反相高效液相色谱法
反相高效液相色谱法的样品制备技巧
反相高效液相色谱法的样品制备技巧反相高效液相色谱法（RP-HPLC）是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于化学、药学、环境科学等领域。
在进行RP-HPLC分析前，样品制备是一个关键的步骤，它直接影响到后续的分析结果。
本文将介绍一些反相高效液相色谱法的样品制备技巧，帮助读者提高分析的准确性和效率。
1. 样品的选择在进行RP-HPLC分析前，需根据目标化合物的性质选择合适的样品。
首先要考虑溶解性，通常选择合适的有机溶剂，如甲醇、乙醇或氯仿。
其次，还需考虑样品的纯度，如有需要，可通过预处理方法提高样品的纯度。
2. 样品的前处理在进行RP-HPLC分析前，有些样品需要进行前处理，以去除样品中的杂质和干扰物。
一种常见的前处理方法是固相萃取（SPE），它可以有效地去除有机样品中的杂质。
另外，还可以通过液液萃取、蒸馏、浓缩等方法进行前处理。
3. 样品的溶解样品的溶解是进行RP-HPLC分析的前提条件，因此需要选择合适的溶剂和溶解条件。
溶剂的选择应根据样品的性质和溶解度来确定，同时还需注意选择不会影响分析结果的溶剂。
溶解的温度和时间也需要控制好，通常在室温下充分溶解即可。
4. 样品的过滤样品中的杂质和颗粒物会对分析结果产生影响，因此需要对样品进行过滤。
常用的过滤方法包括滤纸、膜过滤和进样器过滤器等。
选择合适的过滤器材料和孔径，可以有效去除样品中的杂质。
5. 样品的稀释有时，样品的浓度过高会导致RP-HPLC分析结果不准确，因此需要对样品进行适当的稀释。
稀释的目的是使样品在浓度范围内，使目标化合物的峰色强度适中，避免超出检测范围或饱和。
6. 样品的进样在进行RP-HPLC分析时，样品的进样方式也很重要。
常见的进样方式包括定量进样和选择性进样。
定量进样是指按照一定的体积或质量加入样品，适用于测定目标化合物的含量。
选择性进样是指选择性地进样，可用于分析复杂体系中不同成分的含量。
7. 样品的保存对于未立即进行分析的样品，应选择合适的保存方式。
反相 高效液相色谱法
反相高效液相色谱法
反相高效液相色谱法（RP-HPLC）是一种常用的色谱分析技术，
它在化学分析、生物化学、药物研究等领域得到广泛应用。
反相色
谱法是一种基于相互作用性质的分离技术，利用不同物质在固定相
和流动相之间的亲疏性差异进行分离。
首先，让我来解释一下反相色谱的原理。
在反相色谱中，固定
相通常是疏水性的，例如碳链或芳香烃基团。
而流动相则是极性溶剂，例如水和有机溶剂的混合物。
样品溶液通过固定相时，极性物
质会更容易与流动相相互作用而更快地通过柱子，而非极性物质则
更容易与固定相相互作用而滞留更久。
这样，不同成分就会在柱子
中被分离开来。
反相色谱法有许多优点。
首先，它对极性和非极性化合物都具
有很好的分离能力，因此适用范围广泛。
其次，该方法操作简便，
分离效率高，分析速度快。
此外，反相色谱法还可以用于定量分析，因为峰面积与物质浓度成正比。
在实际应用中，反相高效液相色谱法被广泛用于药物分析、天
然产物分离提纯、食品安全检测等领域。
例如，药物研究人员可以
利用RP-HPLC技术分离药物中的杂质，从而确保药品的纯度和质量。
食品行业也可以利用该技术来检测食品中的添加剂和有害物质。
总的来说，反相高效液相色谱法是一种非常重要的分离分析技术，它在科学研究和工业生产中发挥着重要作用，并且随着技术的
不断发展和完善，它将继续发挥重要作用。
反相高效液相色谱法
分类
分配色谱（partition chromatography） 吸附色谱(adsorption …) 离子交换色谱(ion exchange …) 尺寸排阻色谱(size exclusion …)又称凝胶色谱
实验目的
1. 学习高效液相色谱仪的操作
2. 了解反相液相色谱法分离非极性化合物的基本原理 3. 掌握用反相液相色谱法分离芳香烃类化合物
2、按下述色谱条件设定色谱仪： 柱温：室温； 流动相流速：A泵：甲醇，0.9 mL/min B泵：蒸馏水，0.1 mL/min 泵最大压力：15 MPa 检测波长：254 nm 时间：6 min
