构建具有神经支配的工程化心肌组织的初步研究
CRTER杂志“软组织工程”栏目关于“组织器官构建”的组稿内容：本刊学术部
罗 民． 广 伟。 盂 ． 马洪顺 骨 质疏 松动 物模 型 治疗 的粘 弹 性实 验研 究 ［ ． Ｊ 】 北 京 生物 医学 １程 ，０ ７２ （） １ －２ ： ２ ０ ，６４： ４ １ ４８ ［８ Ｑｕ ｎＴ Ｇａ ＭａＨＳ Ｚｈ ｎ ｇ ｏＺ ｚ ｉ ｏ ｇ ｈ ｎ ａ ｊ ｕ １】 ａ Ｇ， ｏＭ， ． ｏ ｇ ｕ ｕ ｈ Ｇ ｎ ｃ ｅ ｇＹ ｎｉｙ ｕ
建组 织工 程软 骨
０ 组 织 工程 皮 肤 植 入 重 度联 合 免疫 缺 陷小 鼠
０ 原 位构 建 工程 化 心肌组 织 的研 究
０ 组 织 工程 皮肤在 经 皮吸 收 的应 用 ０ 组织 工程 化静 脉 瓣 的研 究
０ ＭＳ ｓ与 ＰＬ Ａ 支架 构建 组织 工程 化软 骨 Ｂ Ｃ Ｇ
实验研 究居 多。有 关动物臂 丛神经的 蠕变特性研 究鲜有报
道。 文章对臂 丛神 经进行 蠕变力学特性研究 ， 以归一化分析 的方法建立 了臂 丛神经 的归一化蠕 变函数 方程 ， 归一化蠕 变
函数方程的建 立对研 究臂 丛神 经的损伤机制具有重要意 义。
课题ｉ信的 “ 平 金标 准 蕴 力松 弛 蠕 焚 是研 免 生 柏
０ 内皮 祖 细 胞 在血 管 组 织 工 程 化 过程 中的 生
Ｏ 组织 工程 带血 管 蒂脂 肪瓣 生 长研 究 ０ 生物反 应 器在 血 管组 织工 程 中的研 究
Ｏ 组 织 工 程化 肌 腱 修 复 运 动 训 练 致肌 腱 组 织
缺损
０ 细 菌纤 维素构 建 组织 工程 角膜基 质 的方 法 Ｏ 组 织 工 程 化 肌 腱 应 用 于肌 腱 运 动 损 伤 的修
变力学参数指标 。
７ １ ！ ：２ 旦 ２
心肌组织工程种子细胞的研究进展
心肌组织工程种子细胞的研究进展（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的综述组织工程心肌种子细胞来源的研究现状与存在的问题，并展望其前景。
方法广泛查阅近十年来有关组织工程心肌种子细胞的文献，并进行综述。
结果心肌组织工程的替代治疗具有极其诱人的前景，但还处于起步阶段，仍然需要通过大量的实验找到最佳的细胞来源。
结论组织工程心肌有广阔潜在的临床应用前景，其细胞来源值得进一步研究。
【关键词】心肌组织工程；种子细胞。
组织工程是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。
其核心是模拟体内组织发生的环境，在体外培养细胞，构建由细胞和生物材料组成的、具有特定功能的三维工程化组织。
组织工程心肌主要涉及种子细胞来源，支架以及体外构建方式和移植。
下面我们主要讨论重点是心肌组织工程种子细胞。
1心肌组织工程的细胞来源构建工程化心肌组织的最佳细胞，应该是容易获得的、能增殖的、无免疫原性的、具有分化为成熟的有功能的心肌细胞的能力的细胞。
遗憾的是，目前还没有发现这样的细胞。
供体(异源的)细胞相对容易获得，但是具有免疫排斥反应的风险；而自体细胞虽然很难获得和扩增，但是没有免疫排斥的困扰。
目前，已报道的应用于心肌组织构建的细胞包括胎儿心肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼成肌细胞、天然骨髓细胞、间充质千细胞和胚胎干细胞等。
1.1心肌细胞胎儿心肌细胞是研究的最早最广泛，被认为是目前干细胞研究领域的一个重要方面。
Soonpa等［1］最早将胎儿心肌细胞移植到鼠的心肌。
Scorsin等［2］将胎儿心肌细胞注射到心肌梗死模型鼠的左心室心肌，研究表明有50％的鼠的梗死边缘区有被注射的心肌细胞。
胎儿心肌细胞移植能改善左心室功能，提高射血分数和心输出量。
组织工程学：第六章 组织工程化组织和器官的构建
(2)组织工程化软骨组织的种子细胞：构建组织工程化 软骨组织在种子细胞的选择上，由于自体软骨细胞供 体来源不足，异体软骨细胞免疫排斥问题，同样开始 重视干细胞成软骨的定向诱导分化。骨髓源性干细胞 在多种条件下(如转化生长因子β和三维培养环境)均 能表现出软骨形成的潜能，在体外培养环境下，无论 何种培养方法或何种支架，转化生长因子β总能诱导 干细胞生成软骨。
