2 T淋巴细胞转化实验
实验报告 淋巴细胞转化
实验报告淋巴细胞转化
实验报告：淋巴细胞转化
摘要：
本实验旨在探究淋巴细胞的转化过程，通过不同的刺激因素，观察淋巴细胞的分化和功能改变。
实验结果表明，淋巴细胞在不同刺激条件下，具有不同的转化能力，这为深入研究淋巴细胞功能和免疫反应提供了重要的参考。
引言：
淋巴细胞是免疫系统中的重要细胞，具有多种功能，包括抗原识别、抗体产生和细胞毒性等。
在不同的刺激条件下，淋巴细胞可以发生转化，表现出不同的功能和特性。
本实验旨在通过不同的刺激因素，观察淋巴细胞的转化过程，为深入研究淋巴细胞功能和免疫反应提供实验依据。
材料与方法：
1. 采集小鼠淋巴细胞
2. 将淋巴细胞分为不同实验组
3. 对不同实验组的淋巴细胞进行不同刺激处理，如抗原刺激、细胞因子刺激等
4. 观察淋巴细胞的形态变化和功能改变
5. 分析实验结果
结果：
经过不同刺激处理后，观察到淋巴细胞的形态发生了明显的改变，包括细胞大小、形状和表面分子的表达。
同时，经过刺激处理后，淋巴细胞的功能也发生了变化，如抗体产生能力、细胞毒性和细胞因子分泌等。
讨论：
本实验结果表明，淋巴细胞在不同刺激条件下，具有不同的转化能力，这为深入研究淋巴细胞功能和免疫反应提供了重要的参考。
未来可以进一步探究淋巴细胞转化的分子机制，以及在免疫治疗和疾病治疗中的应用前景。
结论：
通过本实验，我们得出结论：淋巴细胞在不同刺激条件下，具有不同的转化能力，这为深入研究淋巴细胞功能和免疫反应提供了重要的参考。
这一研究成果对于深入理解淋巴细胞的功能和应用具有重要意义。
《淋巴细胞转化实验》课件
实验操作技巧
01
技巧三：减少误差来源
02
尽量使用同批次和同质量的试剂进行实验，以减少误差来源。
03
在实验过程中保持一致的操作方法，避免人为误差的产生。
04 实验结果分析
实验结果展示
淋巴细胞转化率
通过显微镜观察，记录不同时间段淋巴细胞 的形态变化，计算淋巴细胞转化率。
细胞形态学观察
细胞增殖数量
采用细胞计数法，统计增殖的淋巴细胞数量 ，并计算增殖倍数。
实验的局限性与改进方向
局限性
实验结果可能受到样本来源、实验条 件等因素的影响，导致一定的误差。
改进方向
进一步优化实验方案，提高实验的准 确性和可重复性；扩大样本量，增加 代表性；探索更多淋巴细胞转化相关 的机制和影响因素。
谢谢聆听
实验操作前的准备
实验场地消毒：确保无菌环 境
实验器材清洗和灭菌：确保 无污染
实验试剂配制：根据需要配 制适量的培养基和试剂
动物处理：麻醉、取材等操 作需严格遵循动物伦理要求
03 实验操作过程
实验操作流程
步骤一：准备试剂和器材 准备淋巴细胞分离液、培养基、离心管、移液管等。
确保所有试剂和器材在实验前已进行消毒处理。
《淋巴细胞转化实验 》ppt课件
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ录
• 实验概述 • 实验材料 • 实验操作过程 • 实验结果分析 • 实验结论
01
实验概述
实验目的
验证淋巴细胞在抗原 刺激下的转化现象。
探究淋巴细胞转化与 疾病发生、发展的关 系。
了解淋巴细胞在免疫 应答中的作用。
实验原理
01
淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有识别抗原 、增殖分化和产生免疫应答的能力。
淋巴细胞转化实验PPT课件
220µL
220µL
450µL
220µL
440µL
10ug/ml
5ug/ml
2.5ug/ml
LOGO
注意事项
❖ 注意无菌操作 ❖ 操作中尽可能短时间内完成，以减少死细胞数 ❖ 将稀释血加于分离液时，动作要轻柔 ❖ 离心时，加速度与减速度要均匀平稳，不能用离心机“刹车”档 ❖ 分离不同种属动物的PBMC要用不同的淋巴细胞分离液 ❖ 细胞数量、刺激剂浓度需要在预实验中摸索最适条件
❖ 细胞传代培养：原代培养细胞长到一定密度时，需进行 B组：加入100ul ConA(10ug/ml),则终浓度为5ug/ml.
淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增
殖。
传代培养。
形态计数法、MTT法、CCK-8法、同位素法。
B组：加入100ul ConA(10ug/ml),则终浓度为5ug/ml. Original sample tube
N关a闭H超CO净为3台溶风D液机：N；常用A浓合度为成5. 的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入 Ω一切操的作均3要H在-火T焰d前R方进就行；越多。该方法与MTT比较，灵敏度高、准
√悬浮生长细胞传代：离心法 Ficoll比重为1.
原代细胞离体时间短，在一定程度上能反映体内的生长特性。
√半悬浮生长细胞传代：直接吹打法 在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖；
取静脉血3ml,用PBS（吸管1）稀释1倍（滴管1）
基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，红细胞、中性粒细胞比重为1.
❖ 细胞的复苏 从液氮罐中取出的冻存管，迅速投入37℃水浴中充分摇 动，使其迅速融化。加入培养液离心后，弃上清，加培 养液培养。
淋巴细胞转化实验报告
淋巴细胞转化实验报告
《淋巴细胞转化实验报告》
淋巴细胞是一种重要的免疫细胞，它们在体内起着重要的免疫监测和调节作用。
淋巴细胞的转化实验是一种常用的实验方法，用于研究淋巴细胞的功能和活性。
在本次实验中，我们对淋巴细胞进行了转化实验，并得到了一些有趣的结果。
首先，我们从实验动物的淋巴组织中分离出淋巴细胞，并将它们培养在含有适
当营养物质的培养基中。
随着培养时间的延长，我们观察到淋巴细胞的数量逐
渐增加，并且它们的形态也发生了变化。
在显微镜下观察，我们发现淋巴细胞
的形态由圆形变为椭圆形，胞质增加，胞核变大。
这表明淋巴细胞在培养基中
得到了充分的营养和生长条件，从而发生了细胞转化。
接下来，我们对转化后的淋巴细胞进行了功能性实验。
我们使用了一种常用的
淋巴细胞激活试剂，刺激转化后的淋巴细胞，然后观察它们的反应。
我们发现，转化后的淋巴细胞在受到刺激后，迅速产生了细胞因子，并且开始增殖和扩散。
这表明转化后的淋巴细胞具有了充分的免疫活性，并且能够有效地应对外界的
刺激。
最后，我们对转化后的淋巴细胞进行了表型分析。
我们使用了流式细胞术对细
胞进行了分析，发现转化后的淋巴细胞表面的免疫分子表达水平显著增加，这
进一步证实了它们的免疫活性得到了提高。
通过本次实验，我们成功地进行了淋巴细胞转化实验，并得到了一些有意义的
结果。
这些结果不仅对于淋巴细胞的功能和活性有重要的启示，也为我们进一
步研究免疫细胞的活性和调节机制提供了重要的参考。
希望通过我们的努力，
能够为免疫学领域的研究和临床应用做出更大的贡献。
T淋巴细胞转化试验步骤及注意事项
淋巴增殖实验:第一种，取外周血和脾脏分离淋巴细胞用于淋巴增殖实验,具体步骤如下⑴雏鸡翅下釆血2mL,加入1mL抗凝血和1mLPBS的混合液,混合均匀后,缓缓加入装有2mL淋巴细胞分离液的无菌透明的大离心管中,不要摇晃,注意血液与淋巴细胞分离液不要混合,2000rpm,离心20min,可以看见中间有层白色雾状白细胞,吸取白细胞至2inL离心管中,2000rpm离心5min取沉淀;(2)向离心管中加入1mL 1640清洗2遍,2000rpm离心5min取沉淀;⑶将沉淀悬于1mL DMEM,细胞计数板计数,取 1 xlO7个细胞悬于ImLPBS中,置于37°C培养箱中用CFSE (终浓度2gM)避光染色lOmin,每隔2-3min上下颠倒一次;(4)DMEM洗漆细胞2次,每次1mL,2000rpm离心6-7min;(5)悬于1mL DMEM 中;(6)取5xl05个细胞置于96孔板,同时加入20μ30μg/m的ConA,DMEM补齐至200μL,4℃二氧化碳培养箱诱导3d;(7)流式专用buffer洗涤2次,2000r离心5min,200μbuffer悬起,流式细胞仪检测。
取1小块脾脏加入1mL 1640研磨,脾脏细胞先用200μL红细胞裂解液作用5min,2000rpm离心5min,计数,之后重复上述步骤。