3、根据仪器操作条件，待基线稳定后，分别进标准样品和 未知样品各10uL，获得标准样品和未知样品的谱图。
4、以标准样品谱图为基准，作单点标准曲线，然后求出未 知溶液中苯和萘的浓度。
2.高压定量进样阀（常用）
泵
泵
柱
柱
排放 进样
排放 进样
图 六通进样阀
色谱柱
标准柱型： 4.6mm或 3.9mm L: 15-30cm 填料粒度：5-10m
发展趋势： 填料粒度小 柱径小
装柱技术：干法：填料粒度大于20m时可用。
湿法（匀浆法）：配成悬浮液。高压泵压入 色谱柱，洗净备用
检测系统
K
组分在固定相中物质的浓度 组分在流动相中物质的浓度
Cs Cm
流动相为非极性而固定相为极性物质的色谱称正相液相 色谱法，以流动相为极性而固定相为非极性的色谱称反相液 相色谱法。将固定液键合到硅胶表面上，即所谓的键合固定 相。若将正构烷烃等非极性物质（如n-C18烷）键合到硅胶基 质上，以极性溶剂（如甲醇和水）为流动相，则可分离非极 性或弱极性的化合物。据此，采用反相液相色谱法可分离烷 基苯类化合物。
反相色谱法ReversedphaseHPLC
二、如何平衡色谱柱？
新色谱柱，应首先用0.2ml/min的流速将色谱 柱平衡过夜，然后将流速升高到1.0ml/min冲洗 30分钟，以便将色谱柱的填料充分平衡至最佳 状态。这样可以保证色谱柱的使用寿命，并且 保证在以后的使用中，获得分析结果的重现性。 平衡过程中，将流速缓慢地提高 用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓 冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的 时间来平衡)
再生方法： 1.极性固定相的再生： 正庚烷 氯仿 乙酸乙酯
丙酮
乙醇
水
2.非极性固定相的再生： 水 乙腈 氯仿(或异丙醇) 乙腈 水
3. 0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱
四、注意： 1.在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于 NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该 在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲 洗至碱溶液完全流出。 2.如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完 全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M的硫 酸冲洗非常有效。
正相色谱法的流动相极性小于固定相。样品 中极性小的组分先流出，极性大的后流出。正 相色谱法适于分析极性化合物。 氰基键合相以氰乙基取代了硅胶的羟基，极 性比硅胶小，选择性与硅胶相似，它主要用于 可诱导极化的化合物和极性化合物的分析。 氨基键合相以氨基取代了硅胶中的羟基，其 选择性与硅胶有很大的不同，主要用于分析糖 类物质。
in a mixture P'AB = φAP'A + φ BP'B
fraction in mixture
In HPLC, capacity factor k' can be manipulated by changing solvent composition best resolution/time when k' = 2-5
柱前衍生-反相高效液相色谱法
柱前衍生-反相高效液相色谱法1.引言1.1 概述概述部分的内容可以介绍柱前衍生-反相高效液相色谱法的背景和意义。
下面是一个概述的范例：正如我们所知，液相色谱法是一种常用的分离和检测分析技术，在化学、药学、环境科学等领域具有广泛的应用。
然而，传统的液相色谱法在某些情况下可能面临一些挑战，如分离效果不理想、分析时间较长等。
为了克服这些问题，柱前衍生-反相高效液相色谱法被提出并逐渐受到关注。
柱前衍生是指在样品处理中，在样品中引入适当的衍生试剂，通过与目标分析物发生化学反应，使其在色谱分析中具有更好的分离性能和检测灵敏度。