未来发展方向
不过，尽管组织工程皮肤还存在种种不足，但毋庸置 疑，它代表了今后皮肤缺损治疗的发展趋势和方向。
未来组织工程皮肤的发展方向应当是：在解决了种子 细胞体内的增殖和转归等相关理论问题的基础上，建 立与正常人体皮肤结构和功能相近的组织工程皮肤。 这种皮肤不仅能够有效封闭皮肤创面缺损，加速创面 愈合，还具有正常皮肤的附属器官，具有正常的色泽， 能分泌汗液和生长毛发，而且可以促进皮肤移植后的 快速血管化，提高移植成功率等。
1997年经FDA批准上市的Apligraf（图6-1）是目前最成熟的既含 有表皮层又含有真皮层的组织工程复合皮肤，其细胞成分均来源 于新生儿包皮，由Bell于1981年在体外构建成功。通过将新生儿 包皮成纤维细胞接种到牛胶原凝胶中形成真皮替代物层，表皮层 部分由角质细胞接种到真皮替代物上形成，并放置于气-液界面 以促进角质细胞分化形成角质层。因此，Apligraf是具有含真皮 层和表皮层的复合皮肤替代物。与单层的真皮替代物相比， Apligraf表皮层的角质层为创面提供了天然屏障，并具有防止机 械损伤、感染和创面干燥等作用。通过分泌各种生长因子和细胞 外基质成分促进创面愈合的作用，而且不用定制，可随时取用， 目前获准用于治疗静脉疾病和糖尿病引起的脚部和腿部皮肤溃疡 的移植修复。
2.生物可降解的合成高分子材料：主要 有聚乳酸网和不可降解的尼龙网等。利 用脱细胞基质、胶原蛋白基质网架、胶 原凝胶支架材料构建的人工真皮具有较 好的组织结构，是一种较理想的皮肤替 代物，可作为移植物进行深入研究。
以液态胶原为支架构建组织工程化心肌组织的实验研究_赵云山
纤维细胞。收集未贴壁细胞 , 其中主要为心肌细胞。 3 组织工程化心肌条带的制备 : 液态 ( 1 9 mg/ ml) 与 2 型胶原 DMEM 等比例混合 , 用0 1 mol/ L
NaOH 调为中性 , 再加入 10% 的 Matrigel。将分离的 新生大鼠心肌细胞与上述混合物混合, 使其终浓度 为2 107/ ml; 加入环形槽中, 置 5% CO2 、 37 培养 箱中 , 60 min 后加入培养液。心肌细胞/ 胶原混合液 即可在槽中凝固 成带状的心肌细胞/ 胶原复合物。 共制备 15 条心肌条 带。心肌条 带在槽中培养 7 d 后 , 移出复合物条带 , 部分条带 ( 其中的 10 条 ) 套在 静态拉伸装置的两平行金属圆杆上, 调整两金属杆 间距离, 使条带受到幅度 为 10% 静态 拉伸, 并继续 体外培养 7 d[ 7] 。部分条带则在未施加任何外力下, 继续培养 7 d( 其中的 5 条) 。 4 组织工程化心肌条带检测方法 : 构建心肌条 带置于体外培养 14 d 后, 取材, 并行大体观察、 组织 学与免疫组织化学观察及透射电镜检查。具体方法 如下 : ( 1) 大体观察: 主要观察心肌条带在体外培养 期间跳动情况。观察指标包括: 跳动的部位、 强度、 频率及一致性等。 ( 2) 心肌构建物 HE 染色: 心肌细 胞 / 胶原复合物体外培养 14 d 后, 用 4% 的甲醛溶液 固定 , 梯度酒精脱水 , 石蜡包埋, 切成 4 m 的切片。 HE 染色 , 光镜观察。( 3) 免疫组织化学染色 : 样品经 包埋, 石蜡切片 , 脱蜡, 复水。微波炉中将切片同柠 檬酸钠溶液孵育 30 min 。室温下样品与 0 1% Triton X - 100、 0 3% H 2O2 的甲 醇溶液孵育 10 min, 以消除 内源性过氧化物酶。蒸馏水冲洗, 用 10% 的封闭血 清作用 15 min。弃去血清 , 加一抗: 抗 - 肌节肌动蛋 白和抗结蛋白抗体 , 置 4 过夜。PBS 漂洗 20 min, 加入二 抗, 在 37 条件下孵育 15 min; PBS 漂洗 20 min, 在 37 条件 下加入辣根标记的链 霉卵白素作 用 15 min。PBS 漂洗 20 min, DAB 显色, 水洗 10 min, 二甲苯透明, 封片。 ( 4) 透射电镜观察: 标品用 3% 的戊二醛溶液固定, 树脂包埋, 超薄切片 , 透射电镜 观察。 结 果
构建具有神经支配的工程化心肌组织的初步研究
