肿瘤基因突变检测标本要求.
肿瘤基因突变检测
肿瘤基因突变检测癌症是一类难以预防的疾病，中晚期癌症治愈的可能性又很小，而早期癌症的治愈率可达65%以上，有些肿瘤可达90%以上，因此，战胜癌症的关键是早期发现癌症。
由于癌症早期常无特殊症状，甚至毫无症状，故癌症的早期发现、早期诊断主要是通过定期健康体检和人群筛查完成。
目前筛查癌症的方法主要是通过化验血肿瘤指标及B超、CT、MRI、PET-CT 等检查，但这些方法的敏感性和特异性均不高，发现有异常时往往已是中晚期。
17种常见高发肿瘤，包括乳腺癌（breast cancer）、结肠癌（colorectalcancer）、子宫癌（endometrial cancer）、脑胶质瘤（glioma）、白血病（leukemia）、肺癌（lungcancer）、淋巴癌（lymphoma）、成神经管细胞瘤（medulloblastoma）、黑色素癌(melanoma)、间皮瘤(mesothelioma) 、多性骨髓瘤(multiple myeloma) 、卵巢癌(ovarian cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer) 、真性红细胞增多(polycythemia vera) 、前列腺癌(prostatecancer) 、肾细胞癌(renal cell cancer)和恶性内瘤(sarcoma)，其发病机制涉及与多种肿瘤发生共同相关的肿瘤易感基因群介导的分子改变，参与了肿瘤发生的早期分子事件。
系统寻找和探讨它们在肿瘤发生发展过程中的遗传学变异，对阐明肿瘤早期发生机制及寻找肿瘤早期预警、早期诊断和早期治疗的分子靶标都具有重要的现实意义。
利用高通量分子测序技术平台，可同时开展多个肿瘤基因突变检测项目，如EGFR、K-RAS 、N-RAS、B-RAF、PI3K 、p53、p16、BRCA1、BRCA2等。
K-RAS 基因(K-ras,p21)突变检测KRAS基因（K-ras,p21）检测是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法，通过检测不仅可以深入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出针对抗表皮生长因子受体靶向药物治疗有效的大肠癌患者，帮助医生选择对肿瘤病人最有效的治疗方法。
癌症基因突变检测—标本运输
癌症基因突变检测—标本运输概述癌症基因突变检测是一项重要的诊断方法，可以帮助医生确定癌症患者的治疗方案。
为了确保检测的准确性和可靠性，标本的运输过程至关重要。
本文档旨在介绍癌症基因突变检测标本的正确运输方法。
标本运输前的准备在运输标本之前，需要进行以下准备工作：1. 标本选择：选择适合检测的标本类型，如血液、组织样本等。
确保标本的数量足够，以满足检测的需求。
2. 标本采集：使用正确的采样工具采集标本，并遵循标本采集的相关指南。
3. 标本储存：将采集好的标本正确存放在适当的中，并根据要求进行冷藏或冷冻。
标本运输在标本运输过程中，需遵循以下步骤：1. 包装标本：将标本安全地包装在密封的中，以防止泄漏或损坏。
确保标本的密封性能良好，可以耐受运输过程中的震动和压力。
2. 温度控制：根据标本类型的要求，选择适当的温度控制方法。
对于需要冷藏的标本，使用冷藏剂或冰袋保持低温。
对于需要冷冻的标本，使用干冰或液氮进行冷冻保护。
3. 运输标签：在标本上粘贴清晰可读的运输标签，包括患者的姓名、标本类型、采集日期和运输日期等信息。
4. 运输方式：选择可靠的运输方式，如专业物流公司，确保标本能够安全且及时地送达目的地。
在选择运输方式时，确保符合相关的法规要求和运输规定。
标本运输后的处理标本运抵实验室后，进行以下处理：1. 标本接收：实验室接收标本后，应进行确认并记录标本的相关信息，包括运输日期和标本完整性等。
2. 标本储存：实验室将标本储存在适当的条件下，根据实验需要进行保存和处理。
安全注意事项在标本运输过程中，需要注意以下事项：1. 避免直接接触标本：在装填标本、更换干冰等操作时，应戴上手套，避免直接接触标本，以防止交叉污染。
2. 避免破损和泄漏：在包装标本时，确保标本完整无破损，并使用可靠的密封措施，避免标本泄漏。
3. 遵守法规要求：运输标本时，需遵守相关的法规要求和运输规定，确保标本的安全性和合规性。
