反相高效液相色谱法测定茶叶中咖啡因的含量
实验4 高效液相色谱法测定茶叶中咖啡因含量
高效液相色谱法测定茶叶中咖啡因含量一目的要求：1 学习高效液相色谱定性和定量分析的方法；2 熟悉高效液相色谱仪的结构；3 熟悉高效液相色谱分析操作和条件的设置。
二实验原理：茶叶中咖啡因的含量是衡量茶叶质量的重要指标之一，也具有多种药理活性，咖啡因又名咖啡碱，属甲基黄嘌呤化合物，具有提神醒脑等刺激中枢神经的作用。
对于茶叶中咖啡因含量测定的常用方法有紫外分光光谱法，高效液相色谱法。
茶叶中的成分较多，色谱法具有分离和检测双重功能，用色谱法更好。
目前茶叶中咖啡因含量的测定采用反相高效液相色谱法较普遍。
本实验采用紫外检测器，水提取茶叶中的咖啡碱，用0.45的滤膜过滤，用0.2%H3PO4：CH3OH(80:20)流动相，检测波长276nm，用咖啡因对照品的保留时间进行定性，用外标法定量。
三试剂和仪器：LC-2010AHT高效液相色谱仪(日本岛津)，自动进样系统和紫外检测器；KQ3200E型超声波清洗器；0.45μm的水系滤膜和有机滤膜；TDL-40B离心机。
100mL的容量瓶。
对照品工作溶液为：咖啡碱标样，乙醇；磷酸；纯净水；甲醇；茶叶样品四茶叶样品的处理准确称取茶叶样品1 g（0.0001 g）于100 mL容量瓶，加入约70mL纯净水，在超声波中超声20min，平行3份，定容至100mL。
0.45μm的水系滤膜抽滤，取续滤液与比色管（或者用5000转/min以上的离心机离心15min，取上清液），待用。
五色谱条件（实验时自己记录）色谱柱：流动相体系：0.2%磷酸–甲醇（体积比为80 : 20）(注意：在做样品时用梯度洗涤，咖啡因出峰后用100% CH3OH冲洗7-8min的柱子，再用0.2%磷酸–甲醇（体积比为80 : 20）平衡7-8min柱子才能进下一样品)流速：1.000 mL/min柱温：30.0 ºC进样量：5 µL 检测波长：276 nm六咖啡因标准曲线绘制和样品测定用相同浓度的咖啡碱标准溶液，按照下表1中的不同体积进样。
反相高效液相色谱法测定可乐,茶叶中的咖啡因
可乐 、 叶样 品 中的咖啡 因含量 茶 １ 实验 部分 １１ 仪器 与试剂 ．
Hale Waihona Puke 。同时， 它也是某些抗癌药物和中枢神经药物的
２０ ／８Ａ Ｔ Ｒ Ｏ Ｉ液相色谱仪 （ ０Ｂ７５ ／ Ｕ Ｂ Ｅ 珀金． 埃尔 默公 司 ， Ｓ ）７５ Ｕ Ａ ；８Ａ紫 外． 见分 光 光 度 计 （ 金 ． 可 珀 埃尔默公 司， Ｓ ）５７双波长双光束分光光度计 ＵＡ ； ５ （ 本 日立）Ａ ６ 超声清洗器（ 日 ； Ｓ ００ ２ 奥特赛恩斯仪器 有限公司， 天津）微孔溶剂过滤器 （ ； 津腾过滤器件 厂， 天津 ） 咖啡因标准 品（ 口分装 ） 甲醇， 进 ； 冰醋酸等试 剂均为 分析纯 以上 ， 为去 离子水 水
帅 琴 ， 龚 宇． 杨 薇， 王 丽
（ 中国地质大学材料科学与化学工程学院， 武汉 ４０ ７） ３０４
摘 要 ： 究 了反 相 高效液相 色谱 ＇ （ Ｐ Ｈ Ｌ ） 研 ￣ Ｒ － Ｐ Ｃ 直接 测 定茶 叶水 提鼠 物 、 乐饮 可
料 中的咖啡 因的新 方法 ， 用 Ｐ —１ ， ｃ １Ｈ． ０Ｉ （０６ ． ：．８ 溶 采 ＥＣ ８柱 以 ＨＯ ．Ａｅ３ ：９９ ００ ） － ２ 液作流动 相 ， 紫外捡 测波 长为 ２０ｎ ６ ｍ。可在 ８ｍｎ内将咖啡 因与基体 分 离， 啡 ｉ 咖
１２ 色谱条件 ．