反相高效液相色谱法是基于分离样品中不同化学性质的分子在反相色谱柱上的亲水作用，达到分离和定量分析的目的。
柱前衍生-反相高效液相色谱法不仅可以提高色谱分析的分离效果，还能够提高检测灵敏度和减少分析时间。
这对于复杂样品的分析具有重要意义，例如药物代谢产物、环境污染物等。
通过引入适当的衍生试剂，可以有效地改善样品的分离性能，同时提高对目标分析物的响应，从而实现快速、灵敏的定量分析。
本文将对柱前衍生-反相高效液相色谱法的原理、方法和应用进行详细介绍。
首先，我们将阐述柱前衍生的基本原理和常用的衍生试剂。
然后，重点介绍反相高效液相色谱法的步骤和关键参数。
最后，我们将通过实例和应用案例来阐述柱前衍生-反相高效液相色谱法在药物分析、环境监测等领域的应用前景。
通过本文的阅读，读者将能够全面了解柱前衍生-反相高效液相色谱法的原理和实践，为他们的研究和实验工作提供参考和指导。
文章结构部分应包括以下内容：本文主要分为三个部分，即引言、正文和结论。
具体结构如下：1. 引言1.1 概述本部分将简要介绍柱前衍生-反相高效液相色谱法的研究背景和意义。
首先，说明柱前衍生技术在分析化学领域的重要性，该技术可以通过将样品与特定试剂反应生成易于分析的化合物，从而提高液相色谱分析的敏感性和选择性。
其次，介绍反相高效液相色谱法在分析化学中的广泛应用，包括药物分析、环境监测和食品安全等领域。
反相高效液相色潽法RP
RP-HPLC的特点和优势
特点
RP-HPLC具有高分离效能、高灵敏度、高选择性等优点。该方法能够分离复杂样品中的微量组分，特别适合于分 离和分析生物样品和环境样品中的有机小分子。
优势
RP-HPLC的流动相选择范围广泛，可以根据不同样品的性质选择合适的流动相，提高分离效果。此外，RPHPLC使用的固定相种类也较多，可以根据分离需求进行选择。该方法操作简便，易于自动化，可广泛应用于科 研和工业生产中。
有机污染物分析
RP-HPLC可用于检测水体、土壤等环境中的有机 污染物，评估环境质量。
工业废水处理监测
通过RP-HPLC，可以监测工业废水处理过程中有 害物质的去除效果。
化工产品分析
RP-HPLC可用于分析化工产品中的组分和含量， 控制产品质量和生产过程。
THANK YOU
提高了分离性能和选择性。
应用领域
RP-HPLC广泛应用于药物分析、生化研究、环境监测、食品安全等领域。在药物分析 中，RP-HPLC用于药物的分离、纯化和质量控制。在生化研究中，RP-HPLC用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和检测。在环境和食品安全领域，RP-HPLC用于检测和
监测各种污染物和有害物质。
原理
在RP-HPLC中，样品在非极性固定相和极性流动相之间的分配作用实现分离。 组分在固定相和流动相之间的溶解度差异导致不同的迁移速度，从而实现分离。
发展历程和应用领域
发展历程
RP-HPLC起源于20世纪60年代，随着高效液相色谱技术的发展而逐步完善。早期的 RP-HPLC使用硅胶作为固定相，后来逐渐发展为使用有机聚合物和混合模式固定相，
等领域。
电化学检测器
通过电化学方法对待测组分进 行氧化还原反应，从而进行检
反向液相色谱的工作原理
谁能告诉我一下反向液相色谱的工作原理吗？它与正向的有什么区别吗？高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。
分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。
常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。
适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。
常用于分离同分异构体。
2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。
分离过程是一个分配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。