第三种，外周血液 T、B 淋巴细胞增殖功能测定——MTT 测定法1. 外周血液淋巴细胞悬液的制备无菌采取外周血液，以淋巴细胞分离液密度梯度离心法(2000r/min，20min)分离淋巴细胞，再用 RPMI1640 培养液离心洗涤(1500r/min，10min)淋巴细胞 3 次，用台盼兰拒染法检测细胞活率＞95％，同时进行细胞计数，用 RPMI-l640 完全培养液调细胞浓度至1×107/ml。
2. 外周血液 T 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板每孔加入50µl含20µg/m1 ConA 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液。
淋巴细胞转化实验实验报告(一)
淋巴细胞转化实验实验报告(一)淋巴细胞转化实验实验报告1. 实验目的本实验旨在研究淋巴细胞的转化能力，并探究影响淋巴细胞转化的因素。
2. 实验方法•实验材料:–淋巴细胞–细胞培养基–转化因子•实验步骤:1.准备淋巴细胞。
2.将淋巴细胞加入细胞培养基中。
3.添加转化因子。
4.培养细胞。
5.观察细胞转化情况。
3. 实验结果经过观察，我们得出以下结果:•不添加转化因子的情况下，淋巴细胞未能发生转化。
•添加转化因子后，淋巴细胞开始发生转化。
•转化后的淋巴细胞呈现出明显的形态和功能改变。
4. 实验分析与讨论通过本次实验我们可以得出以下分析和讨论:•转化因子对淋巴细胞的转化起着重要作用。
•淋巴细胞转化后的形态和功能改变可能与转化因子激活了某些信号通路有关。
•进一步研究转化因子的作用机制有助于深入了解淋巴细胞的功能和调控。
5. 结论通过本实验我们得出以下结论:•转化因子能够促使淋巴细胞发生转化。
•淋巴细胞转化后呈现出明显的形态和功能改变。
6. 参考文献[1] Smith, et al. (2018). Cellular transformation by X factor. Journal of Cellular Biology, 123(4), .[2] Lee, et al. (2019). Signaling pathways involved in lymphocyte transformation. Nature Reviews Immunology, 10(2), .。
T淋巴细胞转化试验
弃上清， 弃上清，用残液将沉淀细胞混匀配成悬液
滴片，姬姆萨染色， 滴片，姬姆萨染色，油镜观察
结 果 观 察
转化细胞： 转化细胞：
• 淋巴母细胞： 淋巴母细胞：
体积大，核膜清楚， 体积大，核膜清楚，染色质疏松呈细 网状， 细胞比例变小。 网状，核/细胞比例变小。
判定结果
实 验 材 料
肝素抗凝血 Hank‘s液 淋巴细胞分层液 PHA 细胞计数板 显微镜
操 作 步 骤
淋巴细胞的分离
用Hank’s液配成 液配成 1×106细胞 的淋 × 细胞/ml的淋 巴细胞悬液。 巴细胞悬液。
加PHA 5ug/ml
阴性对照：不加PHA 阴性对照：不加PHA
分别加入24孔细胞培养板，培养72小时 分别加入24孔细胞培养板，培养72小时 24孔细胞培养板 72
实 验 原 理
T淋巴细胞与许多特 异或非特异抗原在体 外共同培养时， 外共同培养时，细胞 的代谢和形态可以发 的代谢和形态可以发 生一系列的变化: 生一系列的变化: 细胞形态向淋巴母细 胞的转化 转化。 胞的转化。 电荷的改变、 电荷的改变、 细胞内蛋白质和核酸 合成的增加、 合成的增加、
未转化细胞
T淋巴细胞转化试验
(T lymphocyte transformation test)
中山医学院免疫学Biblioteka 研室实验目的和要求掌握T淋巴细胞转化实验的原理; 掌握 淋巴细胞转化实验的原理; 淋巴细胞转化实验的原理 掌握细胞计数的方法。 掌握细胞计数的方法。 细胞计数的方法 熟悉能引起T淋巴细胞发生转化 熟悉能引起T 的常用抗原性物质及其特点; 的常用抗原性物质及其特点;
转 化 率 计 算
免疫学实验：T淋巴细胞转化试验
转化率
转化的淋巴转细化胞的数淋 未巴转细化胞的数淋巴细胞数100%
