学方法电生理学方法是神经科学中最早也是最重要的研究方法之一，它主要应用于研究神经元在生理和病理情况下的电生理活动。
具体来说，它包括细胞外记录和细胞内记录两种技术。
细胞外记录是指通过在神经元周围表面放置微针或电极，测量神经元周围的电场，并得出信号图。
这种方法广泛应用于研究大脑皮层区域中神经元群体的活动、感觉器官的电活动等。
细胞内记录是指在神经元内部通过电极测量神经元的膜电位变化和突触前后电位变化。
这种方法可以研究神经元的离子通道和突触的功能。
2. 行为学方法行为学方法是研究神经系统对行为的控制的方法。
它主要包括操作性条件反射和经典条件反射两种技术。
操作性条件反射是指通过建立某个刺激与某个行为之间的联系，在动物或人体中训练和测试此条件反射是否建立、消失或得到增强或减弱。
经典条件反射是指在动物或人体中建立某个刺激与某个行为之间的联系。
经典条件反射的典型例子是帕福洛夫狗实验。
3. 分子和细胞神经生物学方法近年来研究人员利用蛋白质组学、基因组学和微阵列技术等对神经元中基因表达调控及功能等方面进行了深入研究。
而分子和细胞神经生物学方法则是研究神经系统中分子和细胞之间相互作用的一种方法。
该方法十分重要的一种应用是研究神经系统疾病及其发生机制。
例如，在研究阿尔茨海默病、帕金森病和癫痫等疾病的发生机制时，利用分子和细胞神经生物学方法鉴定这些疾病的发生机制中与某些基因有关的单核苷酸多态性等的基因突变。
4. 神经影像学方法神经影像学方法是利用不同的技术将活体神经系统大小、形态分布以及结构组成可视化的一种方法。
神经科学的研究方法
神经科学的研究方法神经科学是一门研究神经系统结构、功能及其发展变化的学科。
它涉及到多种学科领域，如分子神经生物学、生物物理学、神经解剖学、神经药理学、计算神经科学等等。
神经科学的研究方法也十分多样，这篇文章将会对比常见的三种神经科学的研究方法进行介绍。
第一种方法是“病例研究法”。
这种方法主要是研究某些罕见的疾病对于神经系统的影响。
例如，有些患者可能患有某种阿尔兹海默症，研究人员就可以对这些患者进行脑部扫描，记录他们的神经元密度、兴奋性等等，来研究病变对神经系统的影响。
基于这类病例的观察，可以发现一些普遍的规律，从而发现相关机制并进一步深入研究。
第二种方法是“相关技术”。
这种方法允许研究人员研究生物体结构、内在机制和功能的细节。
常见的相关技术包括生物成像、电生理学和分子生物学。
例如，采用光遗传学技术，可以操纵神经元的活动并观察它们的行为反应。
通过这种方法，可以获取神经元内部细节信息，同时也可以更加精准的测量神经元活动的信息。
第三种方法是“行为测量法”。
这种方法主要是通过观察生物的行为来研究神经系统的活动方式和机制。
例如，可以通过对动物的行为反应来研究它们在工作记忆任务中的认知机制，并相应记录行为反应后神经元活动的变化。
这种方法的好处是具体而微观，这些观察可以用作更深刻的神经科学研究的起点。
以上三种方法既可以单独使用，也可以在研究中综合运用。
例如，可以使用病例研究法和相关技术相结合，来深入研究某些罕见病例的神经系统机制，并通过行为测量法验证相关机制的正确性。
这种深入的综合性研究是神经科学的一大特点，也是神经科学持续快速发展的重要保障。
总之，神经科学的研究方法多样化。
不同的方法在不同的研究对象和研究目的下各有所长。
同时，我们也需要注意到，神经科学的研究方法还在不断发展壮大，未来很可能会有更多新的方法出现。
神经生物学方法
GFAP-ir
40X
P75-ir
40X
原位杂交(IN SITU HYBRIDIZATION)
原位核酸分子杂交技术（In situ nucleic acid molecular hybridization)简称原位杂交技术。是 用标记的NDA或RNA为探针，在原位检测 组织细胞内待定核酸序列的方法。根据 所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可 分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNARNA杂交。
X40 NADPH-d Staining In Caudate Nucleus
NADPH
免疫组织化学 (Immunohistochemistry)
利用特异性抗体对神经组织中某种特异 成份(抗原)进行抗原--抗体反应,达到检 测组织细胞内是否有此特异性物质。其 本质就是用标记的抗体追踪抗原(以确定 组织细胞内的某种化学物质) 。
10×
40×
HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat
HRP labelling neurons in dLGN
X40
Double-labelling of HRP and
Glutamate in rat lateral geniculate nucleus