生物医学工程研究Journal of Bi om edical Engi neering R es earch2008,27(4):258～2623基金项目:国家自然科学基金资助项目(30530220)。
△通信作者 j @构建具有神经支配的工程化心肌组织的初步研究3王静△,郭立国,冯金升,任红茹(中国航天员科研训练中心,北京100094)摘要:探索神经生长因子诱导的交感神经元样PC12细胞作为组织工程化心肌组织神经支配研究模型的可行性。
用含0.04%EDT A 的0.25%胰酶分离新生大鼠原代心肌细胞,然后与NG F 诱导的交感神经元样PC12细胞在液态的Ι型胶原中共培养,通过光学显微镜观察、常规H.E.染色、免疫组织化学染色和透射电镜观察等对其进行评价。
在三维共培养模型中,NG F 诱导的交感神经元样PC12细胞长出神经突起,突起及其上的膨体能够到达跳动的心肌细胞表面,神经突起随心肌细胞一起跳动。
说明采用神经元样PC12细胞作为组织工程化心肌神经支配的模型是可行的,神经细胞与心肌细胞可能有支配关系。
关键词:组织工程;心肌细胞;PC 12细胞;共培养;神经支配;神经生长因子中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:167226278(2008)0420258205Pr eliminar y Investigation on Reconstr uction ofInner va ted Tissue -engineered Car diac Sheet in V itr oWANG Jing ,GU O Liguo ,FENG Jinsheng ,REN H ongr u(Ch ina Astronaut R esearch and Training Cen ter ,Beijing 100094,China )A bstr act :T o inves tigate the poss ibility o f neuronal PC12cells being us ed as m odels to inves tig ate the inn ervation of tissue -engineered cardiac tissue.Neonatal rat primary cardiacmy ocytes is olated w ith us ing 0.25%try ps in containing 0.04%EDT A were co 2cultured with the NG F induced sy mpathetic n euron -lik e PC12cells in liqu id ty pe I collagen liquid .A fter that ,H.E.s tain ing ,immunhis tochemistry staining and transmiss ion electron micros co py were used to ev aluate it.Result sh owed that in the 3-D co -culture m odel ,NG F induced PC12cells outgrew process es wh ich reached the surface o f the cardiacmy ocy tes and moved al ong w ith the beat of cardiomy ocytes.Their v aricos ities als o touched w ith cariamy ocy tes.T he results o f our study su gges t that PC12cells is a feas ib le model to be used in th e study o f neural innerv ation o f tissue eng ineered cardiac tiss ue.And the cardiomy ocy tes may be innervated in th is m odel.K ey w or ds :T issu e engineering;Cardiomy ocytes ;PC12;;C o -culture ;Innervati on ;Nerve gro wth f act or1 引 言神经系统对机体各组织、器官及系统的发生、发育过程具有重要作用。