以上是关于癌症基因突变检测标本运输的简要介绍。
肿瘤项目样本要求
检测样本及要求1、肿瘤基因突变、表达检测样本要求：手术组织、新鲜组织、穿刺组织、10%中性福尔马林固定，石蜡包埋的组织；石蜡白片：10张（5um）或5张（10um）的白片，为保证切片组织中含有足够比例的肿瘤细胞（>70%），需要加同一张HE染色片（或邮件告之送检标本HE染色后肿瘤细胞量）。
新鲜组织：手术或穿刺标本，采集的标本切成黄豆粒大小2-3个，迅速放到1.5ml 的EP管中（内装有1ml样本专用保存液，用无水乙醇代替也可）。
尽可能采集肿瘤组织，癌旁或正常组织会影响基因检测的灵敏度。
样本运输：所有白片需在切好后2周内常温送检，如用EP管，管口用封口膜密封，以防运输过程中渗漏。
将送检样本的病理号写于申请单上。
样本拒收标准：非10%中性福尔马林固定组织；送检样本信息与申请单不符者；组织自溶、退变的。
2、肿瘤基因多态性检测样本要求：外周血，EDTA抗凝，2-3ml（2ml即可）。
样本运输：冰袋冷藏运输，如用EP管，封口膜密封，以防运输过程中渗漏。
样本拒收标准：样本与检验申请单信息不符者，或申请单信息缺失者；未使用合适抗凝剂；容器破损，有渗漏者或选择不当；出现溶血、严重凝血等情况。
3、HER2：FISH检测必须标注一定是白片（固定在切片上的），不能放在EP管中，PCR法检测可放在EP管中。
样本要求：10%中性福尔马林固定，石蜡白片：4um，4-5张，防脱硅胶片，为保证切片组织中含有足够比例的肿瘤细胞（>70%），需要加同一张HE染色片。
样本运输：所有白片需在切好后2周内常温送检，并将送检样本的病理号写于申请单上。
样本拒收标准：送乳腺癌检测，非浸润性乳腺组织的；非10%中性福尔马林固定组织的；非防脱硅胶片的。
4、HBV、HCV检测样本要求：血清，2-3ml（1ml即可）。
样本运输：冰袋冷藏运输，如用EP管，需封口膜密封，以防运输过程中渗漏。
样本拒收标准：样本与检验申请单信息不符者，或申请单信息缺失者；容器破损，有渗漏者或选择不当。
肿瘤组织基因检测不合格-概述说明以及解释
肿瘤组织基因检测不合格-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述肿瘤组织基因检测在近年来得到了广泛的应用和关注。
通过对肿瘤组织的基因检测，可以了解肿瘤的发生机制、遗传变异情况以及患者可能的治疗反应。
然而，随着肿瘤组织基因检测的普及，也出现了一些不合格的检测结果。
本文将对肿瘤组织基因检测不合格的问题进行探讨和分析。
首先，我们将介绍肿瘤组织基因检测的重要性，包括其在个体化治疗中的作用以及对临床决策的影响。
然后，我们将详细介绍肿瘤组织基因检测的流程和方法，以帮助读者更好地理解该技术的应用和潜在问题。
接下来，我们将探讨肿瘤组织基因检测不合格的可能原因。
这些原因包括样本采集和处理的问题、测试方法和设备的选择以及数据分析和解读的误差等。
我们将通过分析这些问题，帮助读者了解为何会出现不合格的检测结果，以及如何避免这些问题的发生。
最后，我们将探讨肿瘤组织基因检测不合格可能对临床治疗和患者带来的影响，并提出解决肿瘤组织基因检测不合格的方法。
这些方法包括对检测流程的优化、技术设备的升级以及专业人员的培训和规范化等。
通过采取这些措施，我们可以提高肿瘤组织基因检测的准确性和可靠性，为患者提供更加有效的个体化治疗策略。
本文的目的是希望引起人们对肿瘤组织基因检测不合格问题的重视，并提出相应的解决方案。
通过更好地了解和解决这些问题，我们可以更好地利用肿瘤组织基因检测的优势，为患者提供更好的治疗效果，并推动个体化医疗的发展。
1.2文章结构文章结构本文将从肿瘤组织基因检测的重要性、检测的流程和方法以及可能导致不合格结果的原因三个方面进行论述。
首先，我们将介绍肿瘤组织基因检测的重要性，说明其在肿瘤诊断、治疗选择以及预后评估中的作用。
其次，我们将详细介绍肿瘤组织基因检测的流程和方法，包括样本采集、DNA/RNA提取、基因检测技术的选择和数据分析等方面的内容。
最后，我们将探讨肿瘤组织基因检测不合格的可能原因，如技术问题、样本质量、数据解读等因素可能导致检测结果的不准确性。
EGFR基因突变(ARMS法)检测标准操作规范