由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。
现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。
正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
适用于分离非极性和极性较弱的化合物。
RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。
反相高效液相色谱法测定九种有机酸
以采用反相高效液相色谱法测定九种有机酸为例，探讨了流动相pH 值对分析结果的影响。
实验结果表明pH=2.40 时，九种有机酸得到有效分离，且峰形理想，而不同pH 值对分析结果影响很大，不仅会大大改变各有机酸的保留值，甚至会导致无法将各有机酸分离。
本文分析了影响测定流动相p H 值的因素。
应用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析测定时，常常采用离子抑制法即向含水流动相中加入酸、碱或缓冲溶液等改性剂，以使流动相的p H 值控制一定数值，抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾、改善峰形，以提高分离的选择性[1]。
例如在分析有机弱酸时，常向流动相中加入磷酸(或乙酸、三氯乙酸、1% 的甲酸、硫酸)，就可抑制溶质的离子化，获对称的色谱峰。
对于弱碱性样品，向流动相中加入1 % 的三乙胺，也可达到相同的效果[2~6]。
虽然RPC 方法建立时最好选用pH 微小改变不影响分离的流动相，但pH 值的较大变化往往会对分析结果产生很大影响，因此流动相pH 值的调节是分析过程中至关重要的一个环节，本文以反相高效液相色谱法测定九种有机酸为例考察了不同流动相p H 值对分析结果的影响，指出准确调节流动相p H 值的关键所在，有助于提高分析结果的准确性。
摘要以采用反相高效液相色谱法测定九种有机酸为例，探讨了流动相pH 值对分析结果的影响。
实验结果表明pH=2.40 时，九种有机酸得到有效分离，且峰形理想，而不同pH 值对分析结果影响很大，不仅会大大改变各有机酸的保留值，甚至会导致无法将各有机酸分离。
本文分析了影响测定流动相p H 值的因素。
应用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析测定时，常常采用离子抑制法即向含水流动相中加入酸、碱或缓冲溶液等改性剂，以使流动相的p H 值控制一定数值，抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾、改善峰形，以提高分离的选择性[1]。
例如在分析有机弱酸时，常向流动相中加入磷酸(或乙酸、三氯乙酸、1% 的甲酸、硫酸)，就可抑制溶质的离子化，获对称的色谱峰。
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反相高效液相色谱法
鬼针草为菊科植物鬼针草属多种植物的全草，药材资源丰富，广泛分
布于热带及温带地区，遍布全国各地，极易采集。
根据文献报道，鬼
针草属多种植物含有槲皮素成分［1］；槲皮素具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、镇痛、抗血小板聚集、扩张冠状动脉等作用［2～4］。
《中国药典》尚未收载鬼针草药材的质量标准。
《贵州中药材标准》
收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.、鬼针草BidensbipinataLinn.的干
燥全草，《湖南中药材标准》收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.的干燥
地上部分，《甘肃中药材标准》1995年收载鬼针草BidensbipinataLinn.，《广西中药材标准》1990年收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.、白花鬼针草BidenspoilsaL.var.radiataSch.-Bip.
