反相液相色谱系统峰及其形成原因
反相液相色谱鬼峰来源及排除
反相液相色谱鬼峰来源及排除高效液相色谱中梯度方法观察到的鬼峰有许多可能的原因，然而几乎总有一个共同的机制即：当流动相具有较高的洗脱强度时，流动相中有紫外吸收的有机杂质在柱上聚焦成组分带，并随后在梯度中洗脱。
这些流动相杂质的潜在“来源”是广泛的。
鬼峰的其他原因包括流动相输送的物理或机械方面、样品引入和固定相效应。
色谱图可能包含来自各种来源的鬼峰，这使得鬼峰问题的整体解决非常困难。
我们按如下方法排查，可查看鬼峰的来源。
1.流动相一般情况污染源一般来源于流动相，但是流动相有很多组成，需要我们逐步按下面顺序去排查。
1）流动相中的盐或离子对试剂污染①流动相中不添加盐或离子对试剂，按原先的方法运行查看是否还有鬼峰。
如有说明和其他方面有影响。
如没有或减少很大部分，说明盐或离子对试剂产生的鬼峰较多。
②如没有或减少很大部分，可减少盐和离子对试剂，如减少原来一半，运行查看是否鬼峰面积减少，来此判断流动相中的盐或离子对试剂产生鬼峰。
但是对离子对试剂来说，洗脱的有机相比例越高鬼峰是越多的如100%ACN 或100%MeOH，方法开发时也可以减少洗脱溶剂的比列。
②流动相易长菌，可查看流动相瓶中有没有悬浮物，尽量现配先用，对纯盐流动相，建议3天内更换。
2）水①液相一般建议使用超纯水配制流动相，相对一般的纯化水要干净许多，避免一些不必要的异常峰。
②水长期放置可能长菌，一般3天至少换一次。
③怀疑水质量问题，有污染，可更换屈臣氏水来运行方法。
3）有机溶剂①有机溶剂尽量选择纯度较高，级别至少色谱级。
②怀疑有机溶剂问题，更换不同厂家的试剂。
2.色谱柱①把色谱柱更换成双通运行查看。
②更换同类型色谱柱，或清洗色谱柱后运行查看。
3.样品污染①怀疑样品被污染，可不进样空针运行查看，在进一针空白溶剂相互对比就可以排查样品是否被污染。
4.系统被污染①可能流动相里的过滤头有污染,不锈钢的超声清洗，玻璃的可用稀硝酸清洗，玻璃的一般建议更换。
②流路被污染。
反相液相色谱鬼峰来源
反相液相色谱鬼峰来源2016-07-26作者：Bruce Lee来源：药渡网1.概述在反相液相色谱分析方法开发过程中，采用等度洗脱时，先洗脱组分的色谱峰峰宽较窄，后洗脱组分的色谱峰峰宽较宽；而梯度洗脱方式，则具有分析时间短(特别是对于样品组分复杂的情况来说)，在梯度范围内各色谱峰的峰宽近乎一致等特点。
梯度洗脱时色谱峰纵向扩展可控特点，可参考下图1进行理解。
基质或者样品组分比较复杂时，梯度洗脱是反相液相色谱最常用的操作模式，而主要在梯度洗脱中出现的鬼峰是特别让人头疼的。
有可能由于来源排查不清以及解决方案不到位而导致原来的方法在实际的应用与转移过程中出现问题，甚至面临重新开发方法的尴尬境地。
鬼峰意即来源不清，不可指认，时有时无，对目标峰或者样品纯度测试产生干扰作用的峰，如下图2所示，即为典型的鬼峰，一般来讲，鬼峰的出现与色谱柱无关(当然，梯度洗脱时，梯度设置不合适的情况除外)。
对于含量或者纯度检测方法而言，在主峰位置或附近出现鬼峰的话，影响到方法的专属性以及检测结果准确性(如下图3)。
特别地，对于药物制剂或者API的纯度测试来说，要求对降解产生的杂质之外的杂质来源做出较详细的说明(如反应副产物或者反应原料带入等)。
鬼峰的出现，可能增加此项工作的难度与工作量。
此外，鬼峰需要与梯度洗脱时由于梯度的突然变化引起的梯度峰进行区分，如下图4所示，在20min处由于梯度的陡然变化，造成流动相组成的急剧改变引起流动相折光特性发生很大的变化，而出现梯度峰(其峰形与所定的检测波长有关)。