Immunohistochemical procedures
1.Tissuue preparation:perfusion,section 2.Blocking:封闭，异种蛋白质间会有非特异 性结合，常用正常羊血清（NGS）或牛血清白 蛋白（BSA）封闭。 3.Incubate in primary antibody:最佳浓度 需摸索，为提高抗体向组织内穿透，可在抗体 稀释液中加入0.1%～0.3%TritonX-100。需长 时间孵育时应加入0.01%～0.3%NaN3防腐。 产生一抗的动物一定要知道，以便选择二抗。
神经生物学研究方法
Tail suspension test (TST)
• 应激模型
小鼠悬尾法（tail suspension test），一种行为绝望法。将小鼠 倒悬 在实验小室内，观察5分钟内不动时间。 抗抑郁药可减少不动时间
Forced swim test (FST)
强迫游泳实验(forced swimming test) 动物在恶劣环境下不能逃逸 时，便出现行为绝望(behavioural despair)，处于一种不动状态 （immobility）是一种有效地评价抗抑郁药的大鼠抑郁模型。
WT
Camk2-cre;foxg1 L1
P7P10-P14
P7P10P13P15-P21
Camk2-cre;foxg1;Rosa-gfp GFP
control
MU
40000X
PSD/Active zone 宽度、 囊泡数量、 囊泡数量与 active zone相 对值
150000X
Adult TM7 rest14 Golgi staining
治疗干预
表观有效性
动物表现出和神经精神疾 病病人相同的行为模式
行为/认知障碍 减缓
预测有效性
动物模型应能对已知的 抗精神病药物处理作出 相应的反应或治疗前景
治疗干预
Behavioral tests
Basic Open fiated plus maze: anxiety Depression: tail suspension test, forced swim test Sucrose preference test, social interaction,
Foxg1f/f
Camk2-creer; Foxg1f/f
神经生物学的常用研究方法
逆行运输：从轴突及其终末向胞体的运输。
常用方法：
a 辣根过氧化物酶追踪法
1971年，Kristenson和Olsson首先报道辣根过氧化物 酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神经末梢摄取， 经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可 显示出神经元的轮廓，从而创建了HRP追踪神经元示踪技 术，即HRP法。
呈色在剂的：情况下，1.二能氨使基DA联B苯发胺生(氧DA化B，): 生DA成B不作溶为性供棕氢褐体色，反H应RP产在物H沉2O淀2存， 定位在抗原所在处。 2.二盐酸联苯胺(BDHC) 3.邻-联茴香胺(OD) 4.四甲基联苯胺(TMB)
用途： 研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组 织化学、电镜技术等结合。
原 理： 将荧光物质注射至神经元的轴突分布区, 经分支 的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜 下可看到胞体内呈现荧光标记物。
• 荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定 发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有 各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些 荧光素发出的荧光颜色各异。
（1）轴浆运输追踪法
轴浆运输：神经元有长短不等的轴突，由于轴突内缺 乏参与蛋白质合成的核糖体，所以需要从细胞体不断地将 各种成分运输至轴突及其分支以维持其代谢；在神经末梢 释放的神经肽及合成经典递质的酶也需在胞体合成；从末 梢也有影响细胞代谢的物质如神经营养因子等逆向传送至 胞体。不同物质的运输速度不同。
• 不同荧光素在神经元内的标记特征不同： 绝大多数标记细胞质，如荧光金（Furogold，灵敏度
高，能较好显示树突分支，只标记胞浆；在胞体内分解慢， 甚至在注射后存活2个月标记强度仍无明显变化；比较耐 紫外线的照射，褪色比较缓慢；可以经受许多组织学染色 处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等结合使用）， fast bule（固蓝）等。
免疫学与神经生物学研究相关内容