基础结构单元 。因此 ， 研究简便 、 快速分离和测定 咖啡因的分析方法在生化、 医学 、 药物和食品研 究 中都具有很重要的意义 可乐 、 茶叶等饮料 中都含 有一定量的咖啡因 ， 对其中咖啡因进行有效分离与 准确测定将有助于对饮料的生产工艺、 产品质量进 行准确监控 ， 有利于产 品真伪 的辨别 ， 同时也有利
茶叶中咖啡因的HPLC分析
茶叶中咖啡因的高效液相色谱分析一、实验目的：⑴ 了解反相色谱的原理和应用⑵ 掌握标准曲线定量法二、实验原理：咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。
其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式：N NN N CH 3CH 3CH 3OO样品在碱性条件下，用氯仿定量提取，采用反相液相色谱柱进行分离，以紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作工作曲线，再根据样品中的咖啡因面积，由工作曲线算出浓度。
三、 实验仪器与药品⑴仪器Waters2695型高效液相色谱仪操作软件色谱柱（EconosphereC18）自动进样器⑵药品①甲醇（色谱纯）双蒸水氯仿（A.R）1mol/LNaOH;NaCl(A.R.) Na2SO4(A.R.)咖啡因（A.R.）茶叶②1000mg/L咖啡因储备液将咖啡因在110℃下烘干1小时，准确称取0.1000g咖啡因，用氯仿溶解，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。
四、实验步骤：⑴色谱条件：柱温：室温流动相：甲醇／水＝60：40流量：1.0mL/min检测波长：275nm⑵咖啡因标准系列溶液配制：分别用吸量管吸取0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40mL咖啡因储备液于六只容量瓶中，用氯仿定容至刻度，浓度分别为40、60、80、100、120、140mg/L⑶样品处理：①准确称取茶叶0.3g,加蒸馏水30mL煮沸10min，冷却后将清液转移至100mL容量瓶，并按此操作重复两次，定容至刻度。
将3份样品溶液分别进行干过滤，弃去前过滤液，取后面的过滤液。
②分别取上述三份样品溶液25.0mL于125mL分液漏斗中，加饱和氯化钠溶液，溶液，然后用氯仿分三次萃取。
将氯仿提取液分离后经装有无水硫酸钠小漏斗，过滤至容量瓶中，最后用少量氯仿多次洗涤小漏斗，定容至刻度。
反相高效液相色谱法测定茶叶中咖啡因的含量
啡因标准溶液 的吸光度值 ，咖啡因浓度在 ｌ～１０ ０ ５ ｕ 范 围 内与 峰 面 积 值 呈 良好 线 性 关 系 ，Ｙ＝ 扎 １ ６ ０ Ｘ＋ ．５ ０ 相 关 系数 为 ０ ９ ８ ． ×１ ９ ８ ｘ１ ３ ． ９ ，方法 检 出 ９
，
【３ Ｔｕ ｅｂ Ｔ ｅ ｋ ， ｈｕｅｒ ０ １Ｊ １】 ｅ ｔｎｅｒ ｇ ｕ Ｈｏｌ ａｓ ｒＪ ｚ Ｍ， ａ． ｔ
精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状 ，甚至导 致吸食者下一代智能低下， 肢体畸形， 因此也被列入 受国家管制的精神药品范围。 茶叶是 常见 的饮 品 ，不 同品种的 茶叶含 有 的咖
二酮 ，纯的咖啡因是白色 的，具有强烈苦味的粉状 物 ，熔 点 ２ ８，升 华温 度 １８，易 溶于 水 、乙醇 、 ３。 ７。
Ｃ ｍ ａ ｏ ｒ ２ ０ ， ｌ （ ／） １ ７ ｈｒ ｏ ｔｇ Ａ， ０ ６ ｌｌ９ １２ ： ９
限为为Ｉ ｇｍＬ ｕ／ ．
【４ Ｈ ｃ ， ｏ ｃ Ｌ Ｊ ｈｔｍ ｇ ， ０ ９ １ 】 ｅｉ ｉ ｈＳ Ｒ ａＪ ． ａ ｏ ｒ ２ ０ ， ｎｓ ｃ Ｃ ｏ ｔ Ａ １ １ ４： ６（ ） ２