心肌支架材料在心肌梗死治疗中的应用与研究热点
心肌支架材料在心肌梗死治疗中的应用与研究热点赵亮;邱晓娜;李霞飞【摘要】背景:近年来心肌组织工程快速崛起, 通过应用外源性生物材料模拟细胞外基质, 使受损的心肌细胞得到有效修复或重建, 在治疗心肌梗死等缺血性心脏病方面具有很大的潜在价值.目的:综述心肌支架材料在心肌梗死治疗应用中的研究进展.方法:应用计算机检索NCBI数据库和万方数据2008至2018年发表的相关文献, 检索关键词为\"心肌支架材料, 心肌梗死;Myocardial scaffold materials, myocardial infarction\".结果与结论:目前常用的心肌支架材料主要有天然生物材料 (包括胶原/Matrigel、纤维蛋白、壳聚糖、透明质酸、海藻盐酸等) 、人工合成材料 (聚酯类人工合成材料与纳米材料) 及复合支架材料.由于心脏环境和心脏功能的复杂性, 支架材料的选择应充分考虑到生物相容性、免疫原性、导电性、降解率、对缺血缺氧易感性等各方面因素, 尽管目前许多支架设计开始满足所提出的诸多要求, 但应用于临床仍然存在着各种各样的问题, 相信随着研究者的进一步深入及应用工具的进一步发展, 人们可期待能够创造出接近原生组织生理机能的心肌支架,使心脏功能得到更理想的恢复.%BACKGROUND: In recent years, myocardial tissue engineering has developed rapidly. By using exogenous biomaterials to simulate extracellular matrix, damaged myocardial cells can be effectively repaired or reconstructed, which has great potential value in the treatment of ischemic heart diseases such as myocardial infarction. OBJECTIVE: To review the research progress of myocardial scaffolds in the treatment of myocardial infarction. METHODS: NCBI and WanFang databases were retrieved for relevant articles published from 2008 to 2018, with the key words of \"myocardial scaffold materials, myocardialinfarction\" in English and Chinese, respectively. RESULTS AND CONCLUSION: At present, the commonly used myocardial scaffolds are mainly natural biomaterials (including collagen/Matrigel, fibrin, chitosan, hyaluronic acid, and algae hydrochloric acid) , synthetic materials (polyester synthetic materials and nanomaterials) and composite scaffolds. Due to the complexity of cardiac environment and heart function, the selection of scaffold materials should fully take account of biocompatibility, immunogenicity, conductivity, degradation