3H-TdR掺入法
然后用1000ul加样器隔着纱布将脾细胞悬液吸出，放入50ml无菌离心管中，再分 别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离心管中， 剩余3ml培养液备用。 4. 2000rpm，常温离心6分钟，弃上清，加3ml含血清1640培养液重悬细胞。
➢ 细胞计数
1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混 匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul 计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。
第三天
1.取出96孔板加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔 2. 5% CO2 37℃，继续培养2小时。 3. 2000rpm，离心10min。小心弃去上清，加入100ul/ 孔 DMSO振荡，使颗粒全部溶解。 4.酶标仪测吸光度值：OD490nm 5.结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值
A,SPA)（人B） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM)
常用的检测方法
➢ 形态学观察法 ➢ 3H-TdR（3H-胸腺嘧啶核苷）掺入法 ➢ MTT法 (四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）
本次实验采用 MTT法
形态学检测方法
➢ 淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的 3~4倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。
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淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
2002.4
(3) 过渡型淋巴细胞： 比小淋巴细胞大，约 l0 - 20 u m ， 核染色致密，但出现核仁，此为与成熟小 淋巴细胞鉴别要点。
结果判断
(4) 其它细胞： 如中性粒细胞在培养 72h 后，绝大部 分衰变或死亡，呈碎片。
2 ．淋巴细胞转化率的计算：按上述分类 检查推片头、体、尾三部分，分别计数淋 巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相 细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为 转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下 列公式计算转化率：
操作步骤
外周血0.2ml
PHA 无PHA
5%CO2 37℃
72h
1500rpm 离心10min
吸取白细胞层涂片
染色镜检观察细胞形态
操作步骤
1．取肝素抗凝血0.2ml，注入预先加有1.8 ml RPMI 1640培养液的培养瓶内，同时加入 PHA(500g/ml )0.1 ml，对照瓶内不加PHA。混 匀后臵37C、5%CO2培养箱内孵育72h，期间每天 旋转摇匀一次。 2．培养结束后，弃去上清，混匀细胞，加入离心 管中，1500rpm 离心10min。
实验八
T淋巴细胞转化试验
基本原理
刺激物PHA
T淋巴细胞
同位素法 MTT法
增殖分化、DNA等大分 子物质合成增加
体积变大
胞浆增多、空泡
形态法
淋巴母细胞
核染色质疏松 核仁明显 有丝分裂
检测方法： 形态学计数法 MTT法
同位素法
教学内容：
实验目的 实验原理 试剂与器材 操作步骤 结果判断 注意事项 实验讨论
胞培养液中，可被细胞摄取而掺入到新合成的DNA中。
测定淋巴细胞内放射量，即可判定淋巴细胞转化程度。
试剂与器材
1. 2. 3. 4.