EGFR基因突变(ARMS法)检测标准操作规范EGFR基因突变（ARMS法）检测标准操作规范1、目的：明确EGFR基因突变（ARMS法）检测操作、结果判断、报告内容及质控管理规程，保证检测结果的可靠性。
2、执行人：李文辉、郭志云3、试剂来源：苏州为真生物医药科技有限公司4、质控物：阴性、阳性对照均为试剂配套。
5、实验操作步骤：5.1 DNA提取FFEP样本DNA的提取(QIAGEN)（1）切片、烤片：切3~5张厚度为8~10μm的组织片，捞至普通玻片上（若为小组织，则切10张，同一玻片可捞多张），60℃考片30分钟；大组织另外切一张3μm组织片进行常规HE染色，作病理评估之用。
（2）脱蜡：将组织切片置于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10min；随后浸入100%乙醇3min。
将组织切片依次室温置于100%、80%、70%梯度乙醇中各2min，复水后，室温浸入去离子水3min。
（3）评估、刮片：组织片经病理评估后，用洁净盖玻片刮取癌组织密集区域，并转移至洁净的1.5ml EP管中；小组织全部刮取至1.5ml EP管中。
（4）消化：加入180μl ATL和20μl蛋白酶K，震荡混匀，根据组织大小可增加消化液的用量，56℃，1h，根据组织大小可延长消化时间甚至过夜消化（期间可以适当摇晃颠倒样品，使之混匀裂解充分；可裂解至组织消化完）。
（5）升温：将温度调至90℃，作用1h（注意管盖，90℃高温可能会导致爆盖以致液体被蒸发；时间不要太长1小时足够；一个水浴锅时，56℃到90℃之间过渡时应将样本置于室温中，待温度完全升到90℃后再将样本放进去）。
（6）短暂离心使液体聚于管底，加入200μl AL，震荡混匀，然后加入200μl无水乙醇，震荡混匀。
（7）短暂离心使液体聚于管底，将整个液体全部移入收集柱中，然后8000rpm 离心1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。
（8）加入500μl AW1漂洗液，离心8000rpm，1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。
脑肿瘤标本的正确采集方法
脑肿瘤标本的正确采集方法一、脑肿瘤病理检查、影像学检查采集取样1、病理检查病理检查是指通过穿刺、活检等方式，取出脑肿瘤组织进行病理检查，能够明确肿瘤的性质，从而为后续的治疗提供准确的方案。
2、影像学检查影像学检查是指CT、核磁共振等，通过影像学检查能够了解到肿瘤的大小、位置等情况，还可以了解到周围的神经和血管是否受到了压迫，对疾病的治疗有一定的帮助作用。
除此之外，脑肿瘤的取样还包括脑脊液检查等。
二、脑部肿瘤基因检测样本采集方式1、基因检测样本采集方法基因检测主要针对的是肿瘤组织本身的DNA，因此需要采集肿瘤组织样本。
对于脑部肿瘤，一般有以下几种样本类型可供采集。
（1）手术组织样本手术组织样本是目前采集脑部肿瘤样本的主要方式，一般是在手术过程中通过手术器械采集肿瘤组织，然后送到实验室进行基因检测。
手术组织样本采集的优点是样本质量高，适用于各种基因检测。
（2）穿刺组织样本穿刺组织样本是通过穿刺或者抽取肿瘤组织进行采集，一般适用于无法手术的患者。
但是穿刺组织样本采集的质量相对较低，有可能会影响基因检测结果。
（3）体液样本体液样本主要是指脑脊液，是通过腰椎穿刺采集。
但是，脑脊液中的肿瘤细胞数量较少，因此对于一些基因检测来说，样本数量不足可能会影响结果。
2、注意事项采集脑部肿瘤基因检测样本时，需要注意以下几点：（1）手术前准备需要提前告知患者采集样本的具体过程和注意事项，并且检查患者是否存在过敏史和药物过敏等情况。
（2）手术时注意手术时需要选择合适的采集器具，避免对肿瘤组织造成损伤，同时要避免采集到正常组织，以免影响检测结果。
（3）样本保存采集完样本后，需要尽快将样本送到实验室进行处理，同时需要注意样本保存的温度和时间，避免样本失效。
3、基因检测的意义脑部肿瘤的基因检测可以帮助医生更加准确地判断肿瘤类型和治疗方案。
例如，某些基因突变会导致肿瘤对某些化疗药物产生抗药性，如果能够及时发现这些基因突变，就可以避免使用无效的化疗药物，从而提高治疗效果。
《肿瘤突变负荷检测及临床应用中国专家共识(2020 年版)》要点
