影响反相高效液相色谱分离的因素
反相液相色谱法原理
反相液相色谱法原理：
反相色谱法是一种液相色谱技术，其原理是分析物与疏水固定相之间发生非极性、非特异性的相互作用。
在反相色谱系统中，通常使用的固定相是C18、C8苯基等。
流动相则是极性溶剂，例如水，可含缓冲液或用酸或碱调节pH。
这种色谱技术的分离效果受到流动相的极性和组成等因素的影响。
拓展资料
反相色谱法是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式．反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离．在生物大分子分离中，多采用离子强度较低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、异内醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作流动相．普通的反相色谱固定相和孔径大于300Å的硅胶键合烷基固定相应用较为普遍，聚合物基质的反相色谱固定相也有较多应用。
反相高效液相色谱法（RP-HPLC）使用亲水性的固定相和疏水性的移动相，利用样品分子在移动相和固定相之间的互作用力差异进行分离。
一、基本原理：
1.疏水性固定相：反相色谱柱通常使用疏水性的固定相材料，如疏水链状碳氢化合物改性的硅胶或封闭的C18链，使分析物在移动相中具有亲水性，与固定相表面发生疏水作用。
2.亲水性移动相：移动相一般由水和有机溶剂混合而成，亲水性较强。
通过调节有机溶剂的类型和浓度，可以控制移动相的极性，以实现分离不同特性的分析物。
3.受体相互作用：分析物在移动相中通过水合作用与亲水性的移动相发生相互作用，进而与固定相上的疏水链状结构发生疏水作用，从而实现分离。
液相色谱简介（反相）
高效液相色谱法（反相液相色谱）一、液相色谱法方法的分类和选择1、方法的分类：根据流动相和固定相极性的相对强弱，液相色谱法分为正相色谱法和反相色谱法。
两类色谱使用流动相极性顺序与物质的极性流出顺序恰好相反。
正相色谱法中通常固定相的极性较大，，如硅胶、氧化铝等，流动相极性小于固定相的极性。
实验时，流动相的选择从极性小到极性大递增，样品中极性弱的组分最先流出，随后是极性逐步增大的组分流出。
反相色谱中使用的固定相极性小，如C18键合的硅胶固定相，流动相的极性大于固定相的极性。
通常用水-甲醇作流动相时，样品中极性强的组分先流出，随后是极性较小的组分。
流动相的极性变化从最大的水开始，逐步增加甲醇的比例，流动相的极性逐步减弱。
在HPLC中应用最广泛的是反相分配色谱法（常称为反相色谱法）。
它是利用样品组分在流动相和固定相之间的溶解度之差进行分离。
在反相色谱柱中改变流动相组成、进行梯度淋洗和恢复柱子分配平衡容易实现，因此同一柱子可以长时间使用，柱效长久，重复性较好。
在反相色谱法中，极性大的组分先出峰，保留体积小，峰形扩散小，分离效率高，流动相价格便宜，毒性较小，容易得到。
正相色谱法大多利用吸附的原理进行分离，正相色谱法的柱子如使用强极性的流动相（如水、醇等溶剂）会使柱中吸附剂活性失去后很难恢复，特别是分离极性强的组分时，常常因为固定相的吸附作用使保留体积增大，引起峰的扩散和拖尾。
2、方法的选择：HPLC方法的选择主要取决于样品的组成、结构的类型、溶剂性能、相对分子质量范围等。
一般来讲相对分子质量大于2000的高分子化合物，主要采用凝胶色谱法进行分离。
相对分子质量小于2000的化合物可以利用它在水中和有机溶剂中的溶解度及溶解性质进行分离。
如极性大的水溶性化合物和在水中可解离的离子化合物，可用不同类型的色谱柱以离子色谱法进行分离；在水中溶解但不解离的化合物（如糖类）可用反相色谱法进行分离，以甲醇或乙睛-水作为流动相。
论述高效液相色谱中常用的分离模式及工作原理
论述高效液相色谱中常用的分离模式及工作原理高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是一种广泛应用于物质分离、纯化和定量分析的分析技术。
其高效性能主要得益于其独特的分离模式和工作原理。
在高效液相色谱中，常用的分离模式包括反相色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等。
本文将逐步解释这些分离模式的工作原理。
首先，我们来介绍反相色谱（RPLC）。
反相色谱是HPLC中最常见的分离模式。
在反相色谱中，固定相是由疏水性的支持物表面进行修饰而得到的。
样品溶液在流动相的推动下，通过与固定相之间的亲疏水相互作用来分离。
疏水性物质在反相色谱中相对亲疏水性中亲水性物质在反相色谱中相对疏水性物质分离的速度更快。
因此，反相色谱可以广泛应用于酚类化合物、脂肪酸、药物和多肽等的分离。
接下来是离子交换色谱（IEC）。