的干燥全草，河南中药材标准1991年收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.、鬼针草BidensbipinataLinn.、金盏银盘
Bidensbiternata(Lour.)Merr.EtSherff.的干燥全草，《上海中药材
标准》收载鬼针草BidensbipinataLinn.（婆婆针）的干燥地上部分［5］。
从国内地方标准收载情况能够看出全国各地均有广泛的应用，
入药部位为全草或地上部分，本实验拟采用RP-HPLC法建立鬼针草属
药材中槲皮素的含量测定方法并比较鬼针草不同药用部位和不同种中
槲皮素的含量，为该类药材的传统入药部位是否准确和质量评价提供
参考依据。
1仪器与材料
美国waters2695高效液相色谱仪，VWD检测器；鬼针草采自云南红河州、广西，经刘圆副教授和戴斌教授鉴定为菊科鬼针草属植物狼杷草BidenstriparticaLinn.，白花鬼针草
BidenspilosaL.var.ratiataSch-Bip.，婆婆针BidensbipinataLinn.，三叶鬼针草BidenspilosaLinn.的干燥全草；槲皮素（批号081-9304，中国药品生物制品检定所，含量测定用）；甲醇为色谱纯；水为二次
重蒸水；其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件KrosmasilC18柱（4.6mm×250mm，5μm），柱温30℃，流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液（41∶59），检测波长360nm，流速
1ml·min-1。
槲皮素峰能够达到基线分离，峰形对称，分离度好，按
照槲皮素峰计，理论塔板数不应低于5000。
见图1～8。
图1槲皮素对照品色谱图（略）
图2三叶鬼针草（云南产）根色谱图（略）
图3三叶鬼针草（云南产）茎色谱图（略）
图4三叶鬼针草（云南产）叶色谱图（略）
图5狼杷草色谱图（略）
图6白花鬼针草色谱图（略）
图7婆婆针色谱图（略）
图8三叶鬼针草色谱图（略）
2.2供试品溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇配置成0.04mg·ml-1的溶液。
2.2.2样品溶液的制备称取鬼针草药材粉末（过40目筛）约1.0g，
精密称定，置圆底烧瓶中加入甲醇-25﹪盐酸溶液（4∶1）25ml，称定
重量，加热回流1h，取出，冷却至室温，用上述混合溶液补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45μm的微孔滤膜，作为样品溶液。
2.3线性关系的考察分别精密量取上述对照品溶液0.5，2，4，8，
20μl，在上述色谱条件下测定峰面积。
以进样量（μg）为横坐标，
峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=3×106X-33404，
R2=0.9999(n=5)。
结果表明槲皮素在0.02～0.80μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。
2.4精密度实验精密吸取对照品溶（0.04mg·ml-1）10μl，重复进样6次，测得峰面积的RSD为0.97%（n=6）。
结果表明精密度良好。
2.5稳定性实验精密量取样品溶液10μl，分别于0，2，4，6，8h测定。
按照槲皮素对照品峰面积计算RSD为0.6%（n=6）。
结果表明样品溶液在配制后8h内稳定。
2.6重复性实验取同一批样品溶液，精密称取6份，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定槲皮素的含量，RSD 为1.6%（n=6），表明重复性良好。
2.7回收率实验精密称取9份已知含槲皮素量的药材粉末0.25g，依次加入低、中、高3种质量浓度槲皮素对照品溶液，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定。
结果平均回收率为99.87%，RSD为0.9%（n=9）。
2.8样品含量测定按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按照“2.1”项下方法测定，不同部位测定结果见表1，不同种测定结果见表2。
表1三叶鬼针草不同部位中槲皮素的含量（略）
表2鬼针草属不同种中槲皮素的含量（略）
3讨论
实验曾考察了甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）；甲醇-0.4%磷酸溶液（45∶55）；甲醇-0.4%磷酸溶液（40∶60）；甲醇-0.4%磷酸溶液（41∶59）为流动相，流速1ml·min-1，柱温30℃，以KromasilC18柱（4.6mm×250mm，5μm）为分析柱。
本实验以甲醇-0.4%磷酸溶液（41∶59）为流动相，槲皮素峰能够达到基线分离，峰形对称，分离
度好。
本法简便、准确、重复性好，能够作为控制鬼针草属药材质量的标准之一。
就化学成分槲皮素的角度考虑，不同部位以叶入药最好，其次是茎，所以建议鬼针草属药材以地上部分为好；就不同种来说，以白花鬼针草槲皮素含量最高，质量最好。
反相高效液相色谱法。