3-HPLC 色谱柱介绍
3 柱色谱技术
A. ion-exchange chromatogram of papain hydrolysate by DEAESephacel anion-exchage chromatography and the elution was performed at 1.3 ml/min of flow rate with a linear NaCl gradient
③吸附剂与流动相（样品）不发生化学 反应； ④吸附剂颗粒直径适宜，一般吸附剂的 粒径为100-200目或200-300目。 吸附剂通常应具备以下特征：对被分离 的物质具有较强的吸附能力、有较高的 吸附选择性、机械强度高、再生容易、 性能稳定、价格低廉。
5.3.2.2常用吸附剂种类
1、活性炭： 含碳原料经碳化和活化后便成为活性炭。 是一类具有吸附性能的碳基物质的总称， 具有多孔结构和很大的比表面。 活性炭性能稳定，抗腐蚀，常用于食品 工业的脱色、脱臭、净化，也用于环境 保护中的三废处理等。
C. RP-HPLC pattern on a C18 column (4.0 ×250 mm) of active fraction Ⅳ-3 eluted on the HPLC. HPLC operation was carried out with a linear CH3CN gradient (0-1.0 M) at 2.5 ml/min of a
5.3.4 吸附色谱的操作程序
吸附色谱法的操作方式有薄层色谱和柱 色谱法。 薄层色谱是将吸附剂均匀铺在玻璃上， 把待分离的样品点在薄层上，然后用合 适的溶剂展开而达到分离、鉴定和定量 的目的。
吸附色谱的柱色谱法是将分离样品均
匀加入到装有吸附剂填料的柱子内， 再以适当的洗脱剂洗脱以达到不同组 分的分离。具体如下：
watershsst3色谱柱说明书
watershsst3色谱柱说明书Waters HSS T3色谱柱是一种高效液相色谱柱，被广泛应用于生命科学、制药、环境和食品分析等领域。
该柱具有优异的分离性能和稳定性，可用于分离复杂的混合物，提供准确和可靠的分析结果。
以下是关于Waters HSS T3色谱柱的详细说明：1. 柱材料：Waters HSS T3色谱柱采用高质量的硅胶材料制成，具有特殊的表面处理，能够提供优异的色谱性能和稳定性。
2. 柱尺寸：Waters HSS T3色谱柱的常见尺寸为4.6mm乘250mm，具有较大的分离能力和样品容量。
此外，还提供其他规格的色谱柱可供选择。
3. 分离性能：Waters HSS T3色谱柱具有极好的分离性能，可有效分离复杂样品中的成分。
其独特的柱底和柱壁结构可以增强样品和柱相之间的相互作用，提高分离效果。
4. 稳定性：Waters HSS T3色谱柱具有出色的稳定性和重现性，可持续运行大量样品分析而不产生漂移或降解。
柱底和柱壁的特殊表面处理使得该色谱柱不易受到污染和损害，有助于保持柱的使用寿命。
5. 应用范围：Waters HSS T3色谱柱广泛适用于各种样品类型的分析，包括有机化合物、天然产物、药物、代谢产物等。
它可用于定量和定性分析，以及结构鉴定和纯化工作。
6. 色谱条件：Waters HSS T3色谱柱适用于反相液相色谱和离子对色谱法。
在反相液相色谱中，可以使用不同的流动相和梯度条件来优化分离效果。
在离子对色谱中，可以添加离子对试剂来改变运行条件。
7. 包装和存储：Waters HSS T3色谱柱以高压不锈钢柱体包装，旨在保护柱底和柱壁免受损坏和污染。
柱体上标有批号和有效期，以便用户能够正确追踪使用日期和有效期限。
该色谱柱应存放在避光、干燥和温度控制的环境中，以确保其质量和性能。
总之，Waters HSS T3色谱柱是一种优质的色谱柱，具有卓越的分离性能和稳定性，适用于各种复杂样品的分析工作。
色谱柱基础知识简介
色谱柱的再生
• 反相柱的再生。采用以甲醇:水=95:5(V/V)，纯甲 醇，二氯甲烷等溶剂作流动相，顺次冲洗，每种 流动相流经色谱柱的量为20一30倍色谱柱体积然 后再以相反顺序冲洗色谱柱。 • 正相柱再生。顺次以正己烷、异丙醇、二氯甲烷、 甲醇作流动相冲洗色谱柱每步注意平衡溶剂的顺 序，不要颠倒每种流动相流经色谱柱的量为20— 30倍柱体积(因异丙醇的粘度较大，冲洗过程中请 随时注意调整冲洗的流速)，用甲醇冲洗完后，再 以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必需 严格脱水。
高效液相色谱柱知识介绍
2013.12
2014-1-6
1
色谱柱的发展现状
• 高效液相色谱(HPLC)是20世纪60年代后期 发展起来的分离分析技术，是现代分离测 定的重要手段。问世以来，因其具有分离 效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能 分析高沸点但不能气化的热不稳定生理活 性物质的特点而被广泛应用于生物化学、 药物及临床分析。
2014-1-6 17