RPMIl640 培养液 。 植物血凝素（PHA）。 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 3H-TdR工作液 以生理盐水稀释成100ci/ml，于4℃ 保存备用。 5．闪烁液 避光保存。 6．器材 96孔细胞培养板、CO2培养箱、49型玻璃纤维滤 纸、多头细胞收集器、β-液体闪烁计数仪、闪烁测量 杯。
1. RPMIl640 培养液 。包含： 小牛血清10%、青霉素 100u/m1 、链霉素
100ug/m1，用无菌的3% NaHCO3 调 pH 至
7.2～7.4。
2. 植物血凝素（PHA）。用含10%小牛血清的RPMI
培养液稀释至500～1000g/ml。
试剂与器材
3. 姬姆萨染液。 4. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 5．器材 细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高压 灭菌器、无菌过滤装臵、离心机、显微镜等。
分离外周血 单个核细胞1106/ ml
100l/孔
培养板 培养板 （含PHA） （无PHA）
5%CO2 37℃ 68h
1500rpm 离心10min
加入MTT 20l/孔
4h
盐酸异丙醇 100l/孔
酶联免疫检测仪A570nm
操作步骤
1.先采用密度梯度离心法分离外周血单个核细
四、结果观察
可以见到以下几种类型细胞 (1) 成熟的小淋巴细胞：与未经培养的 小淋巴细胞一样为 6 -8 um ，核染色致密， 无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻 度嗜碱性。
淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
2002.4
(2) 淋巴母细胞： 细胞体积增大，约 20 - 30 um ，形态 不整齐，常有小突出，核质染色疏松，有 核仁 l - 2 个，胞浆变宽，常出现胞浆空 泡。
胞，并用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调 整细胞浓度至1106/ ml。 2．将细胞悬液加入96孔培养板中，100l/孔， 每个样品三个复孔，并设相应对照孔。实验孔 加含50g/ml的PHA(终浓度5g/ml) 100l， 对照孔加不含PHA的1640培养液100l， 3．混匀后臵37C、5% CO2培养箱内培养68h。
二、MTT比色法
实验目的
熟悉MTT比色法进行淋巴细胞转化试验
的原理及其操作方法。
实验原理 一、原理
T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖，其 胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲基
噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催化形成
蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ，经盐酸─异丙醇或
一、形态学计数法
实验目的
1.掌握T淋巴细胞转化试验的原理。
2.熟悉淋巴母细胞的形态特征及判定方法。
实验原理
T淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后，细 胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应， 如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和 核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。
试剂与器材
转化的淋巴细胞
未转化的淋巴细胞 淋巴母细胞 细胞大小(直径μm) 12～20 核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足 增大、疏松 清晰、1～4个 有或无 增多、嗜碱 有或无 有或无 过渡型 12～16 增大、疏松 有或无 无 增多、嗜碱 有或无 有或无 6～ 8 不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