《肿瘤突变负荷检测及临床应用中国专家共识（2020 年版）》要点以免疫检查点抑制剂（ICIs）为主的免疫治疗显著提高了晚期恶性肿瘤患者的客观缓解率（ORR）和总生存期（OS），然而整体单药有效率不足20%，且费用普遍较高，也常伴随不同程度的免疫相关不良反应。
因此，亟需寻找准确可靠的生物标志物筛选免疫治疗的潜在获益患者。
以肿瘤基因变异数目为特征的肿瘤突变负荷（TMB）显示出与ICIs疗效的相关性，但在临床研究和实践过程中TMB评估尚缺乏统一标准。
1 TMB的定义TMB一般指特定基因组区域内每兆碱基对（Mb）体细胞非同义突变的个数，可以间接反映肿瘤产生新抗原的能力和程度，已被证实可预测多种肿瘤的免疫治疗疗效。
【专家共识】：TMB 一般是指特定区域内体细胞非同义突变的个数，通常用每兆碱基有多少个突变表示（XX 个突变/Mb）。
TMB评估受样本质量和数量、检测基因组大小、生信分析方法等多种因素影响，临床应用前应了解TMB的适用范围。
不同检测方法获得的TMB应进行系统评估,判断是否具有可比性。
TMB 数值可反映肿瘤内产生肿瘤新抗原的潜力，与DNA修复缺陷密切相关，在多种肿瘤中dMMR和MSI-H患者具有较高的TMB。
2 TMB的临床意义2.1 组织TMB可作为免疫治疗独立的疗效预测生物标志物【专家共识】：tTMB是一个新兴的独立ICIs治疗疗效预测标志物，与多种肿瘤类型ICIs单药或两种ICIs联合治疗的疗效相关，已证实可作为泛癌种免疫治疗疗效的预测标志物。
推荐既往标准治疗后疾病进展且没有更好替代疗法的实体瘤患者，尤其是高TMB的患者进行TMB检测，有助于扩大免疫治疗获益人群。
中国人群TMB的独立预测价值仍需更多前瞻性研究验证。
2.2 血液TMB与tTMB具有显著相关性【专家共识】：目前研究证据显示在NSCLC中bTMB与tTMB 具有显著相关性，但bTMB 检测无统一标准。
多项回顾性研究发现高bTMB与NSCLC患者接受单药ICIs治疗获益显著相关，但尚未获得高级别前瞻性临床研究证实。
肿瘤相关突变基因检测试剂(高通量测序法)性能评价通用注册技术审查指导原则
附件1肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用注册技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是针对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、适用范围本指导原则所述肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价主要是指基于高通量测序（high-throughput sequencing）即下一代测—1 —序（next generation sequencing，NGS），又称为大规模平行测序（massively parallel sequencing，MPS），体外检测人体组织肿瘤细胞中的肿瘤相关基因变异。
用于检测体细胞突变的NGS正在广泛用于肿瘤诊疗相关的分子检测，包括对特定基因的DNA/RNA进行测序，以寻找与肿瘤临床诊疗相关的基因变异。
肿瘤基因突变类型包括点突变、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常等广义的基因突变。
基于NGS测序原理的体外诊断（In Vitro Diagnosis，IVD）检测可能包括以下步骤：样本收集、处理和保存、核酸提取及处理、文库制备、测序和碱基识别、序列比对、变异识别和过滤、变异注释和解读以及检测报告的生成。
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用于突变检测的标本
• 肺叶切除 • 肺段切除 • 支气管镜活检 • 细针穿刺活检
手术 病理评估合格的 标本适用于EGFR 基因突变检测 标本 细胞学 标本
• 支气管刷片 • 胸水
活检 标本 血液学 标本
• 血浆
• 血清
建议采用灵敏度 高的ARMS检测 方法
• 痰
肿瘤基因突变检测标本类型
• 石蜡组织标本
• 细胞学标本
1、胸水样本、心包积液、脑脊液等，建议在收到标本后两个小时内离心收集沉淀细胞进行 检测，如来不及操作可离心后将沉淀冻存至-20℃保存，等使用时取出；亦可将沉淀包埋成 蜡块后再切片检测； 2、或者将样本直接放置4℃保存过夜再离心收集沉淀，可能会一定程度影响DNA的完整性 ，但一般不影响实验结果。细胞学标本建议涂片后经病理诊断含有肿瘤后在进行检测。
