T淋巴细胞转化试验步骤及注意事项
淋巴细胞转化试验(MTT)
一、淋巴细胞转化试验（MTT）（一）原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。
当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。
（二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。
用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。
丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原（三）方法：1、脾细胞制备：（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。
放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。
取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。
调整细胞浓度为5 105/ml。
②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
《淋巴细胞转化实验》课件
实验操作技巧
01
技巧三：减少误差来源
02
尽量使用同批次和同质量的试剂进行实验，以减少误差来源。
03
在实验过程中保持一致的操作方法，避免人为误差的产生。
04 实验结果分析
实验结果展示
淋巴细胞转化率
通过显微镜观察，记录不同时间段淋巴细胞 的形态变化，计算淋巴细胞转化率。
细胞形态学观察
细胞增殖数量
采用细胞计数法，统计增殖的淋巴细胞数量 ，并计算增殖倍数。
实验的局限性与改进方向
局限性
实验结果可能受到样本来源、实验条 件等因素的影响，导致一定的误差。
改进方向
进一步优化实验方案，提高实验的准 确性和可重复性；扩大样本量，增加 代表性；探索更多淋巴细胞转化相关 的机制和影响因素。
谢谢聆听
实验操作前的准备
实验场地消毒：确保无菌环 境
实验器材清洗和灭菌：确保 无污染
实验试剂配制：根据需要配 制适量的培养基和试剂
动物处理：麻醉、取材等操 作需严格遵循动物伦理要求
03 实验操作过程
实验操作流程
步骤一：准备试剂和器材 准备淋巴细胞分离液、培养基、离心管、移液管等。
确保所有试剂和器材在实验前已进行消毒处理。
《淋巴细胞转化实验 》ppt课件
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ录
• 实验概述 • 实验材料 • 实验操作过程 • 实验结果分析 • 实验结论
01
实验概述
实验目的
验证淋巴细胞在抗原 刺激下的转化现象。
探究淋巴细胞转化与 疾病发生、发展的关 系。
了解淋巴细胞在免疫 应答中的作用。
实验原理
01
淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有识别抗原 、增殖分化和产生免疫应答的能力。
淋巴细胞转化实验实验报告(一)
淋巴细胞转化实验实验报告(一)淋巴细胞转化实验实验报告1. 实验目的本实验旨在研究淋巴细胞的转化能力，并探究影响淋巴细胞转化的因素。
2. 实验方法•实验材料:–淋巴细胞–细胞培养基–转化因子•实验步骤:1.准备淋巴细胞。
2.将淋巴细胞加入细胞培养基中。
3.添加转化因子。
4.培养细胞。
5.观察细胞转化情况。
3. 实验结果经过观察，我们得出以下结果:•不添加转化因子的情况下，淋巴细胞未能发生转化。
•添加转化因子后，淋巴细胞开始发生转化。
•转化后的淋巴细胞呈现出明显的形态和功能改变。
4. 实验分析与讨论通过本次实验我们可以得出以下分析和讨论:•转化因子对淋巴细胞的转化起着重要作用。
•淋巴细胞转化后的形态和功能改变可能与转化因子激活了某些信号通路有关。
•进一步研究转化因子的作用机制有助于深入了解淋巴细胞的功能和调控。
5. 结论通过本实验我们得出以下结论:•转化因子能够促使淋巴细胞发生转化。
•淋巴细胞转化后呈现出明显的形态和功能改变。
6. 参考文献[1] Smith, et al. (2018). Cellular transformation by X factor. Journal of Cellular Biology, 123(4), .[2] Lee, et al. (2019). Signaling pathways involved in lymphocyte transformation. Nature Reviews Immunology, 10(2), .。
T淋巴细胞转化试验
