基因打靶 cre-loxp重组酶系统

基因打靶
基因打靶包括：胚胎干细胞的获得和培养、打靶载体的构建、重组ES细胞的筛选、嵌合体小鼠的制备、基因敲除小鼠的建立、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除、基因敲入和大规模ES细胞突变库的建立。

基本概念：
1.基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。

2.基因敲除：是使用基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内。

3.丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。

基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。

4.基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。

它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。

自1987年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来，基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展，成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。

一、胚胎干细胞的获得和培养基因打靶中用的小鼠ES细胞系有：D3、E14、R1、J1、CCE，均来源于129小鼠品系和其杂交品系（因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物）。

ES 623和B6-III
ES细胞系，来源于C57BL/6小鼠品系。

BALB/c-I，来源于BALB/c小鼠品系。

常用的饲养层细胞为PMEF（小鼠原代胚成纤维细胞。

PMEF需6 Gy的X 射线照射或丝裂霉素C处理细胞抑制生长后才能用作饲养细胞）。

建立ES细胞的过程中，最好采用只传了2-3代的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，所取得的ICM（内细胞团）只有10％-30％的几率建立ES细胞系。

一旦ES 克隆被确定，接下来应该考虑检查ES细胞的核型。

2、ES 细胞的核型分析建立的ES细胞有相当的比例（30-50％）不具备正常核型，故需进行核型分析。

C带技术进行核型分析：小鼠细胞有40条染色体（19对加两条性染色体）。

常染色体和X染色体的中心着色很深，而Y染色体的着色很浅。

3、ES 细胞的扩增一旦ES细胞系中高比例的细胞被确定有正常二倍体染色体数目，这一ES细胞需要较大量扩增和冻存。

每5－6天ES细胞需经胰蛋白酶消化，以有效的低密度接种到新鲜培养基中，以保持细胞的不分化状态。

60mm平皿最大细胞密度1-2×107。

二、打靶载体的构建打靶载体通常包括2个同源重组臂，用于指导打靶载体和染色体上的靶基因序列发生同源重组。

同源重组臂上含有一个正筛选基因（neo），通过G418筛选，一个负选择标记的胸苷激酶（tk）基因。

三、重组ES细胞的筛选 1. 饲养细胞的准备；2. ES细胞的准备；3. 转染ES细胞；4. 挑取ES克隆；5. 96孔板ES细胞备份与细胞冻存；6. Southern 杂交。

四、嵌合体小鼠的制备 1. ES细胞的复苏；2. ES细胞的囊胚注射。

注意：每天留一些ES细胞备第二天注射，注射通常持续1-2周；ES细胞注射到3.5天的小鼠囊胚，每只囊胚可注射10-20个ES细胞，注射的胚胎移入2.5天
的假孕小鼠的子宫，每个子宫可接受9-10个囊胚。

五、基因敲除小鼠的建立选择嵌合率高的雄性子鼠×野生型雌性小鼠。

六、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除 Cre/loxP：来自P1噬菌体，Cre重组酶基因和loxP序列位于P1噬菌体基因组内，loxP是Cre酶的识别序列。

FLP/FRT：来自酵母，FRT是FLT酶的识别序列。

Cre（FLP）重组酶有删除/整合、倒位、转位等功能。

基本策略是通过类似于基因敲除的方法将两个loxP位点同向引入倒要删除的基因片段两侧。

建立条件性基因敲除需要分三步进行：1、通过同源重组的方法在待测删除片断的两侧引入同向的loxP位点（此步同ES细胞的打靶，只是载体不同），用Cre的瞬时表达载体转染ES细胞克隆，在Cre酶下发生DNA重排。

2、构建一个在特定组织和发育阶段表达Cre酶的转基因小鼠。

3、将前两步获得的小鼠杂交，在子代小鼠转筛选特定组织中基因敲除的小鼠。

七、基因敲入基因敲入：用一个设计好的基因片段来取代基因组中的特定片段和将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定片段中，这一技术也是建立在Cre－loxP系统基础上。

基因敲入有两条途径删除选择标记基因：第一条途径是引入loxP位点的同源重组后，引入Cre基因瞬时表达载体，在ES细胞内瞬时表达Cre，删除两个loxP位点之间的序列，然后用该ES细胞建立相应的小鼠品系。

第二条途径是先引入loxP位点的ES细胞建立一个小鼠品系，与一种Cre转基因小鼠品系杂交，最后建立基因敲入的小鼠品系。

八、大规模ES细胞突变库的建立在ES细胞中利用基因捕获方法建立随机突变的ES细胞库是目前广受瞩目的研究计划。

基因捕获（gene trap）技术有很多形式，在建立ES细胞突变库中最常用有两种：启动子捕获和3‘poly A
信号捕获。

启动子捕获：将不带启动子的筛选基因（LacZ、neo）和完整的polyA信号序列组成打靶载体，在筛选基因前可放一个RNA剪接受体，将载体转染ES细胞，进行随机插入ES细胞染色体。

如果筛选基因恰好插入内源基因启动子下游，并在ES细胞中表达，那么筛选基因就可被转录，通过抗性筛选。

因插入导致基因的失活，相当于进行了基因打靶过程，可以实现高通量的基因突变库，获得大量插入靶点明确的ES细胞克隆。

3‘端加尾信号捕获：利用一个缺失polyA信号的选择基因，置于广泛表达的启动子下游，同时在筛选基因下游放置RNA剪接的共体序列，构建打靶载体，利用该打靶载体转染ES细胞后，如果筛选基因恰好位于某加尾信号上游，那么筛选基因在转录时可以利用内源基因的polyA信号补上polyA序列，使得筛选基因的倒翻译。

筛选具有抗性的ES细胞克隆就能富集这些插入事件。

•Cre-loxp system
Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。

•Cre重组酶：Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp，编码38kDa蛋白质。

Cre 重组酶是一种由 343 aa的单体蛋白。

它能识别特异的 DNA 序列，即 loxP 位点，使 loxP位点间的基因序列被删除或重组。

Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何辅助因子，可作用于多种结构的 DNA 底物，如线形、环状甚至超螺旋 DNA。

•LoxP（locus ofX-overP1）序列：由两个13bp反向重复序列和中间间隔
的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。

Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合区域。

其序列如下：
5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5' •Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：
1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；
2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；
3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。

•另外，Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。

利用这一特点，人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列，以用于特定的基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。

•折叠编辑本段Cre-LoxP重组酶系统的应用策略
•基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。

首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。

下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。

Cre-LoxP 系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP
位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。

或者将Cre基因置于可诱导的启动子控制下，通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP 位点之间的基因切除（诱导性基因敲除），实现特定基因在特定时间或者组织中的失活。