淋巴细胞转化试验(MTT)

一、淋巴细胞转化试验（MTT）

（一）原理：

四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。

（二）材料：

MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原

（三）方法：

1、脾细胞制备：

（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；

（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；

（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；

（4）制备脾细胞悬液

①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。调整细胞浓度为

5 105/ml。

②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入

离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；

③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。

注：①一般6～8周龄小鼠，根据品系不同，可得5～20×107细胞/只小鼠；

②手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械，在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌，此法较为简便。

2、淋巴细胞增殖反应：

将5 105/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200ul/孔，每一份脾细胞悬液分装3n个孔，3（n-1）孔加ConA(5ug/mL)，另3个孔不加ConA作为对照。置5％ CO2，37℃培养48-72h，在培养结束前4-6小时，于培养板各孔内加入5mg/ml MTT液，10ul/孔。37℃培养4-6小时。

4. 1000g离心10分钟弃上清，各孔内加入150μlDMSO，溶解10min，30分钟内（或加2%SDS 100ul/孔，过夜。，或干燥后，各孔内加入0.01M盐酸—异丙醇100ul）用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。

实验结果

将实验组和对照组三个复孔的OD值平均。

转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。

注意事项

（1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。

（2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果。

二、LAK/TIL细胞的制备与活性测定：

淋巴因子激活的细胞毒性细胞（lymphokine activated killer，LAK)和肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)在机体的免疫防御中起着十分重要的作用，特别是在肿瘤免疫过继疗法中具有重要的应用前景，其制备及活性的检测对于评价机体的免疫状态具有重要的意义。以下主要介绍LAK/TIL制备的常规方法。

(一)主要试剂材料

1.试剂①IL-2；②RPMI-1640；③Ⅰ、Ⅳ型胶原酶，DNA酶；④四甲基偶氮盐；⑤酸化异丙醇：含0.04mo1/L HC1的异丙醇；⑥96孔细胞培养板。

2.肿瘤细胞系Raji细胞、Daudi细胞为B细胞性白血病细胞株；Molt-4为T细胞性白血病细胞，对LAK细胞敏感，而对NK细胞毒作用不敏感；K562为红白血病细胞株，对NK细胞毒作用敏感。所有细胞株均培养在含10%~20% NCS的RPMI-1640完全培养液中，取对数生长期细胞经不完全培养液洗涤，台盼蓝染色计数，以含20% NCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×106/ml备用。

(二)外周血单个核细胞( PBMC )的制备及其LAK细胞的诱导

(1)肝素抗凝健康人静脉血通过Ficoll-泛影葡胺密度梯度离心法分离PBMC，用含20% NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106/ml。

(2)将上述细胞加人24孔培养板孔中，同时加人60ug PHA ，rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37℃，5 % CO2条件下培养，2~3d换液一次。吸弃1/2上清，加入含100U/ml的重组人IIr2 20% NCS-RPMI-1640培养液，继续培养3d，收集细胞，即为LAK。

(三)脾细胞的制备及其LAK细胞的体外诱导

将通过灌注去除红细胞后的正常人外伤摘除的脾脏，按常规方法制备成单个脾细胞悬液，经离心洗涤后，用含20 % NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106/ml，加人rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37℃，5%CO2条件下培养，2~3d换液一次。

(四)TIL细胞的分离制备及其诱导

(1)无菌切取肿瘤组织，置于含抗生素的RPMI-1640培养液中。

(2)将瘤体机械法剪碎，用RPMI-1640调整体积为10~ 20m1，同时加人0.05%的Ⅰ、Ⅳ型胶原酶、0.001%的透明质酸酶和DNA酶，室温搅拌4~6h。

(3)依次用80目和200目不锈钢网过滤。

(4)经过滤后的细胞悬液以无血清的RPMI-1640洗2次，1 500r/min离心5~l0min。

(5)用含5 % NCS的RPMI-1640完全培养液重悬细胞，将5ml比重为1.077的100%淋巴细胞分层液加人试管底层，其上缓慢加人75%的淋巴细胞分层液(用