弃上清， 弃上清，用残液将沉淀细胞混匀配成悬液
滴片，姬姆萨染色， 滴片，姬姆萨染色，油镜观察
结 果 观 察
转化细胞： 转化细胞：
• 淋巴母细胞： 淋巴母细胞：
体积大，核膜清楚， 体积大，核膜清楚，染色质疏松呈细 网状， 细胞比例变小。 网状，核/细胞比例变小。
判定结果
实 验 材 料
肝素抗凝血 Hank‘s液 淋巴细胞分层液 PHA 细胞计数板 显微镜
操 作 步 骤
淋巴细胞的分离
用Hank’s液配成 液配成 1×106细胞 的淋 × 细胞/ml的淋 巴细胞悬液。 巴细胞悬液。
加PHA 5ug/ml
阴性对照：不加PHA 阴性对照：不加PHA
分别加入24孔细胞培养板，培养72小时 分别加入24孔细胞培养板，培养72小时 24孔细胞培养板 72
实 验 原 理
T淋巴细胞与许多特 异或非特异抗原在体 外共同培养时， 外共同培养时，细胞 的代谢和形态可以发 的代谢和形态可以发 生一系列的变化: 生一系列的变化: 细胞形态向淋巴母细 胞的转化 转化。 胞的转化。 电荷的改变、 电荷的改变、 细胞内蛋白质和核酸 合成的增加、 合成的增加、
未转化细胞
T淋巴细胞转化试验
(T lymphocyte transformation test)
中山医学院免疫学Biblioteka 研室实验目的和要求掌握T淋巴细胞转化实验的原理; 掌握 淋巴细胞转化实验的原理; 淋巴细胞转化实验的原理 掌握细胞计数的方法。 掌握细胞计数的方法。 细胞计数的方法 熟悉能引起T淋巴细胞发生转化 熟悉能引起T 的常用抗原性物质及其特点; 的常用抗原性物质及其特点;
转 化 率 计 算
免疫学实验：T淋巴细胞转化试验
转化率
转化的淋巴转细化胞的数淋 未巴转细化胞的数淋巴细胞数100%
3H-TdR掺入法
然后用1000ul加样器隔着纱布将脾细胞悬液吸出，放入50ml无菌离心管中，再分 别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离心管中， 剩余3ml培养液备用。 4. 2000rpm，常温离心6分钟，弃上清，加3ml含血清1640培养液重悬细胞。
➢ 细胞计数
1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混 匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul 计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。
第三天
1.取出96孔板加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔 2. 5% CO2 37℃，继续培养2小时。 3. 2000rpm，离心10min。小心弃去上清，加入100ul/ 孔 DMSO振荡，使颗粒全部溶解。 4.酶标仪测吸光度值：OD490nm 5.结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值
A,SPA)（人B） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM)
常用的检测方法
➢ 形态学观察法 ➢ 3H-TdR（3H-胸腺嘧啶核苷）掺入法 ➢ MTT法 (四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）
本次实验采用 MTT法
形态学检测方法
➢ 淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的 3~4倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。
t淋巴细胞转化实验报告
t淋巴细胞转化实验报告猪淋巴细胞转化实验猪淋巴细胞转化实验1.采集抗凝血每个10ml注射器吸入100ul肝素钠抗凝剂（20mg/ml），每个样品无菌采血5-8ml。
（保存在4°环境，从猪场回来最好放在冰盒中）2、淋巴细胞分离，采集的肝素抗凝外周血液（肝素用量20U/mL），可采用以下方法进行分离。
（1）Ficoll-Comray（聚蔗糖——泛影钠）分离淋巴细胞法：用10毫升的试管，加入4毫升淋巴细胞分离液（比重介于1.0-1.090之间），在这种分层液的界面上，轻轻加入4毫升左右肝素化的血液，千万不要打乱两液间的液面。
然后用1500rpm，离心15分钟。
此时即可见到液体分为四层。
最下层是红细胞和粒细胞，分层液在它的上层，最上层是血浆层。
淋巴细胞在血浆层和分层液之间，淋巴细胞多时，可呈现一层乳白层。