免疫学与神经生物学研究相关内容王德美2120141293在神经生物学研究中，常常要研究某种蛋白的表达量，会用到免疫学检测的方法。
一、用标记抗体或抗原进行的抗原-抗体反应免疫标记技术乃用荧光素、酶或放射性核素等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。
标记物与抗体或抗原连接后并不改变后者的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。
1.免疫荧光法(immunofluorescence, IF)此法乃用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此鉴定或定位标本中的抗原。
常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白（PE），前者发黄绿色荧光，后者发红色荧光。
（1）直接荧光法：将荧光素直接标记抗体，对标本进行染色。
该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。
（2）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。
该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检查，但非特异性反应亦增加。
免疫荧光法可用于检查细菌、病毒、螺旋体等抗原或抗体，用于诊断传染病，还可用于鉴定免疫细胞表面的CD分子，检测自身免疫病的抗核抗体等。
2.酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA)此法将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。
可用目测定性，也可用酶标测定仪测定光密度（OD）值以反映抗原含量，灵敏度可达每毫升ng甚至pg水平。
常用于标记的酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)等。
常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者检测组织或细胞表面抗原。
酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是酶免疫测定中应用最广的技术。
〖医学〗神经生物学概述
3、神经生物学开展的几个特点
多学科研究 多层次研究 实验材料的重要性 现代神经科学呈现方向的多样性 知识更新很快
1〕、神经科学研究是多学科的综合研究
作为一名实验科学，对神经系统的研究在很 大程度上有赖于研究手段的开展和完善。 〔1〕没有Golgi染色法，就不可能观察到神 经细胞的形态；〔2〕没有微电极的创造， 就不可能进行神经系统的电生理学研究； 〔3〕没有免疫组织化学方法的开展，就不 可能把神经化学的研究与形态学研究有机 地结合起来；〔4〕没有膜片钳技术的开展， 就不可能进行单通道电流的研究。
Sir Henry Hallett Dale(1875~1968,英国)和Otto Loewi(1873~1961,奥地利)，发现了神经冲动的化学传 递。1936 〔神经生理〕
Corneille Jean Francois Heymans(1892 ~1968,比利时)， 发现了颈动脉窦和主动脉弓在呼吸调节中的作用。 1938 〔呼吸生理〕
2〕、神经科学研究是综合研究：从分子到行 为的“一条龙〞研究，是神经科学研究的特 点。
3〕、神经科学的开展在一定程度上取决于能 否寻找到适宜的实验材料来对某个特定的 问题进行研究。如〔1〕、海兔标本对于学 习、记忆机制的阐述；〔2〕、枪乌贼大神 经对突触传递过程的了解；〔3〕、鱼类的 电器官使我们对乙酰胆碱的作用有广泛的 了解；〔4〕、神经分子遗传学的研究那么 大大得益于线虫和果蝇所获得的资料。
Allvar Gullstrand(1862~1930,瑞典)，在眼屈光生 理学方面的研究。1911〔感觉生理〕
Robert Barany(1876~1936,奥地利)，在内耳前庭 器官生理学的工作。1914 〔感觉生理
谢灵顿〔C.S,Sherrington, 1857～1952，英国〕和Edgar Douglas Adrian(1889 ~1977,英国)，关于神经元功能 的研究，建立突触的概念。1932〔神经生理〕
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原位杂交