• 冰冻标本
– 组织离体后立即速冻<1h
病理评估不达标样本导致EGFR突变检 测呈阴性结果
4 例肺肿块切除标本EGFR突变检测呈阴性
肺转移性肝细胞性肝癌
小细胞性肺癌
肿瘤细胞太少
未检测到肿瘤组织
Rubbish In; Rubbish Out
选择正确、合适的肺癌组织，是保证突变检测成功第一步及重要的步骤
不同类型标本处理方式
• 新鲜组织标本：
• 1、迅速低温放置，如有条件可放置-80℃或者液氮保存，如果没有条件可使用-20℃保 存，但是保存时间不宜太久； 2、放入组织保存液中保存，组织保存液的能渗透0.5cm厚度的组织，因此用组织保存液 保存时，建议组织不宜过大。核酸在组织保存液中 37 ℃稳定存放1天，25 ℃稳定存放一 周，4 ℃ 1个月或–20 ℃长期存放 1、手术、穿刺、活检标本等放入10%中性福尔马林中固定后制作成蜡块，可保存数年之久 。(病理科常规处理样本方式)
• 血液标本
1、血液标本收集后使用EDTA抗凝，由于血浆、血清中游离核酸以及循环肿瘤细胞量极少 ，建议尽可能在收集标本后2小时内进行核酸提取，以避免核酸更深降解。
手术标本
标本接收、固定
组织处理、石蜡包埋
切片及H&E染色
组织学观察
• 标本通常较大，能提供足够的肿瘤组织用于检测 • 标本可以是冰冻或福尔马林固定组织
标本的病理评估内容
• 诊断：确保肿瘤组织是非小细胞性肺癌 • 肿瘤量：确保有足够的肿瘤组织用于突变检测 尽量保证200-400个肿瘤细胞 对于技术成熟的实验室，可以尝试进行<200个肿瘤细胞的标本检测
5-10uM 10张切片能满足突变检测需求
当细胞数较少时,可以适当增加切片数,以满足检测需求
• 固定包埋组织
• 细胞学标本 • 血液标本
血清、血浆标本：含肿瘤DNA，但含量不稳定，DNA片段化 循环血肿瘤细胞：可得较高质量肿瘤DNA，但量很少
1. Dacic S. Adv Anat Pathol 2008; 15(4):241-247. 2. Sequist LV, et al. Clin Cancer Res 2006; 12(14S):4403s-4406s. 3. Bai H, et al. J Clin Oncol 2009; 27(16):2653-2659.
收集胸水50-500mL 室温静置30分钟，吸去上清，剩余 5-50mL 沉淀物室温250g离心10分钟，吸去上清
低温保存
酒精固定涂片
福尔马林定切片
标本的质量控制
• 福尔马林固定的标本
– 固定要及时，离体后即时处理<1h – 固定液：10% 中性缓冲福尔马林（新鲜配制） – 固定液的量：应为组织体积的10倍以上 – 固定时间：小组织6-12h，大标本6-48h
支气管镜活检
标本较小 通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理 建议采用灵敏度高的ARMS检测方法
细针穿刺活检
标本较小 通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理 建议采用灵敏度高的ARMS检测方法
细胞学标本
涂片、染色 胸水或支 气管刷片 或痰液 液基细胞学
细胞蜡块，切片染色
病理诊断 病理诊断 病理诊断
• 肿瘤比例：标识肿瘤丰富的区域，提高肿瘤细胞比例用于检测
尽量去除非肿瘤组织及细胞，提高检测的敏感性 不同敏感性的检测方法对肿瘤比例要求不一样 测序法：〉10% ARMS法：〉1%
• 冰冻组织
– – – – – – – 外科手术标本：最好标本，可得高质量肿瘤DNA 支气管镜、穿刺活检测标本：量少，但肿瘤DNA质量仍好 外科手术标本：可得足量肿瘤DNA，但DNA片段化 支气管镜、穿刺活检测标本：可得肿瘤DNA量少且片段化 胸水、肺泡冲洗液和痰液标本：肿瘤细胞含量不确定，通常很少
• 细胞学标本中通常肿瘤细胞数目较少，需要采用灵敏度高的ARMS检测方法
• 建议有条件的病理科制备细胞蜡块：
– 处理流程：细胞学标本经离心处理后，常规福尔马林固定、处理及石蜡包埋即可 – 制备细胞蜡块的好处： （1）便于长期保存；（2）方便用于EGFR基因突变的检测及其他分
子生物学标记物的检测
四、胸水标本处理流程