离子交换色谱是基于固定相上的阴、阳离子交换基团与样品中的离子进行离子交换作用来分离的。
在离子交换色谱中，固定相通常是一种离子交换树脂，它具有具体的功能基团，如硫酸基团、胺基团等。
在离子交换色谱中，样品溶液与离子交换树脂之间发生的离子交换反应决定着样品的分离效果。
离子交换色谱广泛应用于离子、氨基酸、蛋白质和核酸等的分离。
第三种常见的分离模式是凝胶过滤色谱（GFC）。
凝胶过滤色谱是基于样品中分子的分子大小来实现分离的。
在凝胶过滤色谱中，固定相是由合适的多孔性材料构成。
较大的分子无法穿过固定相的孔隙，因而会在流动相的推动下被留下，而较小的分子则可以穿过固定相的孔隙并进行解析。
凝胶过滤色谱常用于蛋白质、多肽、寡核苷酸和碳水化合物等的分离。
最后是亲和色谱（AFC）。
亲和色谱是基于样品分离物与固定相之间特定的亲和反应进行分离的。
在亲和色谱中，固定相常常是由一种具有亲和性和特异性的配体进行修饰得到的。
这种配体可以选择性地与目标分析物结合，而其他的干扰物则被保留下来。
流程及主要部件影响分离的因素高效液相色谱
②液相色谱固定相类型多，如离子交换色 谱和排阻色谱。等，作为分析时选择余 地大；而气相色谱并不可能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的 温度，一般有利于色谱分离条件的选择。
（3）由于液体的扩散性比气体的小 105倍，因此，溶质在液相中的传质速率 慢，柱外效应就显得特别重要；而在气 相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。
（l）气相色谱法分析对象只限于分 析气体和沸点较低的化合物，它们仅占 有机物总数的20％。对于占有机物总数 近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩 尔质量大的物质，目前主要采用高效液 相色谱法进行分离和分析。
（2）液相色谱能完成难度较高的分离 工作，因为：
①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的， 不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和 作用，样品分子只与固定相相互作用。而 在液相色谱中，流动相液体也与固定相争 夺样品分子，为提高选择性增加了一个因 素。也可选用不同比例的两种或两种以上 的液体作流动相，增大分离的选择性。
另一类是总体检测器，它对试 样和洗脱液总的物理或化学性质有 响应，属于这类检测器的有示差折 光，电导检测器等。
现将常用的检测器介绍如下:
目前最常用的检测器主要有：
紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器
光源
检测室
光栅
二极管阵 列检测器
紫外光度检测器（UV）：最小检测 量10-9g·mL-1，对流量和温度的波动不敏 感，可用于梯度洗脱。
(5)附属系统
它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自 动进样、馏分收集以及数据处理等装置。 其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中 尤为重要的附属装置。
梯度洗脱装置 梯度洗脱就是在分离过程中使
两种或两种以上不同极性的溶剂按 一定程序连续改变它们之间的比例， 从而使流动相的强度、极性、pH值 或离子强度相应地变化，达到提高 分离效果，缩短分析时间的目的。
温度对高效液相色谱分离性能的影响
温度对高效液相色谱分离性能的影响摘要】目的：考察不同温度对色谱分析性能的影响，从而寻找一种有效又简便的改善色谱分析性能方法。
方法：以某中药注射剂含量测定时在不同温度下的分离性能为例，根据测定数值考察温度与分离性能的变化关系。
结果：该中药注射剂出峰时间随温度升高分离速度加快，同时理论塔板数也随之增大，但随着温度的升高，某一成分的分离度降低，因此，选择温度还需综合考虑各项因素。
【关键词】高效液相色谱仪；温度；分析性能；分离度；理论塔板数【中图分类号】R91 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2017）31-0352-02对于高效液相色谱，温度是一个容易被忽视而又非常重要的因素。
升高色谱分析的温度,可以加快分析速度，减少有机溶剂的使用，是一个非常有效而又十分经济适用的方法，但因升高温度，出峰时间缩短，导致相邻峰之间分离度降低。
文中综述了温度对高效液相色谱分离特征的影响,介绍了温度作为一个便捷的调节参数在高效液相色谱中的应用前景。