• 离子交换柱的再生。长时间在高pH值和高 离子强度缓冲溶液中使用，将导致色谱柱 离子交换能力降低。用稀酸缓冲溶液冲洗， 可使阳离子柱再生;反之，用稀碱缓冲溶液 冲洗，可使阴离子柱再生。 • 其他色谱柱的再生 。
2014-1-6
18
谢谢
2014-1-6
19
2014-1-6
4
色谱柱的构成
• 色谱柱由柱管、压帽、卡套(密 封环)、筛板(滤片)、接头、螺 丝等组成。柱管多用不锈钢制 成，压力不高于70kkg/cm2时， 也可采用厚壁玻璃或石英管， 管内壁要求有很高的光洁度 。 • 色谱柱两端的柱接头内装有筛 板，是烧结不锈钢或钦合金， 孔径0.2一20µm(5一10µm)，取 决于填料粒度，目的是防止填 料漏出
色谱柱参数
色谱柱的参数 色谱柱的参数
色谱柱的参数 色谱柱的参数 载碳量
硅胶表面键合相的比例 与比表面积，键合覆盖度等有关 对ODS，载碳量从7-18%（ODS-100Z为20%）不等 ODS的载碳量高， 则保留增加，适合分析非极性化合 物。制备色谱的上样量也可以增加 载碳量通常影响选择性
色谱柱的参数 色谱柱的参数
硅胶表面性质-纯度
柱的化学性质
样品性质决定柱的化学性质 样品性质决定柱的化学性质
样品结构 溶解性（有机溶剂、水） pH值 极性 酸碱性 分子量
分离目的决定柱的物理性质 分离目的决定柱的物理性质
分析? 制备? 快速分析?（如Super-ODS） 含量分析? 杂质检验? 所有组分分离?
色谱柱的参数 色谱柱的参数
柱长、内径
色谱柱的参数 色谱柱的参数
粒径
粒径越小，分离越快, 柱效越高。但柱压力越高，柱容易被污染， 寿命低 LC-MS和常规分析柱通常使用5 μm填料。3 μm填料使用的困难程 度大，一般非必要时不使用(ODS-100V) Super-ODS为2 μm 填料，UPLC为1.7 μm填料 3cm以下的制备色谱柱通常使用5-10 μm填料 更大内径的制备色谱柱通常使用更大的粒径，如10 μm, 或20 μm
色谱柱的参数 色谱柱的参数
封端的效果：
色谱柱的参数 色谱柱的参数
封端-高封端的ODS色谱柱
pH使用范围宽 极性基团封端的色谱柱可以在高水相流动相条件下使用，适合分离 极性化合物 残留的硅醇基影响最小，碱性化合物不拖尾 改善选择性 一般优先使用高封端的色谱柱
HPLC色谱柱的种类
高效液相色谱柱大致可分为五类:一、高效反相液相色谱柱以C18为代表的高效反相液相色谱柱•直被描述为药物发现、开发、方法验证(ValidatiOn)的心脏!高效反相液相色谱柱也极其广泛应用在药物代谢及动力学、生命科学、医疗健康、生物分析检测、毒品和兴奋剂检测、食品安全分析、环境分析、军事、国土安全等领域！高效反相液相色谱制备柱也是最重要的分离纯化技术之一！无论是过去，现在和可预见的未来，以球形B型硅胶(5Um或3um)为材料骨架的高效反相液相色谱柱在实际应用中永远占有统治地位!常规HPLC方法的开发几乎总是从C18作为出发点，反相色谱占了80%以上的应用。
过去数十年来，无数努力集注于：1)改善硅胶的品质，优化键合化学；2)开发新颖的材料骨架替代硅胶。
十多年前，使用有机硅材料取代无机硅材料作为起始原料生产球形硅胶代表一个划时代的革命！生产的球形硅胶命名为B型球形硅胶。
无机A型硅胶重金属含量很高，硅胶表面若干位置严重酸化及螯合效应等导致许多碱性化合物回收率低。
球形B型硅胶重金属含量很低，在非常大的程度上消除了A型无机硅胶表面若干位置严重酸化及螯合效应等问题。
用B型球形硅胶合成高效液相色谱填料，导致高效液相色谱柱产品质量有质的飞跃！然而，另一方面，基于客户的大量反馈和我们对几乎所有色谱厂商产品的评估，我们相信键合化学问题没有获得很好的解决。
具体体现在：(1)“纯粹”反相机理的键合相例如C18和C8市场上仍然是单功能，三功能和聚合物键合相”鱼目混杂(2)键合相封端问题没有获得很好的解决，•直是困扰色谱领域最大的问题！迄今为止全部的尝试只获得有限的成功。
(3)极性嵌入式(PolarCmbCddCd)键合相极性嵌入式(PoIarCmbCdded)键合相是C18高效反相液相色谱"卫星群”中最重要的产品，是C18和C8键合相最重要的补充。
极性嵌入式(POIarembedded)键合相起源于SupelcoABZ o SupelcoABZ的键合方法是用aminopropyl键合相和长链按酸缩合反应形成一个C16酰胺。
色谱柱介绍
C8、 C4柱
4.常见色谱柱介绍
SiO2
CH3
O Si CH2 CH3
7
CH3
C8、C4等短链烷基键合相适合做极性小以减弱保留，缩短 分析时间。另一方面又可以分析氨基酸，小肽等生物分子。
4.常见色谱柱介绍
4.3 苯基柱
SiO2
CH3
O Si CH2
3
CH3
柱上键和固定相有苯基，也属于反相柱，不过由于苯基有不同的物理特性，例 如空间位阻，具有π电子，所以对某些化合物有较好的分离。与C18、 C8和 C4相比，苯基与带芳香环化合物形成p-p 共轭相互作用，增强此类化合物的相 对保留。这种优良的选择性与对非极性化合物保留能力较弱的特点相结合，使 得-Phenyl相成为分离、分析同时含极性和非极性复杂混合物的最佳选择。
3.色谱柱化学性能