rate and susceptibility to ischemia and hypoxia. Although many scaffold designs have begun to meet many requirements, there are still many kinds of stent materials for clinical application. It is believed that with the further development of researchers and application tools, people can expect to create myocardial scaffolds close to the physiological function of the original tissue, so that the heart function can be better restored.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2019(023)014【总页数】6页(P2279-2284)【关键词】心肌支架材料;心肌梗死;心肌组织工程;纤维蛋白;壳聚糖;天然生物材料;胶原;透明质酸;脱细胞心肌材料;人工合成材料;复合材料【作者】赵亮;邱晓娜;李霞飞【作者单位】北京大学工学院,北京市 100871;新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市 453003;大同市第三人民医院中心实验室,山西省大同市 037008;山西医科大学第一临床学院,山西省太原市 030001;新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市 453003【正文语种】中文【中图分类】R459.9;R318.11文章快速阅读：文题释义：心脏支架材料：是心肌组织工程最重要的结构，为心肌细胞、组织生长提供了比较稳定的内环境，其结构也为细胞、组织的营养交换、代谢物排泄等提供了良好的场所，是形成一定具有结构及功能的细胞及组织的基础。
组织工程化神经的体外构建
组织工程化神经的体外构建汤欣;杨宇民;丁斐;顾晓松【摘要】目的:体外构建组织工程化神经,为周围神经缺损修复提供新的有效方法.方法:施万细胞与丝素蛋白神经移植物生物反应器中培养7d后,于丝素蛋白神经移植物两端各植入胚胎SD大鼠背根神经节(DRG),继续培养2w,3w和4w,采用免疫细胞化学方法、透射电镜和扫描电镜观察丝素蛋白神经移植物中神经细胞的生长状态.结果:施万细胞、DRG与丝素蛋白神经移植物共培养2w后,施万细胞和DRG发出的神经突起沿着丝素纤维,呈条带状纵向平行生长:3w后透射电镜观察到髓鞘形成;4w后扫描电镜显示梭形的施万细胞与DRG发出的神经突起呈纵向平行生长,并有类似基质样结构形成.结论:施万细胞、DRG与丝素蛋白神经移植物共同培养成功进行体外构建组织工程化神经.【期刊名称】《交通医学》【年(卷),期】2010(024)003【总页数】3页(P217-219)【关键词】组织工程化神经;周围神经缺损;施万细胞;髓鞘【作者】汤欣;杨宇民;丁斐;顾晓松【作者单位】南通大学江苏省神经再生重点实验室,南通226001;南通大学江苏省神经再生重点实验室,南通226001;南通大学江苏省神经再生重点实验室,南通226001;南通大学江苏省神经再生重点实验室,南通226001【正文语种】中文【中图分类】R318.08交通事故和各种意外而造成外周神经损伤的发病率近年来呈大幅度上升趋势，严重影响了患者的生活质量，导致了劳动力丧失和医疗费用极大增加，给社会造成了严重负担。
因此，寻找合适的组织材料，构建组织工程化神经是目前周围神经再生的研究热点。
丝素是一种有效的神经缺损桥接替代物，能促进和引导再生轴突通过，为神经再生提供适宜的低阻力通道和再生微环境。
我们实验室利用仿生学中鸡蛋壳结构原理成功构建了丝素蛋白神经移植物[1～3]。
为进一步优化和改进丝素蛋白神经移植物，本实验运用组织工程学研究手段，将施万细胞、背根神经节（DRG）与丝素蛋白神经移植物共培养，体外构建组织工程化神经。
