多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)试剂盒使用说明
多酚氧化酶的分离纯化、蛋白质含量、活性测定及电泳
多酚氧化酶的分离纯化、蛋白质含量、活性测定及电泳博哥(中山大学化学与化学工程学院，广州510275)摘要多酚氧化酶与植物组织培养的酶促褐变以及果蔬品质密切相关。
本实验选取蘑菇、茄子、马铃薯为实验材料，提取PPO的粗酶液，再通过考马斯亮兰法法测定蛋白质含量，并采用邻苯二酚、L-多巴为底物，测定PPO活性，最后，进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳。
结果显示，马铃薯酶液中PPO含量最多为15766 μmol·L-1，其次是蘑菇为13931 μmol·L-1，茄子酶液PPO最少，含量为4061μmol·L-1。
但是，以邻苯二酚或多巴为底物时，茄子的比活力最高，蘑菇与马铃薯酶液的比活力相近。
聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，茄子酶液中存在较多同工酶，蘑菇与马铃薯则较少。
关键词多酚氧化酶考马斯亮兰法聚丙烯酰胺凝胶电泳1引言多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO，EC.1.10.3.1)是植物体内普遍存在的一类铜结合酶。
多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。
在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。
在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。
现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。
多酚氧化酶与植物组织培养的酶促褐变以及果蔬品质密切相关。
因此，研究多酚氧化酶（酪氨酸酶）的抑制，对防止水果、蔬菜的褐变，化妆品中的皮肤增白，以及因酪氨酸酶催化产生黑色素引起的疾病（黄褐斑等色素沉着性皮肤病等），具有非常重要的治疗意义。
本实验选取蘑菇、茄子、马铃薯为实验材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。
土壤多酚氧化酶(Solid-Polyphenol oxidase,S-PPO)试剂盒说明书
货号：MS2934 规格：100管/96样土壤多酚氧化酶（Solid-Polyphenol oxidase，S-PPO）试剂盒说明书微量法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：S-PPO主要来源于土壤微生物、植物根系分泌物及动植物残体分解释放，催化土壤中芳香族化合物氧化成醌，醌与土壤中蛋白质、氨基酸、糖类、矿物等物质反应生成有机质和色素，完成土壤芳香族化合物循环，用于土壤环境修复。
测定原理：S-PPO能够催化邻苯三酚产生有色物质，后者在430nm有特征光吸收。
自备实验用品及仪器：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、乙醚50mL（不允许快递）和蒸馏水。
试剂组成和配制：试剂一：粉剂×1瓶，临用前加入12mL蒸馏水，用不完的试剂仍4℃保存；试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存；试剂三：乙醚50mL×1瓶，4℃保存；（自备）样品处理：新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30~50目筛。
测定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至430nm，蒸馏水调零。
（注意：1、因乙醚粘度小，易掉液，吸取前需先将枪头在上层液里润洗2~3次，再转移测定；2、乙醚易挥发，转移到96孔板后立即测定，最好一个一个测定）。
S-PPO活力计算：a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准条件下测定的回归方程为y = 8.97x -0.003；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值A。
单位的定义：每天每g土样中产生1mg 紫色没食子素定义为一个酶活力单位。
S-PPO活力（mg /d/g 土样）＝(A+0.003) ÷8.97×V反总÷W÷T=80×(A+0.003)T：反应时间，1h=1/24d； V反总：反应体系总体积0.6mL；W：样本质量，0.02g。
b.用96孔板测定的计算公式如下第1页，共1页标准条件下测定的回归方程为y = 4.485x -0.003；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值A。
多酚氧化酶制备与性质
多酚氧化酶制备与性质多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是存在于多种植物、真菌和动物体内的一种酶类。
它主要参与生物体内多酚类物质的氧化反应，是一种铜酶，催化氧化物质依靠两种配位的单核铜中心。
多酚氧化酶具有高度的催化活性和种类多样的底物适应性，常用于食品产业、医药业和环境污染治理等方面。
多酚氧化酶分离、纯化和制备是开展其相关研究和应用的前提。
其制备方法可分为传统分离、分子生物学技术和重组工程等三种方法。
传统分离方法是采用离心、滤纸剖分、离子交换层析、凝胶过滤层析或超滤等方法，通过化学检测和活性检测手段获得多酚氧化酶。