在梯度洗脱模式下，可以通过避免突然大范围改变流动相的组成来避免尖锐的梯度峰的出现，同时也有助于减少泵的故障率。
2.鬼峰来源与解决方案鬼峰来源多种多样，理论上讲，在HPLC系统中任何一个节点均有可能引入鬼峰，依据鬼峰出现的频率，其主要来源于流动相部分，样品制备以及自动进样部分，仪器流路及检测器部分等，如下图5所示。
2.1仪器流路及检测器引起的鬼峰仪器流路中的残留气泡可以引起鬼峰，保留时间一般不可重现，即使流路中气泡连续存在，鬼峰出现的位置亦不可预测。
反相高效液相色谱出峰顺序
反相高效液相色谱出峰顺序
反相高效液相色谱（Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）的出峰顺序一般按照溶剂极性的降序进行分离。
随着溶剂极性的提高，溶质的极性也会增加，因此，极性较低的溶质通常会先被洗脱出峰。
所以，一般来说，极性较低的化合物或特定的溶质会先出现在RP-HPLC的峰图中，而极性较高的化合物或溶质则会后出现。
这个顺序是根据溶剂的极性来确定的，常用反相高效液相色谱中，常用的溶剂是水和有机溶剂的混合物，如甲醇、乙腈等。
一般来说，水的极性较高，而有机溶剂的极性较低。
因此，当采用水和有机溶剂混合物作为洗脱溶剂时，峰的顺序通常是从极性低到高依次出现。
需要注意的是，具体的峰顺序可能还会受到其他因素的影响，例如样品的具体性质、色谱柱的性质等。
在实际分析中，要根据具体条件进行分析和定量。
8种常见液相色谱峰解析常见原因及解决办法
8种常见液相色谱峰解析，常见原因及解决办法！对于每一个身经百柱的实验人员来说，液相色谱图是他们打开未知物质世界的大门，科研中的很多问题都能从色谱图中得到很好的反映，有些问题可以通过改变设备参数得到解决，而有些问题则必须通过修改操作程序来解决，毕竟，正确选择色谱柱和流动相才是得到好的色谱图的关键。
小编在此根据大家实践中可能会经常遇到的一些图谱问题进行了整理汇总，大家一起来看一下吧。
1、拖尾峰1、筛板阻塞：柱子两头的过滤筛板如果堵塞，样品就会在筛板部分受阻而形成时间延迟，使得样品在柱后流出时峰型形成拖尾。
需要通过反冲色谱柱，或者更换筛板。
2、色谱柱塌陷：是指色谱柱由于其它原因引起了柱效率丧失，不能对物质形成保留，使得物质不在固定相上保留而随流动相流出，但是又还有一点柱效，因此形成拖尾。
需要重新填充色谱柱或者更换色谱柱。
3、有污染：即样品不在同一起跑线起跑，从后面开始跑得到达终点稍晚，表现出拖尾。
更换色谱柱或者采用有机溶剂梯度洗脱1h以上，以冲洗柱子。
4、流动相PH值选择错误：如某PH下有的样品存在分子型和离子型的动态平衡，离子型的陆续向分子型转化就会表现出拖尾。
调节PH值可抑制分子解离，改善拖尾，对于碱性化合物，相对较低的PH值更有利于得到对称峰。
2、前沿峰1、样品过载：被保留的样品在正常出峰时间前陆续出来，形成前沿峰。
降低样品含量。
2、样品溶剂选择不恰当：当样品溶剂的洗脱能力大大强于流动相时会出现前沿峰，例如，在反相色谱中用已腈做样品溶剂，而流动相的洗脱力较弱时会出现前沿峰。
选择流动相或者接近流动相的比例作为样品溶剂。
3、色谱柱损坏：色谱柱柱效损失，不能对物质形成保留。
更换色谱柱。
4、在大峰前有小峰出现，假象前沿峰，即大峰前包埋了没有分开的小峰。
调整流动相洗脱梯度。
3、倒峰1、样品折射率小：示差折光检测器测的信号是折射率，出现倒峰的原因是组分的折射率小于流动相。