用窄的内径，小的粒径会引起高柱压， 柱压是同时影响增加分离度和减少分析时间的主要障碍。分离度、分析时间及柱压三者相互制约， 选择好其中两者，则第3个因素也就选好了
常见规格色谱柱：
类型 微孔柱 分析柱 半制备柱 制备柱
内径D (cm) 0.1, 0.21
0.3 – 0.46 0.8 – 1.0 2.0 – 5.0
OH
R
侧链基团：二异丁基或二异丙基
提供空间位阻可避免硅胶在低PH 下水解、破坏。
1.PH范围：1-8 2.使用了空间位阻大的硅烷 3. 未封端
优点：可以在低PH下分析酸性、碱性 和中性组分，峰形优异。
5.不同品牌色谱柱介绍
Agilent Eclipse XDB,
Si O
O
O Si
CH3 Si CH3
4.常见色谱柱介绍
氰基柱的适用范围：
HPLC色谱柱的基础知识及使用技巧
HPLC色谱柱的基础知识及使用技巧一、引言高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于化学、生物、医药等领域的分析技术。
色谱柱是HPLC系统的核心组成部分，其性能直接影响分析结果的准确性和可靠性。
本文将详细介绍HPLC色谱柱的基本原理、分类、使用及维护等方面的专业知识。
二、色谱柱的基本原理色谱法是一种基于不同物质在固定相和移动相之间的分配平衡进行分离的物理化学方法。
HPLC色谱柱的核心是固定相，它是由硅胶、氧化铝、活性炭等颗粒状物质组成。
当样品溶液通过色谱柱时，不同物质根据其与固定相的相互作用力大小，依次从固定相中解吸下来，从而实现各成分的分离。
三、色谱柱的分类1.正相色谱柱：适合分离极性化合物，如糖类、醇类等。
2.反相色谱柱：适合分离非极性化合物，如脂肪酸、烃类等。
3.离子交换色谱柱：适合分离带电离子或极性化合物，如氨基酸、核酸等。
4.体积排阻色谱柱：适合分离大分子物质，如蛋白质、多糖等。
四、色谱柱的选择与使用1.根据分析物的性质选择合适的色谱柱。
2.确保色谱柱不受污染，使用前需进行清洗和活化。
3.避免过度使用压力，以延长色谱柱的使用寿命。
4.定期更换色谱柱，以保证分析结果的稳定性。
五、色谱柱的维护与保养1.使用后及时清洗色谱柱，防止残留物对柱子的污染。
2.色谱柱应储存于干燥、避光的环境中，避免受潮或暴晒。
3.对于长期不用的色谱柱，应定期检查其性能并进行活化处理。
4.避免将色谱柱置于高温或低温环境中，以防止硅胶固定相产生裂纹或变形。
5.定期更换流动相，以保证流动相的质量和稳定性。
同时，流动相的pH值应控制在固定相所能承受的范围内。
6.在使用过程中，应时刻关注色谱柱的压力变化。
若发现异常压力或突然变化，应及时检查柱子是否堵塞或受损。
若确有问题，应立即停止使用并进行修复或更换。
7.在使用过程中，还应注意观察色谱峰的形状和大小。
若发现异常峰或分离效果变差，应考虑更换流动相或清洗柱子。
若问题仍未解决，应考虑更换色谱柱。
3-HPLC 色谱柱介绍
甲基三乙氧基硅烷 (MTEOS)
31
为何杂化颗粒柱可增加 在高pH下的柱寿命？
Surface modified Silica Particles XTerra® Hybrid Particles
普通硅胶柱
基于杂化颗粒的Xterra 柱
• 硅胶快速溶解 • 严重的柱失效 • 柱寿命短暂
©2014 Waters Corporation
LiChrosorb RP-18
Symmetry C8 Resolve C-18
15
12 12
10.3
12.5 12.4
Ultrasphere ODS
Partisil ODS-3 mBondpak C-18 Nova-Pak C-18
11
11 10 7
11.3
12.0 7.9 5.5
©2014 Waters Corporation 13
键合方式：三点键合
优点：酸性条件下键和相稳定性高（耐水解）
©2014 Waters Corporation
14
C18 填料的合成 —3.端基封尾
键合相(配体)：C18
端基封口基团
残留硅羟基
硅胶基质
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10
130Å and 300Å 1.7 um BEH Particles （电镜照片）
©2014 Waters Corporation
11
填料的合成 —2.键合配体（键合相）
填料的内孔表面 流动相
色谱填料是多孔颗粒（“海绵” ），99％发生色谱分离的表面 是在内 保证待分析和分离的化合物 能够和色谱填料有保留
25
– 颗粒分布
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色谱柱使用保养知识
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3
内容
色谱柱应用基础 HPLC色谱柱介绍
色谱柱使用保知识
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4
高效液相色谱柱简介
色谱柱是一根填满填料的管子
柱管的材料(塑料,玻璃,不锈钢…)和尺寸(内径,长短)不尽相同
Waters HPLC色谱柱