心肌组织工程研究进展
心肌组织工程研究进展何玉兰;孙尧【期刊名称】《河北联合大学学报（医学版）》【年(卷),期】2014(000)002【总页数】2页(P193-194)【关键词】组织工程;心肌细胞;干细胞;支架材料;再血管化【作者】何玉兰;孙尧【作者单位】河北联合大学附属医院老年科河北唐山 063000;河北联合大学附属医院老年科河北唐山 063000【正文语种】中文【中图分类】R541心血管疾病(CVD)是当今社会的主要健康问题和死亡的主要原因。
由于成熟心肌细胞(Cardiomyocytes，CMs)属于终末分化期永久性细胞，不具有再生能力[1]，其对有丝分裂信号作出的反应是细胞肥大[2]而不是再生。
由于心肌损伤后无法通过自身的增殖、分化进行修复，坏死的心肌则由纤维疤痕组织取代[3，4]。
幸存心肌细胞的有限增殖能力使受损的心肌发生重构现象，并最终导致心力衰竭等病态后遗症[5]。
传统的治疗方法虽然能在一定程度上改善症状，但并不能彻底地治愈。
心肌组织工程的发展，为解决这一难题开辟了一个新领域。
心肌组织工程研究主要涉及种子细胞、支架材料、体外构建方式以及心肌再血管化等方面。
1 种子细胞种子细胞一直是组织工程研究的核心问题之一，理想的种子细胞应该具有易获得、易体外培养增殖、长期传代不改变生物学特征、抗原性小、组织修复能力强等特性[6]。
胎幼心肌细胞:胎幼心肌细胞研究最早最广泛，被认为是目前干细胞研究领域的一个重要方面。
Soonpa等[7]最早将小鼠胚胎心肌细胞移植至正常小鼠心脏中，发现移植细胞成功存活分化，并与宿主细胞形成闰盘连接。
Muller等[8]在大鼠心梗模型中进一步证实移植可减少梗死区的反常运动，改善心功能。
但是对人类而言，胎幼心肌细胞移植存在供体细胞来源及社会伦理道德争论，而且异体移植排斥反应使移植物难以长期存活;心脏自体细胞:Quaini等[9]证实人的心肌细胞存在增殖活动，尤其在病理条件下心肌细胞增殖与再生加速。
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构建具有神经支配的工程化心肌组织的初步研究（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：王静，郭立国，冯金升，任红茹【摘要】探索神经生长因子诱导的交感神经元样PC12细胞作为组织工程化心肌组织神经支配研究模型的可行性。
用含0.04%EDTA的0.25%胰酶分离新生大鼠原代心肌细胞,然后与NGF诱导的交感神经元样PC12细胞在液态的Ι型胶原中共培养，通过光学显微镜观察、常规H.E.染色、免疫组织化学染色和透射电镜观察等对其进行评价。
在三维共培养模型中，NGF诱导的交感神经元样PC12细胞长出神经突起，突起及其上的膨体能够到达跳动的心肌细胞表面，神经突起随心肌细胞一起跳动。
说明采用神经元样PC12细胞作为组织工程化心肌神经支配的模型是可行的，神经细胞与心肌细胞可能有支配关系。
【关键词】组织工程；心肌细胞；PC12细胞；共培养；神经支配；神经生长因子Abstract：To investigate the possibility of neuronal PC12 cellsbeing used as models to investigate the innervation of tissue-engineered cardiac tissue.Neonatal rat primary cardiacmyocytes isolated with using 0.25% trypsin containing 0.04%EDTA were co cultured with the NGF induced sympathetic neuron-like PC12 cells in liquid type I collagen liquid . After that , H.E. staining , immunhistochemistry staining and transmission electron microscopy were used to evaluate it. Result showed