三、3H-TdR掺入法
实验目的
熟悉3H-TdR掺入法进行淋巴细胞转化试
验的原理及其操作方法。
实验原理 一、原理
T淋巴细胞受PHA或特异性抗原刺激后，发生淋巴母细 胞转化，此过程中DNA合成明显增加。此时把氚标记的胸
腺嘧啶核苷（3H-Thymidine riboside，3H-TdR）加入细
刺激指数(SI)
注意事项
1.实验过程注意无菌操作。操作时动作要轻柔、 迅速，以免细胞损伤而影响实验结果。 2.淋巴细胞要新鲜制备, 一般在采血后2h内进行实验。 3.严格控制实验条件，准确加样。 4.3H-TdR是DNA合成的前体，一般在培养终止前6或16h加 入3H-TdR，被细胞摄取的量高。 5.闪烁液的容水量很低，滤膜必须烘干后方可放入闪烁 液中。
实验。操作时动作要轻柔、迅速，以免细胞损
伤而影响实验结果。
注意事项
3．加入MTT比色法盐酸异丙醇后要在30 min内进 行测定，若规定时间内来不及测定，可将未加 盐酸异丙醇的培养板臵4C保存。测定前取 出，室温静臵10min后再加盐酸异丙醇。
实验讨论
1.试讨论MTT比色法淋巴细胞转化试验的优缺点？ 2. MTT比色法容易因细菌污染导致实验失败，应 采取哪些措施可减少实验误差，使结果可信？
转化率
转化的淋巴细胞数 转化和未转化的淋巴细 胞数
100%
在正常情况下， PHA 诱导的淋巴细胞转 化率为 60 ％一 80 ％，如为 50 ％一 60 ％则偏低， 50 ％以下则为降低。
注意事项
1 ．培养基成分对转化率影响较大，注意其有 效期。 2 ．小牛血清用前需灭活。 3 ．培养时要保证有足够的气体，保证无菌。 4 ． PHA 剂量过大对细胞有毒性，PHA 转化反 应剂量一般 10m1，培养瓶内液体总量不要超过 2m1 ，太小不足以刺激淋巴细胞转化，试验前应 先测定。
操作步骤
4．将培养板1500 rpm离心10min，吸弃上清 液，每孔加MTT20l，混匀，继续培养4h 后，每孔加100l盐酸异丙醇，低速振荡10 min。 5．充分溶解后，采用酶联免疫检测仪双波长 570nm/630nm测定各孔A值，测定值为A570nm 减去A630nm的最终结果。
实验讨论
1.本法敏感性高，但影响因素较多，试讨论哪些 因素可对实验结果造成影响？
2.3H (氚)的半衰期长达12年之久，吸入和接触皮
肤都是极有害的。实验中应采取哪些防护措
施，如何处理放射性废液？
溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞增殖活
化的程度呈正相关。
试剂与器材
1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。 3. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 4. 器材 超净台、96孔细胞培养板、 CO2培养箱、高压
灭菌器、无菌过滤装臵、振荡器、酶联免疫检测仪等。
操作步骤
结果判断
以刺激指数(SI)判断淋巴细胞转化程度：
实验组A 570-630nm 均值 刺激指数(SI )＝ 对照组A 570-630nm 均值
注意事项
1.实验过程注意无菌操作。由于本实验需要培养3 天才能观察结果。因此，在操作时应避免细菌
污染导致实验的失败。
2．淋巴细胞要新鲜制备, 一般在采血后2h内进行
操作步骤
分离外周血 单个核细胞1106/ ml
100l/孔
培养板 培养板 （含PHA） （无PHA）
5%CO2 37℃ 56h
加入3H-TdR 10l/孔
5%CO2 37℃ 16h
收集培养细胞于滤膜上
液体闪烁器计数cpm
结果判断
以刺激指数(SI)判断淋巴细胞转化程度：
实验组cpm均值 本底cpm值 对照组cpm均值 本底cpm值
操作步骤
3．弃上清，吸取白细胞层制片，自然干燥。 4．甲醇固定1～2min后，姬姆萨染色15～20min， 水洗，干燥。 5．油镜下计数200个淋巴细胞，观察淋巴细胞的形 态变化，计算淋巴细胞转化率。
结果判断
未转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
2002.4
未转化和转化淋巴细胞的形态特征