2、密度的原因：密度不一样，出来的峰正倒不一样。
液相色谱出现分叉峰
液相色谱出现分叉峰可能是由以下几个原因引起的：
色谱柱出问题：分叉峰可能是由于色谱柱损坏或老化导致的。
你可以尝试更换一根新的色谱柱来解决这个问题。
此外，还要确保色谱柱的使用和储存条件符合要求，并检查是否有任何可能引起损坏的因素。
流动相问题：分叉峰可能是由于流动相组成不正确或污染引起的。
确保使用正确的流动相，并进行适当的净化和过滤来减少污染物的存在。
还要检查流动相的流速是否正确，流速过高可能会导致分离不良和分叉峰的出现。
样品问题：分叉峰可能是由于样品中存在多种物质或不纯导致的。
尝试纯化样品，并调整样品组成以提高分离效果。
如果可能，使用其他检测方法（如质谱检测）来确认所观察到的分叉峰不是来自样品中的杂质。
仪器问题：分叉峰可能是由于仪器问题引起的。
检查和校准仪器的各个部分，确保仪器的性能和参数符合要求。
如有必要，联系仪器供应商进行维护或修复。
总之，当液相色谱出现分叉峰时，需要综合考虑色谱柱、流动相、样品和仪器等多个方面的可能问题，并逐步排除或解决每个问题，以获得更好的分离效果。
若无法解决，建议咨询专业的色谱分析师或仪器供应商寻求进一步的帮助和建议。
梯度峰(鬼峰)形成原因
反相梯度高效液相色谱法中的鬼峰（假峰）：回顾和更新司徒威廉姆斯*英国，布里斯托尔BS10 7ZE，施勋道，阿斯利康，Avlon公司，R&D公司分析化学，工艺研发部2004年6月10日收到；004年7月2日修订；2004年7月7日收稿摘要：介绍了反相梯度高效液相色谱法的新的例子和鬼峰源，并与以前的出版物相比较，扩宽了对鬼峰问题认识的视野。
第一个新样本鬼峰的获得取决于加强梯度系统中由一个时间段未交付的强“溶剂b”造成的多个问题。
在第二个样本中的鬼峰取决于有机溶剂的增塑剂污染。
本文包括了对鬼峰反相梯度高效液相色谱法一致运行的提示和建议。
2004爱思唯尔b.v. 版权所有。
关键词：梯度高效液相色谱法；鬼峰；系统峰；色谱基线；水，甲醇，乙腈溶剂；反式脂肪酸；文物目录：（省略）1.介绍在高度监管的制药行业“控制”是基本的生产和分析的所有方面。
梯度反相高效液相色谱法能使分析物混合体的分析在单次运行过程中拥有广泛的极性和保留的特点，对于许多应用来说，这种方法比等度方法有显著优势。
不过，梯度高效液相色谱法有时会受到看似随意的和无法控制的“鬼峰”问题困扰，尤其是在现有的设备和材料的质量不好时，或者是分析师没有意识到所涉及的敏感机制。
当鬼峰突然出现在梯度反相高效液相色谱时，分析师可能会觉得分析不受控制，并可能诉诸最终更耗时和昂贵的、效率较低的等度方法。
但是，如果有人明白鬼峰的起源，以及知道如何应对，那么梯度反相高效液相色谱法可以稳定、可靠的运行。
在以前的文献中使用的术语包括鬼峰，人工峰（和假峰）[1]，系统峰[2]，伪峰[3]，空置峰[4]，艾根峰[2,5]，诱发峰[6]和寄生峰[7]等。
由于缺乏共同术语，使得研究问题变得困难[1]，现在，“鬼峰”是较为常出现的术语[1,4,8–11]，本文将全文应用该术语。
为什么梯度反相高效液相色谱法能观察到鬼峰也许有很多可能的原因，但鬼峰的出现几乎总是只有一个共同的机制。
反相液相色谱系统峰及其形成原因
反相液相色谱系统峰及其形成原因2016-10-17作者：Bruce Lee来源：药渡网1概述在反相液相色谱中，死体积附近往往会形成一个或一些正的或者倒的色谱峰，这些色谱峰独立于样品而存在，可以统称这些色谱峰为系统峰。