核酸分子杂交技术，检测细胞内mRNA和DNA序列片段， 原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。 基本原理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配 对的特点，应用已知碱基序列并具有标记物的RNA或 DNA片段即核酸探针（probe），与组织切片或细胞内 的待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，通过标记物 的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在 与定位。
C.Golgi (意)
1852
1906
形 态 生电 理生 理
徒手切脑片 神经元染色方法 银染神经元
R.Cajal (西班牙)
1934
染出神经末梢，发现神 经元之间无原生质联系 “神经元学说”
1952
1857
C.S.Sherrington (英) 1932 Oxf
1889 E.D.Adrian
•“突触”定名 巴浦洛夫 •“反射”概念 反射学说 •“交互”抑制
生理学方法 生物化学方法 分子生物学方法
神经影像（Neuroimaging）
•
Invasive: Single unit recording • Multi-unit recording • PET (positron emission tomography)
•
•
Non-invasive: • CT (computed tomography) • ERP (event-related potential) • MEG (magnoencephalography) • MRI (magnetic resonance imaging) • fMRI (functional magnetic resonance imaging)
HE（苏木素－伊红）
锇酸染色
锇酸染色是神经科学研究的一种常用而普遍的方法，它本 来是用来固定脂质的，由于髓鞘的主要成分是脂质，所以 用于有髓神经纤维的染色
氯化金浸染
氯化金浸染 Ach荧光染色
运动终板
Cajal银浸染色
尼氏染色
多种方法，HE、甲苯胺蓝，焦油紫，硫堇，天 青，派洛宁，中性红以及棓花青等碱性苯胺染 料均可以使尼氏体着色
151 Channel MEG
MRI vs MEG
Magnetic Resonance Imaging (MRI)
fMRI (functional magnetic resonance imaging)
Brain activity Oxygen consumption Cerebral blood flow
百年来与神经科学有关的诺贝尔奖获得者选介(3)
1850 1900
1923
1950
2000
A.Carlsson (瑞典) P.Greengard (美) E.Kandel (美)
2000
神经系统中 的信号转导
多慢蛋 巴突白 胺触磷 传酸 递化
1926
1930
生理科学进展2001 年第32 卷第2 期
动 作 电 位 机 制
1914
1917
A.F.Huxley (英)
1911
B.Katz (德
英) 1970
（ 1905 U.Von Euler (瑞典…) 1983 •交感神经递质 神经药理学 儿神 •去甲肾上腺素 茶经 1912 J.Axelrod (美) 酚化 •儿茶酚胺代谢 分子药理学 •影响CAs的药物 胺学 1913 1981 R.W.Sperry (美) ） “脑功能侧化” (左右脑) 1926 D.Hubel (加 信 美) 视 息 •大脑视觉信息加工 皮 1924 •视觉系统发育的可塑性 T.Wiesel (瑞典 美) 加 层 工 1991 E.Neher (德) 方膜单 •膜片钳技术 法片通 B.Sakmann (德) •单个离子通道电流记录 学钳道 Levi Montalcini 1986 Nerve growth Factor (NGF) (Italy)
神经生物学常用研究方法
王海萍 (histologyw@)
安徽医科大学神经生物学教研室
神经科学的兴起
中国内经（汉或秦）：脑为诸髓之海 国外：医学之父希波克拉底（Hippocrates， 460—377BC.）提出脑是精神活动的器官;而 古罗马医学家盖伦则认为,脑是理性灵魂的 器官,感觉、记忆、思维、想象、判断等都 是脑的功能；德国医生加尔指出脑是思想的 器官 “颅相学”
论学说。加尔从小就喜欢观察人的外表（尤其是颅骨外表）
同心理的关系。例如，他根据个人长期的个案观察，发现 眼睛明亮的人，一般记忆力较好；头骨隆起的人，可能象
征着贪婪的脑机能，是监狱中扒手的特征等。根据当时生
理和解剖知识，写了一套名为《神经系统的解剖学和生理 学》的系列著作，除了就神经系统及其机能进行严谨、保
2004年诺贝尔生理学或医学奖颁发给美国科学家理查
德· 阿克塞尔和琳达· 巴克，以表彰他们在人体气味受体和
嗅觉系统组织方式研究中作出的杰出贡献。
神经科学的特点
多学科综合
神经科学 神经解剖学 神经生理学 神经生物化学 心理学 ………..