但这种方法存在着操作麻烦、纯化度低、产率不高等缺点。
分子生物学技术则是利用基因克隆和表达工具，从源头上获得多酚氧化酶基因序列进行提取和纯化。
目前研究中常用的是PCR扩增、应用大肠杆菌或酵母菌实现异源表达等方法。
重组工程方法是指将多酚氧化酶基因定向插入宿主细胞中，结合合理培养条件，利用重组合成技术得到具有高活性和高特异性的多酚氧化酶。
这种方法的优势在于产量高、纯度高且结构相对稳定。
多酚氧化酶性质的主要特点包括多酚类物质的高效氧化反应、菌落变色和储存特性。
多酚类物质的高效氧化反应：多酚氧化酶主要针对多酚类物质进行高效氧化反应。
例如，多酚氧化酶可以催化咖啡因氧化成黑色物质，其颜色变化的过程符合米氏方程（Michaelis-Menten equation），表现出一定的反应速率和反应程度。
菌落变色特性：多酚氧化酶具有天然菌落颜色的变色特性，这是因为多酚氧化酶可以催化多酚类物质氧化成黑色色素，从而产生的颜色变化可以用于分析检测和实验研究。
储存特性：多酚氧化酶可以保存在含钾的磷酸盐缓冲液中，并且可以在冷藏条件下保持其催化活性和稳定性。
但是为了避免酶的降解和变性，一般应该避免恶劣的环境和条件。
综上，多酚氧化酶是一种广泛存在于生物体内的酶类，具有高效催化和底物适应性等优势。
其制备方法包括传统分离、分子生物学技术和重组工程等三种方法。
多酚氧化酶结构简式
多酚氧化酶结构简式1.引言1.1 概述概述:多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)是一类广泛存在于动物、植物和微生物中的酶类。
它们在生物体内起着重要的催化作用，参与多酚化合物的氧化反应。
多酚氧化酶是一类相对复杂的酶，具有多种结构类型和催化机制。
在生物体中，多酚氧化酶通常表现出明显的催化活性，使得多酚化合物发生氧化反应。
这些多酚化合物主要是一些具有酚性羟基的化合物，例如酪醇、儿茶酚等。
多酚氧化酶催化作用产生的氧化产物可以具有颜色，可使黄色的多酚化合物转变为棕色或黑色，这在水果和蔬菜的切割表面暴露于空气时常常会观察到。
这种氧化反应在生物体内起到一定的保护作用，限制了氧化反应对生物体的损害。
多酚氧化酶具有多种不同的结构类型，如多聚物、双功能酶等。
酶的催化活性往往与其特定的结构密切相关。
通过对多酚氧化酶结构的研究，可以更好地理解其催化机制，并为其在工业和农业等领域的应用提供理论基础。
本文将重点介绍多酚氧化酶的结构特点、分类和功能，并探讨其在生物体内的重要性和在不同领域的应用前景。
对于进一步理解和应用多酚氧化酶具有重要的意义。
1.2文章结构1.2 文章结构本文将按照以下结构进行论述多酚氧化酶的相关内容：1) 引言：首先对多酚氧化酶进行一个概述，解释其定义和功能。
这一部分将介绍多酚氧化酶在生物体内的重要性和作用机制。
2) 正文：接着，将详细讨论多酚氧化酶的分类和特点。
这部分将对多酚氧化酶的不同分类进行介绍，包括酪氨酸酶、过氧化物酶和过氧化氢酶等。
同时，还将探讨多酚氧化酶的结构特点，如其催化机制和底物特异性等。
3) 结论：最后，将总结多酚氧化酶在生物体内的重要性以及其未来的应用前景。
这一部分将强调多酚氧化酶在生物学研究、制药工业和环境保护等领域的潜在应用，并展望其可能的发展方向。
通过以上结构，本文将全面而系统地介绍多酚氧化酶的结构简式，使读者对多酚氧化酶有一个清晰的了解。
同时，也将为该领域的研究者提供一定的参考和启发，以推动多酚氧化酶的进一步研究和应用。
酶活测定方法
二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定一、目的要求了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。
二、基本原理多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醍类化合物，醍类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。
在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。
多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大光吸收峰。
因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。
三、材料、仪器及试剂（一）材料梨、苹果、马铃薯等。
（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（lOOmL、1000 mL）。
（三）试剂1.100 mmol/L、pH 5. 5 醋酸缓冲液母液A （200 mmol/L醋酸溶液）:量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馅水稀释至1 000 mLo母液B （200 mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27. 2 g三水合乙酸钠），用蒸馅水溶解、定容至1 000 mLo取68 mL母液A和432 mL母液B混合后，调节pH至5. 5 ,加蒸/留水稀释至1 000 mL o2.提取缓冲液（含1 mM PEG、4% PVPP 和1% Triton X-100）称取340 mg PEG 6000 （聚乙二醇6000）、4 g PVPP （聚乙烯毗咯烷酮，Polyvinyl - polypyrrolidone ）,取1 mL Triton X-100 ,用100 mmol/L > pH 5.5 醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mLo3.50 mmol/L 邻苯二酚称取275 mg邻苯二酚，用50 mmol/L、pH 5. 5醋酸缓冲液溶解、稀释至50 mLo四、实验步骤（-）酶液制备称取5.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4°C、12 000Xg离心30 min,收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。
