T淋巴细胞转化试验步骤及注意事项

淋巴增殖实验:

第一种，取外周血和脾脏分离淋巴细胞用于淋巴增殖实验,具体步骤如下

⑴雏鸡翅下釆血2mL,加入1mL抗凝血和1mLPBS的混合液,混合均匀后,缓缓加入装有2mL淋巴细胞分离液的无菌透明的大离心管中,不要摇晃,注意血液与淋巴细胞分离液不要混合,2000rpm,离心20min,可以看见中间有层白色雾状白细胞,吸取白细胞至2inL离心管中,2000rpm离心5min取沉淀;

(2)向离心管中加入1mL 1640清洗2遍,2000rpm离心5min取沉淀;

⑶将沉淀悬于1mL DMEM,细胞计数板计数,取 1 xlO7个细胞悬于ImLPBS中,置于37°C培养箱中用CFSE (终浓度2gM)避光染色lOmin,每隔2-3min上下颠倒一次;

(4)DMEM洗漆细胞2次,每次1mL,2000rpm离心6-7min;

(5)悬于1mL DMEM 中;

(6)取5xl05个细胞置于96孔板,同时加入20μ30μg/m的Con

A,DMEM补齐至200μL,4℃二氧化碳培养箱诱导3d;

(7)流式专用buffer洗涤2次,2000r离心5min,200μbuffer悬起,流式细胞仪检测。

取1小块脾脏加入1mL 1640研磨,脾脏细胞先用200μL红细胞裂解液作用5min,2000rpm离心5min,计数,之后重复上述步骤。

第三种，外周血液 T、B 淋巴细胞增殖功能测定——MTT 测定法

1. 外周血液淋巴细胞悬液的制备无菌采取外周血液，以淋巴细胞分离液密度梯度离心法(2000r/min，20min)分离淋巴细胞，再用 RPMI1640 培养液离心洗涤(1500r/min，10min)淋巴细胞 3 次，用台盼兰拒染法检测细胞活率＞95％，同时进行细胞计数，用 RPMI-l640 完全培养液调细胞浓度至1×107/ml。

2. 外周血液 T 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板每孔加入50µl含20µg/m1 ConA 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液。向每孔中加入淋巴细胞悬液50µl，培养物总体积为100µl，细胞终浓度为 0.5×107/m1，Con A 终浓度为10µg/m1，设 3 重复孔。细胞置 40℃、％CO2、饱和湿度条件下培养 21h。每孔加 5mg/m1MTT 溶液10µl，继续培养3h 后，加入100µl DMSO溶液，置于37℃培养箱恒温作用 15min，取出后用酶联免疫检测仪检测，以空白对照孔调零，检测 590nm 波长下的吸光度值（A590nm），结果以 3 重复孔平均值表示。

3. 外周血液 B 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板中每孔加入50µl 含10µg/m1LPS 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液50µl，设 3 重复孔。每孔中

再加入淋巴细胞悬液50µl，细胞终浓度为 0.5×107/m1，LPS 终浓度为5µg/m1。置于 40℃、5％CO2饱和湿度条件下培养21h，加入 5mg/ml MTT 溶液10µl。继续培养 3h 后，每孔加100µl DMSO，置于 37℃恒温培养箱作用 15min，取出后用酶联免疫检测仪检测，以对照孔调零，检测 590nm波长下的吸光度值（A590nm），结果以 3 重复孔平均值表示。