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1
Waters 色谱柱发展历史
ACQUITY UPLC® BEH Amide ACQUITY UPLC® BEH Glycan XBridge Amide XSelect HSS HPLC Columns ACQUITY UPLC® HSS Cyano & PFP columns XSelectTM HSS Cyano & PFP columns XP 2.5 µm Columns
管内的填料更是种类繁多,主要分为三大类 – 硅胶基质 – 聚合物基质 – 无机和有机硅胶杂化基质 色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术
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5
硅胶颗粒的形状
不规则形状 (Irregular)
– 大硅胶颗粒研磨，筛分
– 不粒尺寸和表面积限制
有机基质 (高聚物)
杂化颗粒技术(具硅-碳键机制)
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第一代杂化颗粒的合成过程
Waters 专利技术 荣获2000年全球 R&D 100 大奖
硅甲基嵌入型聚乙氧基 硅烷 (MPEOS)
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四乙氧基硅烷 (TEOS)
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27
硅胶表面键合相的水解（PH<2）
O Si O O
H3C Si Cl CH3
OH
C C
C C
C C
C CH3
+
H3C
C Si C CH3
C C
C C
C CH3
O Si O O
O
+ HCl
Low pH (hydrolysis of ligand)
H3C
LiChrosorb RP-18
Symmetry C8 Resolve C-18
15
12 12
10.3
12.5 12.4
Ultrasphere ODS
Partisil ODS-3 mBondpak C-18 Nova-Pak C-18
11
11 10 7
11.3
12.0 7.9 5.5
10
130Å and 300Å 1.7 um BEH Particles （电镜照片）
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11
填料的合成 —2.键合配体（键合相）
填料的内孔表面 流动相
色谱填料是多孔颗粒（“海绵” ），99％发生色谱分离的表面 是在内孔表面
Analyte
必须允许流动相进入内孔以 保证待分析和分离的化合物 能够和色谱填料有保留
OH
O Si O O
C Si C CH3
C C
C C
C CH3
+
HO
Note: Sometimes called “Column Bleed”
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©2014 Waters Corporation
硅胶的溶解（PH>8）
Nucleophilic attack
• Complete dissolution of Silica • Catastrophic column failure • Short lifetimes
• 因嵌入硅甲基的阻挡, 颗粒表面溶解速 度明显减缓 • 柱寿命大大延长
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XBridge:第二代杂化填料的合成
美国专利号 6,686,035 B2
硅胶基体中 插入的桥式乙基
EtO
CH2 CH2 OEt O Si Si O Si
O
OEt Si O Et O
O Si OEt O
4
O Et
EtO
Si
Si OEt EtO EtO
µBondapak™
Styragel® Spherisorb® DeltaPak® PrepPak® 1958 1984 1964 1973 1976 1979 1986 Symmetry® 1992 1994 SymmetryShield®
ACQUITY UPLC® BEH SunFire™ Columns XTerra®
15
对色谱柱填料的了解(一)
键合相化学 – 影响化合物的分离度：α – 不同键合相对不同种类的化合物分离不同 – 可能导致色谱的分离机理不同 – 如：C18、C8、CN
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16
键合相色谱柱
以硅胶为基质，通过化学键合方式把C18、C8、NH2等 基团联在基质上，作为固定相 优点∶ – 固定相稳定，不易流失 – 应用广泛，可使用多种溶剂 – 消除硅羟基的不良影响
+
EtO EtO Si EtO
OEt CH2 Si OEt CH2 OEt
EtO
OEt
n
聚乙氧基硅烷 (BPEOS)