用移液器直接插入淋巴细胞分层液吸取淋巴细胞 1.5mlEP管中，充分混匀，2000rpm离心10分钟，弃去上清，即获得纯淋巴细胞，可加入适量HanK’S液进行计数，应用浓度为1-2×106/mL，每份需用1毫升。
（2）红细胞裂解法用10毫升的试管加入8ml的Tris-MH4C1红细胞裂解液，然后加入2-4ml抗凝血，室温放置20min（每各5min上下缓慢摇匀一次），后1500rpm离心10min，弃掉上清，用HanK’S液混悬细胞进行计数（如果红细胞很多，可以再用5ml裂解液裂解一次）。
应用浓度为1-2×106/mL，每份需用1毫升。
3.流式细胞仪检测CD3/CD4/CD8步骤待血液样品和灌注液样品都计数完毕后，吸取一定体积含有106的细胞悬液，1500rmp离心3min，弃掉上清液，加入用PBS混匀的含有CD3/CD4/CD8混合抗体的反应液80ul，混匀后4℃反应30min。
待反应过后，1500rmp离心3min，用100ul移液器吸弃上清，然后加入0.5ml含有1-2%胎牛血清的PBS液，混合均匀，1500rmp离心3min，后用100ul移液器吸弃上清。
t淋巴细胞转化实验报告
t淋巴细胞转化实验报告淋巴细胞转化实验是一种体外培养方法，用于研究免疫细胞对不同物质的反应，包括抗原、细菌、病毒等。
本实验采用人体外周血淋巴细胞作为材料，通过添加激动剂使其转化为体外培养的淋巴母细胞，然后进行免疫学研究。
本报告将对本实验的过程和结果进行描述和分析。
实验步骤1.收集外周血从正常成年人的静脉血收集外周血，将其分装到离心管中。
用 PBS 冲洗红细胞，使淋巴细胞纯化后采集上清液。
2.细胞数计数采用血细胞盘进行计数，每个实验需要约 4-6万个淋巴细胞，取相应数量的细胞用1640 培养基含有 10% 胎牛血清的细胞密度中稀释。
3.淋巴细胞培养将稀释的淋巴细胞在细胞密度2 × 10^5/ml 的情况下播种在 96 或 48 孔板的深孔中，然后加入不同的激动剂，如激活剂、抑制剂、细胞因子等，同时添加乙酰溴芬酸作为负对照组。
4.腺病毒载体转染在淋巴细胞培养的第 2，3 天，加入适量的腺病毒载体（MOI 为 50），接种24 h 后用媒介液冲洗并更换新的培养液，然后让细胞继续培养。
5.淋巴细胞功能检测对于 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞，通过检测它们的增殖和检测分泌的细胞因子的表达来评估激动剂的效应。
在体外转化过程中，通过荧光PCR技术检测核因子-κB 和JAK/STAT 信号通路的激活。
实验结果本实验采用血细胞盘计数，每个实验需要约 4-6 万个淋巴细胞。
将这些细胞培养在96 或 48 孔板的深孔中，添加不同的激动剂，保持在合适的细胞密度。
添加适当的激动剂，可以在淋巴细胞转化的过程中发现一系列的细胞反应，如细胞增殖，细胞因子的分泌等。
实验分析本实验是一项重要的免疫学研究方法，可以用于检测免疫细胞（如 T 细胞、B 细胞、NK 细胞）对外来物质的反应。
适当地添加激动剂，可以诱导免疫细胞在体外转化成淋巴母细胞，从而在体外模拟免疫反应过程。
在本实验中，采用了血细胞盘计数，这是一种传统的细胞计数方式。
T淋巴细胞转化实验 ppt课件
T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖， 其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲 基噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催 化形成蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ，经盐酸─异 丙醇或溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞 增殖活化的程度呈正相关。
ppt课件
31
试剂与器材
1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。
ppt课件
8
试剂与器材
3. 姬姆萨染液。 4. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 5．器材 细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高
压灭菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。
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9
操作步骤
外周血0.2ml
PHA
无PHA
5%CO2 37℃ 72h 1500rpm 离心10min