that in the 3-D co-culture model, NGF induced PC12 cells outgrew processes which reached the surface of the cardiacmyocytes and moved along with the beat of cardiomyocytes. Their varicosities also touched with cariamyocytes.The results of our study suggest that PC12 cells is a feasible model to be used in the study of neural innervation of tissue engineered cardiac tissue. And the cardiomyocytes may be innervated in this model.Key words：Tissue engineering；Cardiomyocytes；PC12;；Co-culture；Innervation；Nerve growth factor1 引言神经系统对机体各组织、器官及系统的发生、发育过程具有重要作用。
神经系统使机体各部分在功能上成为整体。
近年来，组织工程研究发展迅速，国内外研究人员相继成功地体外复制了软骨［1］、骨［2］、皮肤［3］以及心肌［4］等组织。
但是，要保证组织工程化产品在体内移植后的存活，充分的血液供应和完善的神经支配起着决定性因素。
如何在构建工程化组织的同时重建其血液供应和神经支配，已成为组织工程研究从基础研究向临床应用过渡的关键性问题。
到目前为止，工程化心肌组织的血管化［5］研究进展顺利，而其神经支配研究由于神经系统的复杂性及缺乏合适的体外模型，目前尚未见报道。
心肌和其他肌肉组织一样，神经的有效支配在其发挥正常生理功能方面起着重要作用。
Dianne［6］等（1991年）将胸腰部交感神经节和心肌细胞共培养，发现具有肾上腺素能支配的心肌细胞的体积明显增大，表明神经支配有利于心肌细胞的生长。
李振中［7］等（1996年）将大鼠脊神经节与心肌细胞联合培养，发现神经纤维终止于搏动的心肌细胞表面。
上述通过二维条件下，心肌细胞与神经细胞共培养的结果表明，神经细胞与心肌细胞共培养能够相互影响，并有利于心肌细胞的生长发育和功能的发挥。
由于原代分离培养的交感神经元对体外生存环境要求较高，而NGF诱导后的交感神经元样PC12细胞培养条件更为简单，培养过程中状态也相对稳定。
工程化心肌组织的培养环境主要涉及到心肌组织的生长与存活，因此很难同时满足原代分离神经元的生长要求。
基于此，本研究选用NGF诱导分化的PC12细胞与心肌细胞在液态胶原中共培养作为模型，对构建具有神经支配的工程化心肌组织进行了初步的探索性研究，以探讨体外再造具有神经支配的心肌组织工程的可行性，并为心肌组织工程的神经支配研究提供初步的资料。
2 材料与方法2.1 材料2.1.1 PC12细胞由军事医学科学院三所一室朱玲玲教授惠赠2.1.2 NGF 由军事医学科学院三所八室赵强实验师惠赠2.1.3 动物新生Wistar大鼠（1—2日龄），由军事医学科学院动物中心提供。
2.1.4 仪器及装置相差显微镜，二氧化碳培养箱，透射电镜等。
2.1.5 试剂DMEM (Sigma) , 胎牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所) ,胰酶(Sigma) ,基质蛋白(Matrigel , Sigma) , cTnT抗体(武汉博士德公司,1∶500) ，生物素标记的羊抗小鼠试剂盒(中山试剂公司) ,DAB 显色试剂盒(中山试剂公司)，NGF（神经生长因子）等。
2．2 方法2.2.1 心肌细胞的分离［8］取新生大鼠心室肌组织，充分剪碎后用0.25％的胰酶消化的方法获得单细胞悬液，在含有15%胎牛血清的DMEM培养液中差速贴壁1 h取上清离心，以去除成纤维细胞。
收集未贴壁细胞，其中主要为心肌细胞。
2.2.2 PC12细胞的培养PC12细胞按常规复苏，以5×105/ml的浓度接种于25 ml培养瓶中，培养液为PC12细胞生长培养基，置于37℃孵箱内培养。