Anal. Chem . 2003, 75, 6781-6788 ©2014 Waters Corporation
四甲基硅烷 (TEOS)
双(三乙氧基硅基)乙烷 (BTEE)
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将高pH 柱稳定性推向新极限
甲基三乙氧基硅烷 (MTEOS)
31
为何杂化颗粒柱可增加 在高pH下的柱寿命？
Surface modified Silica Particles XTerra® Hybrid Particles
普通硅胶柱
基于杂化颗粒的Xterra 柱
• 硅胶快速溶解 • 严重的柱失效 • 柱寿命短暂
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缺点∶
– pH值不能小于2(键合相水解) – 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同
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不同色谱填料的选择性差异
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19
选择性差异来源
填料的品牌-不同硅胶颗粒基质
o
o
密度，表面积，孔径
纯度(残留硅羟基活性不同)
注意：孔径是分布值
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Si-OH = 硅羟基(Silanol)
8
平均孔径/孔体积
孔径/孔体积分布
– 大的孔径可分析高分子量 的分子
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9
填料的孔（多孔式液相色谱颗粒）
©2014 Waters Corporation
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残基处理的效果
① 抗坏血酸 ② 烟酰胺 ③ 对氨基苯甲酸 ④ 哌咯西叮 ⑤ 核黄素
⑥ 苯酚
⑦ 盐酸硫胺
NovaPak C18
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未封口 C18
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对色谱柱填料的了解(三)
含碳量
o
含碳量越高，k'值越大（固定相传质效应增加）
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29
Waters专利的柱填料颗粒
优点
无机基质 (C18 –硅胶)
• 机械强度高 • 柱效高 • 保留稳定 • 很宽的pH应用范围 • 无离子型作用 • 化学稳定性好
缺点
• 有限的pH应用范围 • 对碱性分析物拖尾 • 化学不稳定性 • 机械强度不佳 • 柱效低 • 保留行为难以预测
球形（Spherical）
– 目前流行的分析填料 – 形更好的性能，重现性
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6
C18 填料的合成 —1.硅胶基质的合成（多孔）
硅胶颗粒基质
硅羟基
Polyethoxysilane (PEOS)
Tetraethoxysilane (TEOS)
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©2014 Waters Corporation
24
对色谱柱填料的了解(四)
平均颗粒度，颗粒度分布 – 颗粒度
o
颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差) 颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差) 球型:柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型：柱床结构不均匀,流动相线性速度不均 匀谱带扩展
ACQUITY UPLC® BEH200 SEC XSelect CSH HPLC columns ACQUITY CSH Columns Viridis SFC Columns ProteinPak High Rs IEX
2
©2014 Waters Corporation
内容
色谱柱应用基础 HPLC色谱柱介绍
高含碳量
o
o o
有利于不易保留的化合物的分离
水解稳定性好，重现性好 有利于极性化合物的拖尾改善 有利于分析中性及碱性化合物 降低溶剂损耗
低含碳量
o o
©2014 Waters Corporation
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不同色谱柱的含碳量
色谱柱
Symmetry C18 Zorbax ODS C% 19 17 k'苊 (50/50的乙腈/水) 17 15.7