吸取白细胞层涂片ppt课件24 2 ．淋巴细胞转化率的计算：按上述分类检查推片头、体、尾三部 分，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞以及 成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞， 按下列公式计算转化率：
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25
转化率
转化的淋巴细胞数 转化和未转化的淋巴细
胞数
100%
15
四、结果观察
可以见到以下几种类型细胞 (1) 成熟的小淋巴细胞：与未经培养的小淋巴细胞一样为 6 -8
um ，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱 性。
ppt课件
16
ppt课件
17
淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
2002.4
(2) 淋巴母细胞：
细胞体积增大，约 20 - 30 um ，形态不整齐，常有小突出，核 质染色疏松，有核仁 l - 2 个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。
T淋巴细胞转化实验
试剂与器材
1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。 3. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 4. 器材 超净台、96孔细胞培养板、 CO2培养箱、高压
灭菌器、无菌过滤装置、振荡器、酶联免疫检测仪等。
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操作步骤
分离外周血
100l/孔
单个核细胞1106/ ml
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操作步骤
分离外周血
100l/孔
单个核细胞1106/ ml
培养板 培养板 （含PHA） （无PHA）
5%CO2 37℃ 56h
加入3H-TdR 10l/孔
5%CO2 37℃ 16h
收集培养细胞于滤膜上
液体闪烁器计数cpm
结果判断
以刺激指数(SI)判断淋巴细胞转化程度：
刺激 (S 指 I实 对 ) 数 验 照 c cp p 均 均 m m 组 组 值 本 值 本 c c底 底 p p 值 值 m m
应剂量一般 10m1，培养瓶内液体总量不要超过 2m1 ，太小不足以刺激淋巴细胞转化，试验前应 先测定。
二、MTT比色法
实验目的
熟悉MTT比色法进行淋巴细胞转化试验 的原理及其操作方法。
实一验、原原理 理
T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖，其 胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲基 噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催化形成 蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ，经盐酸─异丙醇或 溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞增殖活 化的程度呈正相关。
采取哪些措施可减少实验误差，使结果可信？
三、3H-TdR掺入法
实验目的
熟悉3H-TdR掺入法进行淋巴细胞转化试 验的原理及其操作方法。
淋巴细胞转化实验报告
淋巴细胞转化实验报告淋巴细胞转化实验报告淋巴细胞转化实验是一种常用的细胞实验技术，用于研究淋巴细胞的功能和活性。
本实验旨在通过观察淋巴细胞的转化反应，探索其在免疫应答中的作用和机制。
实验结果对于理解免疫系统的功能和疾病发生机制具有重要意义。
实验方法：1. 实验材料准备：- 淋巴细胞：从小鼠或人类外周血中分离得到。
- 淋巴细胞培养基：含有适当的营养物质和生长因子，维持细胞的生长和活性。
- 合适的培养器具：离心管、培养皿等。
- 激活剂：例如PHA（植物血凝素）、ConA（凝集素A）等。
2. 实验步骤：- 收集外周血样本，离心分离淋巴细胞。
- 将淋巴细胞悬浮于培养基中，调整细胞密度。
- 在不同培养皿中分别加入激活剂和对照组，培养一定时间。
- 观察细胞形态变化和增殖情况。
- 使用流式细胞仪等技术，检测细胞表面标记物的表达情况。
实验结果：在实验中，我们观察到淋巴细胞在激活剂的刺激下发生了明显的转化反应。