神经科学的特点
多层次的研究
分子 神经科学 细胞 神经科学 神经科学
守的阐述之外，还兼论颅相学。
生命科学
解剖学 生理学 生物化学 …… ……………
神经科学
(1990-2000 脑的十年) (2001-2100 脑的世纪)
认知科学 （人类感知和思维信
息处理过程的科学）
了解脑
分子 细胞 网络 全脑 寿命延长 (离体研究) Patch（电） RIA(化学） PCR(基因） (无创在体研究) 脑地形图 PET(化学） fMRI (功能）
Choice of the Methods
Choice of the methods depends on the scientific question being asked.
For neuronal activity, at a cellular level, use single- or multi-unit recording. For questions of structure, use CT or MRI. For questions of function, or system interactions, where the anatomy is of interest, use PET or fMRI. For questions of processing, where timing is important, use ERP and/or MEG.
CT or CAT scan (Computed Tomography)
Magnetoencephalography (脑磁波描计术，MEG)
• Current flow in neurons creates local magnetic fields • MEG measures local magnetic field changes from the surface of the scalp using superconducting coils or SQUIDs • Excellent temporal resolution • Better spatial resolution than ERP
神经化学
•乙酰胆碱ACh
1874
J.Erlanger (美)
H.S.Gasser (美)
1944
1965
1888
1963
•阴极射线示波器 •神经纤维的分类ABC
电生理
1881
W.R.Hess (瑞士) 1949
1973
•脑立体定位仪 hypothalamus
百年来与神经科学有关的诺贝尔奖获得者选介(II)
束路追踪
原理：轴浆运输 示踪物质：HRP，荧光染料，
各种标记物标记的葡萄糖，放射 性核素标记的氨基酸等。
观察：根据示踪物质不同，采用
组织显色、荧光显微镜或放射自 显影等方法。
免疫组化
原理示意图：
间接法：
直接法：
免疫组化
根据二抗标记的不同（荧光素、酶、铁蛋白、 胶体金或银标记），免疫组化包括免疫荧光、 免疫酶组织化学、免疫金银及铁标记技术
原位杂交
此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三 种：①利用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制 成互补DNA探针(cDNA)；②应用限制性核酸内切酶消化 制成线性DNA模板，在体外转录获得反义RNA探针 (cDNA)；③依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合成 仪合成寡聚核苷酸探针。 cRNA和cDNA的常用标记物有32S、32P、3H等放射性核 素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。
认知 神经科学
计算 神经科学
发生 神经科学
临床 神经科学
系统和行为 神经科学
研究水平
整体行为水平：行为学，躯体感觉，视听
觉，痛觉等
细胞水平：神经细胞培养、生物电活动检测、
通路示踪、细胞染色、免疫化学、凋亡检测
分子水平的实验：离子通道、受体、酶、
遗传物质等
神经生物学常用研究方法
形态学方法
大体：解剖、影像 组织：常规染色和特殊染色、束路追踪、免疫组 化、原位杂交、神经细胞培养等
Positron Emission Tomography (PET，正电子发射计算机断层显像)
FDG or F18 fluorodeoxyglucose
O15 Water
18F-FDG PET脑代谢显像， 正常人与老年性痴呆对照， 患者双侧顶叶、颞叶皮质 对称性低代谢。