一般地，系统峰的产生与所使用的色谱柱，流动相添加剂以及起始有机相的比例有关。
从经典色谱塔板理论出发，流动相经泵混合经由管路系统引入到色谱柱内，流动相内的所有组分，均会在固-液两相之间分配，直到平衡。
而当样品或者其他与起始流动相组成比例不同的溶液被注入色谱柱的时候，色谱柱头部的各物质的分配平衡被干扰，每种物质的平衡状态被干扰之后再次回复到平衡状态的过程中，也就产生了系统峰，检测到的系统峰的种类与多少和采用的检测器的种类有关(如一些盐离子在紫外检测器上无法被检测到，却可以被CAD检测器检测到)。
如下图1所示，流动相为ACN：Water=4：96，添加剂TFA的浓度为0.1%，进样溶剂组成为ACN：Water=4.4：95.6，添加剂TFA的浓度为0.1%。
图中的正负色谱峰即为典型的系统峰。
2反相液相色谱系统峰的影响因素如前所述，反相色谱系统中，系统峰的形成与色谱柱，流动相的组成特别是添加剂的种类以及浓度有关，此外配置样品的溶剂的组成也是十分重要的因素。
如下图2A所示，流动相的组成为乙腈与纯水，添加剂为1：1的1,5-二氯蒽醌与1,8-二氯蒽醌，进样溶液为与流动相比例相同的乙腈与纯水；图2B所示，流动相的组成为乙腈与纯水，进样溶液为1：1的1,5-二氯蒽醌与1,8-二氯蒽醌溶液。
由上图2A与图2B，1,5-二氯蒽醌与1,8-二氯蒽醌在两张色谱图中互为镜像，此外区别还在与图2A与图2B中的两个色谱峰的峰面积的绝对值的差异。
上述现象，亦可说明反相液相色谱系统峰的形成与流动相的组成以及样品溶剂组成之间具有密不可分的关联。
又如下图3所示，流动相为乙腈-水体系，流动相中还添加有另外两种添加剂，浓度分别为0.001 M，采用等度洗脱模式。
液相色谱倒峰
液相色谱倒峰是指在色谱图上出现的峰形与正常峰形相反的现象。
通常情况下，色谱峰是从底部向上升的，但是当某些因素影响到色谱柱内的流动相或样品时，就可能出现倒峰现象。
液相色谱倒峰的原因可能有很多，下面列举几个常见的原因：
1. 样品的极性过高或过低，导致在色谱柱中无法与固定相很好地分离，从而导致倒峰。
2. 流动相的组成发生变化，如添加了新的溶剂或调整了流动相的浓度，导致样品与流动相之间的相互作用发生改变，从而引起倒峰。
3. 色谱柱的污染或老化，导致固定相的性质发生改变，从而影响到样品的分离效果。
4. 柱温控制不当，过高或过低的温度都可能导致倒峰现象。
针对液相色谱倒峰的解决方法，可以从以下几个方面入手：
1. 调整样品的极性，使其与固定相更好地分离。
2. 调整流动相的组成，如更换新的溶剂或调整浓度等。
3. 对色谱柱进行维护和清洗，确保其正常运行。
4. 调整柱温，使其保持在适宜的范围内。
总之，液相色谱倒峰是一种常见的色谱现象，需要根据具体情况采取相应的解决方法。
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反相液相色谱系统峰及其形成原因
1概述在反相液相色谱中，死体积附近往往会形成一个或一些正的或者倒的色谱峰，这些色谱峰独立于样品而存在，可以统称这些色谱峰为系统峰。
一般地，系统峰的产生与所使用的色谱柱，流动相添加剂以及起始有机相的比例有关。
从经典色谱塔板理论出发，流动相经泵混合经由管路系统引入到色谱柱内，流动相内的所有组分，均会在固-液两相之间分配，直到平衡。