1.试验器材1.1 仪器设备Agilent1200 高效液相色谱仪（包括四元泵、二极管阵列检测器、柱温箱、自动进样器、工作站）；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）；超纯水仪。
1.2 试剂色谱纯甲醇（美国TEDIA“天地”公司）；冰乙酸：天津科密欧化学试剂有限公司（色谱纯）超纯水某中药注射剂批号：01批、02批、03批、04批2.测定方法2.1 色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-1%冰醋酸溶液（13：87）为流动相；检测波长为280nm。
2.2 样品的测定2.2.1供试品溶液的制备精密量取样品5ml，置20ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.2测定法分别精密吸取供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.3 测定条件将色谱柱温度分别调至20℃、25℃、30℃、35℃、40℃处，对样品进行处理分析，测量样品在上述5个温度点的分离性能。
反相高效液相色潽法RP
RP-HPLC的特点和优势
特点
RP-HPLC具有高分离效能、高灵敏度、高选择性等优点。该方法能够分离复杂样品中的微量组分，特别适合于分 离和分析生物样品和环境样品中的有机小分子。
优势
RP-HPLC的流动相选择范围广泛，可以根据不同样品的性质选择合适的流动相，提高分离效果。此外，RPHPLC使用的固定相种类也较多，可以根据分离需求进行选择。该方法操作简便，易于自动化，可广泛应用于科 研和工业生产中。
有机污染物分析
RP-HPLC可用于检测水体、土壤等环境中的有机 污染物，评估环境质量。
工业废水处理监测
通过RP-HPLC，可以监测工业废水处理过程中有 害物质的去除效果。
化工产品分析
RP-HPLC可用于分析化工产品中的组分和含量， 控制产品质量和生产过程。
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提高了分离性能和选择性。
应用领域
RP-HPLC广泛应用于药物分析、生化研究、环境监测、食品安全等领域。在药物分析 中，RP-HPLC用于药物的分离、纯化和质量控制。在生化研究中，RP-HPLC用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和检测。在环境和食品安全领域，RP-HPLC用于检测和
监测各种污染物和有害物质。
原理
在RP-HPLC中，样品在非极性固定相和极性流动相之间的分配作用实现分离。 组分在固定相和流动相之间的溶解度差异导致不同的迁移速度，从而实现分离。
发展历程和应用领域
发展历程
RP-HPLC起源于20世纪60年代，随着高效液相色谱技术的发展而逐步完善。早期的 RP-HPLC使用硅胶作为固定相，后来逐渐发展为使用有机聚合物和混合模式固定相，
等领域。
电化学检测器
通过电化学方法对待测组分进 行氧化还原反应，从而进行检
反相高效液相色谱出峰顺序
反相高效液相色谱出峰顺序
反相高效液相色谱（Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）的出峰顺序一般按照溶剂极性的降序进行分离。
随着溶剂极性的提高，溶质的极性也会增加，因此，极性较低的溶质通常会先被洗脱出峰。
所以，一般来说，极性较低的化合物或特定的溶质会先出现在RP-HPLC的峰图中，而极性较高的化合物或溶质则会后出现。
这个顺序是根据溶剂的极性来确定的，常用反相高效液相色谱中，常用的溶剂是水和有机溶剂的混合物，如甲醇、乙腈等。
一般来说，水的极性较高，而有机溶剂的极性较低。
因此，当采用水和有机溶剂混合物作为洗脱溶剂时，峰的顺序通常是从极性低到高依次出现。
需要注意的是，具体的峰顺序可能还会受到其他因素的影响，例如样品的具体性质、色谱柱的性质等。
在实际分析中，要根据具体条件进行分析和定量。
反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题
成也萧何，败也萧何？！——反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题内容概览：本文拟通过一个具体实例来介绍制备型高效液相色谱法的特点、影响制备型高效液相色谱分离纯化的因素，及其在合成药物、中药化学对照品研究中的实际应用，并对制备HPLC分离纯化过程中的共性问题做了总结并提出解决方案。
实际应用：某合成药物最终产品的纯化，对其纯度的要求——HPLC-UV法，210 nm & 254 nm 下，以峰面积归一化法，≥98.0%，同时需提供MS、NMR数据。
具体问题：某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。
解决方法：终极目的是提纯该物质。