在对照组中，淋巴细胞维持了原有的形态和数量，没有明显的增殖现象。
而在激活剂处理组中，淋巴细胞开始发生形态的改变，变得更加圆润和大型。
同时，细胞数量也明显增加，显示出细胞的增殖能力。
进一步的实验结果显示，激活剂处理组中的淋巴细胞表面标记物的表达发生了变化。
一些免疫相关的分子，如CD4、CD8等，表达量明显上调。
这表明淋巴细胞在转化过程中发生了细胞表型的改变，可能与其免疫功能的调节有关。
讨论与意义：淋巴细胞转化实验是研究免疫应答的重要手段之一。
通过观察淋巴细胞的转化反应，我们可以了解其在免疫系统中的作用和机制。
淋巴细胞转化是免疫应答的重要步骤之一，它参与了抗原识别、T细胞活化、细胞毒性和细胞介导的免疫应答等过程。
本实验结果的发现对于理解免疫系统的功能和疾病发生机制具有重要意义。
淋巴细胞的转化过程是免疫应答的关键环节，它与炎症、自身免疫疾病、感染性疾病等疾病的发生和发展密切相关。
通过研究淋巴细胞的转化反应，我们可以深入了解免疫系统在疾病中的作用，为临床治疗和疾病预防提供新的思路和方法。
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淋巴增殖实验:
第一种，取外周血和脾脏分离淋巴细胞用于淋巴增殖实验,具体步骤如下
⑴雏鸡翅下釆血2mL,加入1mL抗凝血和1mLPBS的混合液,混合均匀后,缓缓加入装有2mL淋巴细胞分离液的无菌透明的大离心管中,不要摇晃,注意血液与淋巴细胞分离液不要混合,2000rpm,离心20min,可以看见中间有层白色雾状白细胞,吸取白细胞至2inL离心管中,2000rpm离心5min取沉淀;
(2)向离心管中加入1mL 1640清洗2遍,2000rpm离心5min取沉淀;
⑶将沉淀悬于1mL DMEM,细胞计数板计数,取 1 xlO7个细胞悬于ImLPBS中,置于37°C培养箱中用CFSE (终浓度2gM)避光染色lOmin,每隔2-3min上下颠倒一次;
(4)DMEM洗漆细胞2次,每次1mL,2000rpm离心6-7min;
(5)悬于1mL DMEM 中;
(6)取5xl05个细胞置于96孔板,同时加入20μ30μg/m的Con
A,DMEM补齐至200μL,4℃二氧化碳培养箱诱导3d;
(7)流式专用buffer洗涤2次,2000r离心5min,200μbuffer悬起,流式细胞仪检测。
取1小块脾脏加入1mL 1640研磨,脾脏细胞先用200μL红细胞裂解液作用5min,2000rpm离心5min,计数,之后重复上述步骤。
第三种，外周血液 T、B 淋巴细胞增殖功能测定——MTT 测定法
1. 外周血液淋巴细胞悬液的制备无菌采取外周血液，以淋巴细胞分离液密度梯度离心法(2000r/min，20min)分离淋巴细胞，再用 RPMI1640 培养液离心洗涤(1500r/min，10min)淋巴细胞 3 次，用台盼兰拒染法检测细胞活率＞95％，同时进行细胞计数，用 RPMI-l640 完全培养液调细胞浓度至1×107/ml。
2. 外周血液 T 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板每孔加入50µl含20µg/m1 ConA 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液。
向每孔中加入淋巴细胞悬液50µl，培养物总体积为100µl，细胞终浓度为 0.5×107/m1，Con A 终浓度为10µg/m1，设 3 重复孔。
细胞置 40℃、％CO2、饱和湿度条件下培养 21h。
每孔加 5mg/m1MTT 溶液10µl，继续培养3h 后，加入100µl DMSO溶液，置于37℃培养箱恒温作用 15min，取出后用酶联免疫检测仪检测，以空白对照孔调零，检测 590nm 波长下的吸光度值（A590nm），结果以 3 重复孔平均值表示。
3. 外周血液 B 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板中每孔加入50µl 含10µg/m1LPS 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液50µl，设 3 重复孔。
每孔中
再加入淋巴细胞悬液50µl，细胞终浓度为 0.5×107/m1，LPS 终浓度为5µg/m1。
置于 40℃、5％CO2饱和湿度条件下培养21h，加入 5mg/ml MTT 溶液10µl。
继续培养 3h 后，每孔加100µl DMSO，置于 37℃恒温培养箱作用 15min，取出后用酶联免疫检测仪检测，以对照孔调零，检测 590nm波长下的吸光度值（A590nm），结果以 3 重复孔平均值表示。