1 多酚氧化酶活性测定
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化 生成醌。醌有颜色，在525nm下有最大光吸收，通过分光光 度法测定反应体系颜色变化可测定酶活性。 三、器材与试剂 1、仪器：低温离心机、s22pc分光光度计 2、试剂：儿茶酚、pH 7.2磷酸缓冲液 3、材料：马铃薯
四、实验步骤： 1．称取马铃薯0.5克，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，少许 PVP，研磨匀浆，转移到离心管，再用2.5mL pH 7.2磷酸缓 冲液冲洗研钵，合并提取液。4℃ 4000rpm离心15分钟，上 清液即为粗酶液。 2．在试管中，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，1.5mL 儿茶酚 以及1mL 粗酶液，空白调零以1mL磷酸缓冲液代替粗酶液。 3．A值测定：加入粗酶液后迅速混匀，立刻于525nm下测定 反应体系的A值，每隔30秒记录一次，共记录5次。 4．计算酶活力。按下式计算 PPO活性＝U/min gFW A值增加0.01定义为一个酶活力单位。
植物生物学实验
实验一
多酚氧化酶（PPO）活性测定
末端氧化酶：处于生物氧化一系列反应的最末端， 把电子传递给O2的酶。 1、细胞色素氧化酶 2、交替氧化酶 3、酚氧化酶: 分为单酚氧化酶和多酚氧化酶。 4、乙醇酸氧化酶 5、抗坏血酸氧化酶
一、实验目的： 掌握测ห้องสมุดไป่ตู้多酚氧化酶活性的方法；了解多酚氧化酶的特性 二、实验原理：
五、实验报告： 计算所测材料的PPO活性。选择A值变化均匀的三组数 值求平均值。
马铃薯多酚氧化酶的分离钝化中所用的实验技术
马铃薯多酚氧化酶的分离钝化中所用的实验技术马铃薯多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）是一种广泛存在于植物细胞内的氧化酶，在水果和蔬菜加工中发挥着重要作用。
由于其具有强氧化作用，它可以在加工过程中抑制色素、气味和味道的变化。
因此，分离PPM与钝化处理（inactivation）是加工马铃薯产品中非常重要的一步。
本文就分离和钝化PPM的实验方法作一详细报道。
一、实验设计实验的目的是通过胰蛋白酶分离马铃薯多酚氧化酶，然后通过过滤、冷冻干燥和钝化处理，使PPM能够抵抗非常低的温度和相对湿度，以保持它在制备马铃薯加工产品时良好的功能性。
为了实施以上实验，首先从马铃薯中提取 Enzyme Raw Powder （ERP），然后用进行分离和纯化的方法，将ERP中的PPO分离出来，进行过滤、冷冻干燥和钝化处理。
最后，测试所得的产品是否符合特定的质量要求。
本研究中使用的所有原料都来自经过性能认证的合格的马铃薯中提取的低PPM。
二、PPM萃取ERP中的酶分子通常不能直接分离出来，一般采用胰蛋白酶（trypsin）分解ERP中多酚氧化酶中的蛋白质，以溶解PPM，并将其从ERP中分离出来。
在实验中，ERP通过减压滤饼制成粉状，然后加以混合和萃取，得到含有PPO的悬浮液。
在萃取过程中，要考虑时间、温度、pH值、萃取次数，以及胰蛋白酶的用量等因素，以保证分离效果的最佳化。
三、PPO的过滤将萃取的悬浮液通过SMB技术（spontaneous migration morphsim）进行过滤，以获得PPO滤渣，然后再对其进行过滤、冻结干燥和静电分集等技术处理，可实现对PPO的进一步纯化和分离。
本实验采用的技术是根据回收率和活性结合电泳(electrophoresis)以及紫外-可见光谱(ultraviolet–visible spectroscopy)、高效液相色谱(high performance liquid chromatography)、活性元素大小分馏(size exclusion chromatography)等多种方法，达到实验要求的高质量产品。
多酚氧化酶的实验报告
1. 了解多酚氧化酶的活性测定原理及方法。
2. 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的操作技术。
3. 通过实验，分析影响多酚氧化酶活性的因素。
二、实验原理多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。
在适宜的条件下，PPO催化酚类物质氧化形成醌类物质，使植物组织发生褐变。
本实验采用分光光度法测定多酚氧化酶活性，以邻苯二酚为底物，通过测定反应过程中吸光度的变化来计算酶活性。
三、实验材料与试剂1. 材料：新鲜马铃薯、0.1mol/L邻苯二酚溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液、NaF溶液、5%三氯乙酸溶液、硫脲、0.01mol/L间苯二酚、蒸馏水。
2. 仪器：分光光度计、匀浆机、离心机、恒温水浴、移液器、试管等。
四、实验步骤1. 酶液的制备：取新鲜马铃薯150g，洗净后切块，加入150mL NaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。