总体策略——“先看，后想，再行动”——“看化学结构，想理化性质，定纯化方法”。
由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。
结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。
方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况→2.样品预处理→3.建立Analytical HPLC Method→4.优化Preparative HPLC条件→5.检查出现的问题→6.回收纯化的物质。
更细致地来讲，开始Preparative HPLC之前须明白：待分离样品及有关组分的信息——所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC之前是否须经flash column粗分）；样品预处理——最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等；建立Analytical HPLC Method——这一步，跟平常的HPLC相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），若流动相中必须添加改性剂，应尽量避免非挥发性的缓冲盐，优先选择易挥发性缓冲液（例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、三乙胺、氨水等），否则要脱盐，得二次分离；优化Preparative HPLC条件——通常来讲，制备柱是实验室现有的（色谱柱就这么定下来了，没得选择的余地，除非是需新购色谱柱），在Analytical HPLC的基础上优化梯度分离方法、考察进样量、目标组分收集确认（LC-MS测分子量）；检查出现的问题——这一步是最需要费心留神的！很多时候，出了问题，根本就没有挽回的余地，当然了，有时也是亡羊补牢，犹为未晚；所以，更多的时候，是需要未雨绸缪，把可能会发生的事情尽量考虑周全！比如样品的溶解度（在甲醇、水、乙腈、流动相、四氢呋喃那、酸水、碱水中的溶解性如何？），若样品溶解性不好，第一步就卡住，很打击人滴！曾遇到过这么个实例——一个某种酶抑制剂，含氮杂环类化合物，在上面提到的那些溶剂中溶解度都相当地小，analytical HPLC虽然分离得很漂亮，但还是没法做。
温度对高效液相色谱分离性能的影响
温度对高效液相色谱分离性能的影响对于高效液相色谱而言，温度是一个一直被忽视而又非常重要的因素。
升高色谱分析的柱温，不仅可以加快分析速度，而且还可以提高分离效率、改善峰形、调节选择性、降低有机溶剂的使用，是一个非常有效而又十分经济适用的方法，与其它调节分离效果的方法相比，具有其独特的优势。
本文综述了温度对高效液相色谱分离特征的影响，介绍了温度作为一便捷的调节参数在高效液相色谱中的应用前景。
Influence of Temperature on Separation Behaves of HPLCCheng Hongda, Li Tong, Zhang Weibing1.Qiqihr University, qiqihaer,1160112.dalian institute of physical chemistry,dalian ,1610063.Dalian Elite Analytical Instruments Co. Ltd., Dalian 116011Abstract: Temperature is an important factor of HPLC performance. Because of the elevated temperature, viscosity of the mobile phase decrease, backpressure over the column reduced, the speed of mobile phase can be improved, and shorten the analytical time and adjust the selectivity. At the same time, under the higher temperature, the use of organic solvent can be decreased. Elevated the analytical temperature is an efficient and economic method for high performance chromatography. The influence of temperature on on Separation Behaves of HPLC is reviewed in this paper.Key words: high temperature; high performance liquid chromatography; review1．引言对样品进行高效、高灵敏度的分离分析，是每个色谱工作者所追求的目标。