Ｃ ｅ ， ０ ０７ ６ ： ５ ｈｍ ２０ ， ２（） ｌ ３ ２
【 ｌＮ ｃ Ｊ Ｄ ｕ ｐＣ Ｍｃ ｏ ｍ ｉ ， ａ１ ｌ】 ａ ｒ ｋｉ ， ｎｌ ， Ｃ ｋＡ ｅ ｗ ｏ ａ ｒ ｃ ｔ ．
Ｊ ｈｒｍ ｔｇ Ａ， ０ ４ ｌ ２ １ ： ａ ｏ ｒ ２ ０ ， ８（） １ Ｃ ｏ ０
２３ 实际样 品 测定 ． 我们 以不 同品种 的茶 叶 为 实验 对象 ，测定 其 中
【５ Ｚ ｕ Ｇ ｏＹ Ｙ Ｌ ｅ Ｊ ｈｒｍ ａｔｇ １】 ｈ ｕ ｃＭ ， ａＩ ｒ ｔ ．Ｃ ｏ ｏ
06 反相高效液相色谱法测定茶叶提取物咖啡因的纯度.doc
实验反相高效液相色谱法测定茶叶提取物咖啡因的纯度一、目的要求1.理解反相高效液相色谱的分离原理。
2.掌握HPLC定性定量方法。
3.了解流动相组成对样品组分保留时间的影响。
二、方法原理反相键合相色谱法是一种最常见的高效液相色谱法，70％以上的HPLC分离分析工作是用它完成的。
这种方法特别适用于同系物、苯并系物等的分离。
十八烷基键合相（ODS或C18）是一种最常用的非极性化学键合固定相，而甲醇－水或乙腈－水体系是最常见的极性流动相。
反相键合相色谱法的保留机理目前多用疏溶剂理论解释。
疏溶剂理论假定羟基键合相表面是一层均匀的非极性羟类配位基，并认为极性溶剂分子与非极性溶质分子或与溶质分子中的非极性部分互有排斥力，溶质与键合相的结合是为了减少受溶剂排斥的面积，而不是由于非极性溶质分子或与溶质分子的非极性部分与键合相烷基之间的作用力，也就是说反相键合相的保留机理主要是疏水效应起主导作用。
在反相键合相色谱法中，溶质的疏水结构差异是分离的基础。
对非离子型化合物，溶质极性愈大，保留值愈小；对非极性化合物，溶质的表面积愈大，保留值愈大；对同系化合物，链长愈长或苯环愈多，保留值愈大。
在反相键合相色谱法中，溶剂的组成对样品组分的保留值有很大的影响。
溶质的保留值随流动相表面张力的减小而减小。
常用的溶剂中以水的表面张力最大。
若流动相中有机溶剂含量增加，流动相的表面张力将下降，则溶质的保留值减小。
利用保留值tR定性：在相同条件下，通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置，初步定性。
定量则采用峰面积进行计算。
三、仪器与试剂仪器：岛津液相色谱仪；六通进样阀；反相C18柱；20μLHPLC微量注射器；微孔滤膜杯式滤器；超声波清洗器及玻璃器皿一套。
试剂：咖啡因标准，采用色谱纯甲醇配制浓度为10mg/mL的咖啡因储备液（准确称取0.5g定容于50mL）；取1.00mL 10mg/mL的咖啡因标准再用甲醇稀释至100mL的浓度为100μg/mL咖啡因标准中间液。
高效液相色谱法测定四种常见茶叶以及减肥茶中咖啡因的含量
科技文苑高效液相色谱法测定四种常见茶叶以及减肥茶中咖啡因的含量□李泽夏琼马莹庞秀清邱红燕贵州省食品药品检验所摘要：本文主要研究4种常见茶叶以及减肥茶中咖啡因的含量测定方法，比较茶叶与减肥茶中咖啡因的含量，为减 肥茶中咖啡因是否非法添加以及限值规定提供依据。
方法：采用高效液相色谱法，二极管阵列检测器，以曱醇-水为流动相，检测波长为271n m,流速为l m L/m in,柱温为30°C。
结果：咖啡因在0.205 8~4.116/x g范围内与峰面积呈良好线 性关系（r=0.999 9),平均回收率为100.5%, i!SD=〇.78% (n=9)。
结论：本方法方便快速、简捷、准确、重现性好，可对茶叶中咖啡因的含量进行准确测定，对减肥茶中咖啡因含量进行有效监控。