而当样品或者其他与起始流动相组成比例不同的溶液被注入色谱柱的时候，色谱柱头部的各物质的分配平衡被干扰，每种物质的平衡状态被干扰之后再次回复到平衡状态的过程中，也就产生了系统峰，检测到的系统峰的种类与多少和采用的检测器的种类有关(如一些盐离子
在紫外检测器上无法被检测到，却可以被CAD检测器检测到)。
如下图1所示，流动相为ACN：Water=4：96，添加剂TFA的浓度为0.1%，进样溶剂组成为ACN：Water=4.4：95.6，添加剂TFA的浓度为0.1%。
图中的正负色谱峰即为典型的系统峰。
2反相液相色谱系统峰的影响因素如前所述，反相色谱系统中，系统峰的形成与色谱柱，流动相的组成特别是添加剂的种类以及浓度有关，此外配置样品的溶剂的组成也是十分重要的因素。
如下图2A所示，流动相的组成为乙腈与纯水，
添加剂为1：1的1,5-二氯蒽醌与1,8-二氯蒽醌，进样溶液为与流动相比例相同的乙腈与纯水；图2B所示，流动相的组成为乙腈与纯水，进样溶液为1：1的1,5-二氯蒽醌与1,8-
二氯蒽醌溶液。
由上图2A与图2B，1,5-二氯蒽醌与1,8-二氯蒽醌在两张色谱图中互为镜像，此外区别还在与图2A与图2B中的两个色谱峰的峰面积的绝对值的差异。
上述现象，亦可说明反相液相色谱系统峰的形成与流动相的组成以及样品溶剂组成之
间具有密不可分的关联。
又如下图3所示，流动相为乙腈-水体系，流动相中还添加有另外两种添加剂，浓度分别为0.001 M，采用等度洗脱模式。
该图可以更加直观地呈现多种添加剂存在的反相液相色谱
中系统峰变化的概况。
一般地，当我们对样品进行分析的时候，优先使用流动相溶解或者稀释样品，尽可能地减少由溶剂引起的一些不良的色谱现象(如溶剂效应等)，此外也能够减小进样操作对于色谱平衡状态的干扰程度。
但在医药工艺以及药物分析过程中，医药中间体以及终产品多含有酸/碱官能团，为了获得优异的色谱峰峰形，流动相中往往会添加有机酸碱添加剂甚至需要使用不同种类、不同pH的缓冲盐作为添加剂。
由于各种添加剂的使用，导致流动相的组成比较复杂，且各组成成分在色谱柱固定相以及流动相之间分配并达到平衡。
为了充分减少溶剂组成与流动相的组成不同引起的诸如溶
剂效应等一系列问题，我们会尽可能的使用流动相作为溶剂，但有的时候，待分析化合物对于酸或者碱性环境不稳定，这时为了保证样品分析时效内的稳定性，不可避免地要使用与流动相不同的溶剂来溶解样品。
除此之外，一些难溶性的样品，有时候会使用到DMSO或者DMF作为助溶剂，而与此同时，我们不可能在流动相中添加这些助溶剂，这也导致溶解样品的溶剂与流动相的组成不同的情形。
以上，我们也只是针对等度洗脱模式进行的讨论，而对于梯度洗脱模式，流动相中的各种组成成分的分配平衡过程就要复杂的多。
因此系统峰的出现，基本不可避免，特别是使用酸碱等具有强紫外吸收的添加剂，缓冲盐以及离子对试剂的时候。
3反相液相色谱系统峰的个数一般地来说，按照反相液相色谱系统峰理论，反相液相色谱流动相的组成为N的话，如果检测器允许，将可检测到N-1个系统峰，而系统峰的正负，与检测手段有关。
如下图所示，流动相组成为乙腈：水=4：96，其中添加TFA，浓度为0.1%；样品为空白，其组成为乙腈：水=4.4：95.6，其中添加TFA，浓度为0.1%。
从下图中，我们看到有四个色谱峰，依次为死体积处色谱峰，溶解氧色谱峰，TFA与乙腈的叠加色谱峰以及添加剂TFA引起的空穴效应倒色谱峰。
此外，从图中也可以看出，TFA与乙腈的叠加色谱峰面积的绝对值要大于添加剂TFA引起的空穴效应倒色谱峰面积的