取滤液50mL，于3500r/min离心5-10min，取上清液。
2. 酶活性测定：取3支试管，分别编号为A、B、C。
向A、B、C三管中加入0.1mol/L邻苯二酚溶液1mL、pH6.8磷酸盐缓冲液2mL，向A、B管中加入酶液0.5mL，C管不加。
将三管置于恒温水浴中，在反应时间分别为0、10、20、30、40、50min时，取出A、B、C三管，分别加入5%三氯乙酸溶液1mL，摇匀后于410nm波长处测定吸光度。
3. 数据处理：以邻苯二酚为标准曲线，计算酶活性。
五、结果与分析1. 标准曲线的绘制：以邻苯二酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 酶活性计算：根据标准曲线，计算不同反应时间下的酶活性。
3. 影响酶活性的因素分析：通过实验，分析温度、pH、底物浓度、酶浓度等对酶活性的影响。
1. 成功掌握了分光光度法测定多酚氧化酶活性的原理及操作技术。
2. 通过实验，分析了影响多酚氧化酶活性的因素，为后续研究提供了依据。
七、实验讨论1. 在实验过程中，发现温度对酶活性有显著影响。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）试剂盒使用说明
可见分光光度法50管/24样
货号:BC0190
测定意义：
PPO（EC1.10.3.1）是一种广泛存在于植物体内的含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。
测定原理：
PPO能够催化邻苯二酚产生邻苯二醌，后者在410nm有特征光吸收。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体，60mL×1瓶，4℃保存，用前混匀；
试剂一：液体，40mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体，10mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：液体，20mL×1瓶，4℃保存；
粗酶液提取：
1、收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1000μ
L提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次）；8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
2、称取约0.2g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。
8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
试剂名称（μL）测定管对照管
试剂一600600
试剂二150150
样本150
煮沸的样本150
37℃(哺乳动物)或30℃（其它物种）中准确水浴10min后，迅速放入冰浴中冷却试剂三300300
充分混匀，5000g，常温离心10min，收集上清，用蒸馏水调零，410nm处检测测定管和对照管吸光度。
PPO活性计算：
1、组织中PPO活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每分钟每mg组织蛋白在每ml反应体系中使410nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
PPO（U/mg prot）=V反总×V样总÷V样÷T÷0.01×（A测定-A对照）÷Cpr=80×（A 测定-A对照）÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每分钟每g组织蛋白在每ml反应体系中使410nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
PPO（U/g鲜重）=V反总×V样总÷V样÷T÷0.01×（A测定-A对照）÷W=80×（A 测定-A对照）÷W
2、细菌或培养细胞中PPO活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每分钟每mg组织蛋白在每ml反应体系中使410nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
PPO（U/mg prot）=V反总×V样总÷V样÷T÷0.01×（A测定-A对照）÷Cpr=80×（A 测定-A对照）÷Cpr
（2）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每分钟每1万个细菌或细胞在每ml反应体系中使410nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
PPO（U/104cell）=V反总×V样总÷V样÷T÷0.01×（A测定-A对照）÷细菌或细胞密度（104/mL）=80×（A测定-A对照）÷细菌或细胞密度（104/mL）=80×（A测定-A对照）÷细菌或细胞密度（104/mL）
V反总：反应体系总体积，1.2mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.15mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，0.2g.
注意事项：不同样本的多酚氧化酶最佳的反应温度略有差别，可在25-37℃之间进行调节。