高效液相色谱考题（一）
高效液相色谱考题（一）第一章高效液相色谱法练习一．判断对错1）液液色谱流动相与被分离物质相互作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的改变。
（）2）正相分配色谱的流动相极性大于固定相的极性。
（）3）反相分配色谱适合于非极性化合物的分离。
（）4）液相色谱固定相通常粒度为5-10微米。
（）5）示差折光检测器是属于通用型检测器，适于梯度洗脱。
（）6）在液相色谱中为避免固定相的流失，流动相与固定相的极性差别越大越好。
（）7）液相色谱的流动相又称为淋洗液，改变淋洗液的组成、极性可显著改变组分分离效果。
8）在液相色谱中，流动相的流速变化对柱效影响不大。
（）9）色谱归一化法只能适用于检测器对所有组分均有响应的情况。
（）10）检测器性能好坏将对组分分离产生直接影响。
（）二．填空题1）高效液相色谱中的技术类似于气相色谱中的程序升温，不过前者连续改变的是流动相的，而不是温度。
2）在液液分配色谱中，对于亲水固定液采用流动相，即流动相的极性固定相的极性称为正相分配色谱。
3）以ODS键合固定相，甲醇-- 为流动相时，该色谱条件为色谱。
4）在液相色谱中，为改善分离度并调整出峰时间，可通过改变流动相和______的方法达到。
5）在正相色谱中，极性组分先出峰，极性组分后出峰。
三、选择题1）液相色谱适宜的分析对象是（）A 低沸点小分子有机化合物B 高沸点大分子有机化合物C 所以有机化合物D 所有化合物2）液相色谱中，为了改善分离的选择性，下列措施（）是有效的。
A 改变流动相的种类B 改变固定相的类型C 增加流速D 改变填料的粒度3）在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（）A 异构体B 沸点相近，官能团相同的化合物C 沸点相差大的试样D 极性变化范围宽的试样4）用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇—水为流动相时，样品的容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好的方法是（）A 增加流动相中甲醇的比例B 增加流动相中水的比例C 流动相中加入少量HAcD 流动相中加入少量的氨水5）如果样品比较复杂，相邻两峰间距离太近或操作条件不易控制稳定，要准确测定保留值是有一定的困难时，可选择一下方法（）定性。
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实验二 影响反相高效液相色谱分离的因素
一、实验目的
1. 了解高效液相色谱仪器结构；
2. 熟悉溶质结构、溶剂组成和固定相对溶质保留值的影响；
3. 了解影响反相高效液相色谱分离的因素。
二、实验原理
1. 反相色谱保留机制：疏溶剂理论
溶质的疏水性、流动相的极性（表面张力）和固定相的烷基链长影响溶质的保留。
2. 影响溶质分离的因素
n ：柱长、柱效
α：流动相组成与性质、固定相性质、柱温等 k ：流动相组成与性质、固定相性质、柱温等
三、实验条件
色谱柱：C18（150 mm×4.6mm ；250 mm×4.6mm ）
流动相：甲醇-水（100，95/5，90/10）；流速：1.0（0.8，0.6，）mL·min -1 检测：UV 254 nm 样品：苯、萘、蒽
四、操作步骤
1. 流动相组成对分离的影响
在C18（150 mm×4.6mm ）和1.0 mL·min -1流速下，依次更换流动相，在每个体系中，均注入
2. 流动相流速对分离的影响
在C18（150 mm×4.6mm ）和甲醇-水（90/10）下，依次更换流动相流速，在每个体系中，均
⎪⎭⎫
⎝⎛+⎪⎪⎭
⎫
⎝⎛-=
k k ααR ,,11n 4
11212
注入5 μL苯-甲苯-萘混合样品，记录色谱图，计算对应的n、k和R。
3. 柱长对分离的影响
更换色谱柱，在甲醇-水（90/10，v=1.0 mL·min-1）体系中，注入5 μL苯-甲苯-萘混合样品，
、α和R。
记录色谱图，计算对应的k
五、数据处理
1.根据操作步骤1，绘制lgk～CH3OH％曲线。
2.根据操作步骤1、2和3，说明流动相组成、流速和柱长对k和R的影响。
六、思考题
1.根据本实验的主要结论，指出下列各组物质在反相色谱中的洗脱顺序。
（1）苯、苯酚和萘；（2）苯酚、邻甲酚和2,4-二甲酚；（3）正丁醇、仲丁醇和叔丁醇
2. 在反相柱上欲分离三个相邻的组分，初试未达到完全分离。
如何实现完全分离？。