绝对值，其原因也显而易见，在扣除乙腈所引起的色谱峰面积之后，二者面积的绝对值，在理论上讲，应该是一致的。
如上图实例，流动相中有水，乙腈，TFA以及溶解氧，共四种组分，而在色谱图上却只看到2个色谱峰（最后一个为空穴效应倒色谱峰）。
这是由于TFA在普通的C18色谱柱上容量因子较小，基本不能做到较有效的保留，引起与乙腈色谱峰的重叠，导致实际观察到的系统色谱峰个数减少的现象。
4反相液相色谱系统峰的形成的理论解释按照色谱塔板理论，将色谱柱等效为有限元个塔板，溶质在各塔板内均要达到分配平衡，经过适当演化，可得到下述两个数学模型，如下图5。
其中，mm为平衡时流动相中的溶质质量，k’为溶质的容量因子，ms为平衡时固定相中的溶质质量，mtotal为总质量；上角标t为任一时刻，下角标i为任一塔板。
假设流动相的组成为乙腈与水，其中添加0.1%的TFA，使用前经超声处理，将上述模型做以改变，如下图6所示在这里，首先假定乙腈在很小的变化范围内的时候，其分配系数维持常数，而TFA的分配系数则与乙腈的浓度呈现线性相关的关系。
按照上述模型进行计算机模拟，流动相组成为乙腈：水=4：96，添加剂为0.1%的TFA。
如上图7A所示，红色为进样乙腈：水=4.4：95.6，含有
0.1%TFA的空白溶液，蓝色为进样乙腈：水=4.4：95.6，绿色为乙腈：水=4：96，添加剂为0.1%的TFA；上图7B则为，红色为进样乙腈：水=3.6：96.4，含有0.1%TFA的空白溶液，蓝色为进样乙腈：水=3.6：96.4，绿色为乙腈：水=4：96，添加剂为0.1%的TFA。
上图7A与7B的区别在于乙腈引起的色谱峰的正负性以及TFA的色谱峰及其引起的空穴效应色谱峰的先后关系。
其中图7A与图4的实际色谱状况完全一致。
此外也可直观地对上述模拟结果进行解释，如对于图7A，进样溶液的乙腈的组成比流动相的组成要高0.4%，由于一定的小范围内乙腈的分配系数近似于常数，高浓度的乙腈色谱带经色谱柱后形成正色谱峰。
对于TFA，虽然进样溶液与流动相中的浓度均为0.1%，但是TFA的分配系数随乙腈浓度的变化而线性改变，当高浓度的乙腈溶液被注入色谱柱之后，由于该色谱带的乙腈浓度高，TFA在固定相内的分配相应减少而导致检测器处检测到正峰，在该进样色谱带之后，乙腈的浓度得到重新恢复，固定相中的TFA的分配势必得到增加，在检测器处形成空穴效应倒峰，如果仔细比较可以发现二者的紫外吸收光谱互为镜像。
如前所述，TFA基本不被C18色谱柱保留的特性，导致出峰位置与乙腈重合，可以使用PFBA作为相应的添加剂，其他
条件不变，对系统峰进行指认(PFBA能够被有效保留)，如下图8所示。
P1色谱峰为乙腈色谱峰，P2色谱峰为PFBA色谱峰，P3为溶氧色谱峰，P4为PFBA引起的空穴效应的倒峰，且其面积的绝对值与PFBA色谱峰面积的绝对值相等。
以上为等度模式下，系统峰所具有的特点及其形成原因。
在梯度模式下就相对比较复杂了。
与等度模式下一样，同样与色谱柱的类型以及流动相的组成以及配样溶液的组成有很大的关系。
一般地，对于强紫外吸收的添加剂，随着梯度的运行，早期色谱图上多会形成一个比较突出的色谱平台或鼓包。
5结论反相液相色谱中的系统峰，一般是独立于样品而存在的，其形状及形成的原因与流动相的组成，色谱柱的类型以及配制样品所用的溶剂有关。
系统峰的形成，可按照经典色谱塔板理论辅助计算机模拟进行解释，也可以根据分配-平衡进行简单描述。
然而，在梯度洗脱模式下，系统峰的形状以及形成原因还与梯度的斜率以及方法前平衡时间的长短有关。