24 h后加入NGF，浓度为50 ng/ml,隔天换液一次。
2.2.3 Ⅰ型胶原的制备［9］从大鼠尾根部切断鼠尾，置于75%的酒精中浸泡30 min，无菌条件下撕下尾腱，剪碎。
取尾腱碎片浸入于0.1%的醋酸中，置4 ℃冰箱，并用磁力搅拌器进行搅拌。
48 h后离心收集上清即得胶原溶液。
制备的胶原溶液中所含的胶原浓度约为3.0 mg/ml。
2.2.4 PC12细胞与大鼠心肌细胞在液态胶原中的混合培养液态Ⅰ型胶原(3.0mg/ml)与2×DMEM（添加20％胎牛血清，）等比例混合，用0.1 mol/L NaOH调为中性，再加入占上述混合液体积总量10％的Matrigel。
将分离的新生大鼠心肌细胞（浓度为3×106/ml）与PC12细胞（浓度为3×104/ml）与上述混合物混合，加入12孔板中，置5% CO2、37 ℃培养箱中，心肌细胞/PC12细胞／胶原混合液即可在槽中凝固成片状的心肌细胞/PC12细胞／胶原复合物。
60 min后加入培养液及NGF50 ng/ml。
2.2.5 检测方法14天后取材固定，显微镜下观察、HE 染色与免疫组化及透射电镜检查。
(1) 显微镜下观察:主要观察混合培养的细胞在体外培养期间情况,观察指标包括：心肌细胞跳动的部位、强度、频率及一致性等；神经细胞神经突起的生长情况；神经细胞与心肌细胞的连接情况，以及有没有神经纤维终止于搏动的心肌细胞表面等。
(2) HE染色:取心肌细胞/胶原复合物片层，用4 %的多聚甲醛溶液固定,梯度酒精脱水,石蜡包埋,切成4 μm 的切片。
HE染色,光镜观察。
(3)免疫组化染色:将石蜡切片分别放入二甲苯、酒精中脱蜡，加一抗，4 ℃冰箱中过夜,加二抗，加入呈色液（DAB）显色，显微镜下观察，阳性部位显棕色，阴性不显色，苏木素核复染，封片。
(4) 透射电镜观察：标本用3%的戊二醛固定，树脂包埋，超薄切片，透射电镜观察。
3结果3.1 相差显微镜下观察的结果相差显微镜下观察，第二天即可见单个的神经细胞长出突起，随着时间的延长，长出突起的细胞越来越多，突起也越来越长，在心肌细胞的表面延伸（见图1A）。
心肌细胞在培养的第二天即可见单个细胞在跳动，第三天即可见一簇一簇的细胞在跳动，第五天神经细胞生长的神经突起呈放射状到达心肌细胞的表面并随心肌细胞一起跳动（见图1B）。
图1 PC12与心肌细胞在液态胶原中混合培养的相差显微镜下观察的结果A.神经细胞长出的神经突起（↑）分别到达心肌细胞（▲）的表面(×40)B.神经细胞长出的神经突起（↑）呈放射状到达心肌细胞的表面并随心肌细胞一起跳动(×40)Fig 1 Phase contrast microscope result of innervatedtissue-engineered cardiac sheet(×40)3.2 HE染色结果由于本实验采用低密度的PC12细胞植入，因此PC12细胞分散在原代心肌细胞的网络中。
PC12细胞的核较大，而心肌细胞的核较小，核均为蓝色（见图2）。
3.3 免疫组化染色结果采用a-肌小节肌动蛋白免疫组化染色对心肌细胞进行鉴定，胞浆呈棕色(见图3A)。
采用NF对神经纤维进行免疫组化染色（见图3B），可观察到NF阳性的细胞胞核较大，其周围有一些染色阴性的心肌细胞，胞核较小。
3.4 透射电镜观察结果PC12细胞与新生大鼠心肌细胞在液态胶原中混合培养后，图中可见心肌细胞、心肌纤维和神经突起。
N1、N2 为神经纤维，C 为心肌细胞（见图4）。
M为心肌纤维（见图5），S为PC12与心肌细胞之间的突触（见图6）。
4 讨论本研究以NGF诱导后的交感神经元样PC12细胞与新生大鼠心肌细胞共培养和体外构建组织工程化心肌片层的研究为基础，以NGF诱导后的交感神经元样PC12细胞与新生大鼠新室肌细胞为种子细胞，以胶原、Matrigel为支架材料，进行构建具有神经支配的工程化心肌片层的初步探索性研究。
通过组织学、免疫组化的检测与透射电镜的观察，发现PC12细胞在三维条件下，经NGF诱导产生较长的神经突起；PC12细胞与心肌细胞在三维条件下共培养，神经细胞生长的神经突起呈放射状到达心肌细胞的表面与心肌细胞一起跳动，且长出的神经突起能与原代心肌细胞形成形态上非常疑似突触连接的结构。