关键词：H PLC;茶叶；减肥茶；咖啡因；非法添加；含量；测定茶作为一种天然饮料，具有良好 的降脂减肥效果，近年来所受到的关 注也越来越多。
研究证实，常见的未 发酵茶（绿茶等）、全发酵茶（红茶等）、半发酵茶（乌龙茶等）和后发酵陈茶 (普洱茶等）都具有一定的降脂减肥 功效[1]。
大量研究表明，茶叶中具有 减肥作用的主要活性成分是茶多酚和 咖啡因。
他们在人体内产生协同作用，对机体的能量代谢、脂类代谢、食物 营养吸收等方面产生作用，进而达到 减肥降脂的效果[2]。
咖啡因是甲基黄嘌呤类物质，在 人体内它可以刺激中枢神经系统，促进 新陈代谢，促进血液循环等p]。
然而，长期大量地摄取咖啡因能够导致“咖啡 因中毒”。
可导致中枢神经系统兴奋，表现为躁动不安、呼吸加快、肌肉震颇、心动a速，以及失眠、耳鸣等症状' 妊娠妇女尤其要控制咖啡因的摄入量，多项研究表明咖啡因可能对胎儿发育产 生多种不良反应，如先天畸形、早产、宫内发育迟缓等气加拿大卫生部发布 的咖啡因安全摄入量建议表明，健康成 人每天咖啡因的安全摄入量为400 mg，儿童和青少年的安全摄入量更少[6]。
茶叶提取物中咖啡因含量的测定
茶叶提取物中咖啡因含量的测定一、试验原理当前茶饮料因其具有一定的保健功能而十分流行，其中主要的有效成分是茶叶提取物，茶叶（Tea）提取物中含有咖啡因（Caffeine)。
是一种生物碱化合物，有提神醒脑的作用，是一种中枢神经高兴剂。
同样含有咖啡因成分的咖啡、可乐等软饮料及能量饮料在市场上亦非常畅销，但长久、大量饮用有成瘾的趋势。
此外，咖啡因也是世界上最普遍用法的精神药品之一，我国将咖啡因列为“精神药品”加以管制。
咖啡因的测定办法以高效液相色谱法为主，通过色谱柱将咖啡因与样品基体组分分别，用紫外检测器测定其含量。
在高效液相色谱法中应用最为广泛的是反相色谱，即流淌相的极性大于固定相。
本试验以非极性的C18键合相色谱柱、极性的／水流淌相分别样品中咖啡因，用法紫外检测器，以色谱峰面积为定量分析指标，计算饮料中咖啡因的含量。
二、主要仪器和药品高效液相色谱仪（C18反相键合相色谱柱4.6 mm x15 cm，微量注射器）、紫外检测器（波长254 nm)。
流淌相：：水＝60:40，流速0.5 ml·min-1. （分析纯）、储备液（配制成咖啡因1000 mg·ml-1的甲醇溶液）、（色谱纯）、试验用水用法纯水机制取。
三、试验步骤 1．标准溶液配制将咖啡因储备液用甲醇稀释成浓度分离为20、40、80、120、160 mg·L-1的标准系列，备用。
2．样品处理依据样品状态不同，实行相应的处理办法。
常用的样品处理办法如下：①取100 ml液态饮料（特殊是可乐等碳酸饮料）于250 ml 干燥烧杯中，经超声脱气5 min,驱除其中C02等气体，依其含量适当稀释。
②精确称取固态咖啡0.25 g（精确至0.0001g)，水溶解，定容100.0 ml，摇匀备用。
③精确称取茶叶0.3 g（精确至0.0001g) ,30 ml水煮沸10 min，冷却后将上清液转移至100 ml容量瓶中，重复上述过程两次，定容并摇匀备用。
高效液相色谱法测定茶饮料中的咖啡因含量
分析检测高效液相色谱法测定茶饮料中的咖啡因含量宁 炜（山西省检验检测中心(山西省标准计量技术研究院)，山西太原 030012）摘 要：建立了高效液相色谱法测定茶饮料中咖啡因含量的分析方法。
试样经预处理后，过0.45 μm微孔水相滤膜，经Promosil C18色谱柱分离，以甲醇和纯水为流动相，等度洗脱，二极管阵列检测器检测。
结果表明，咖啡因在0.059～1.960 μg/mL与4.91～196.30 μg/mL时线性关系良好，线性系数均大于0.999，加标回收率为96.43%～103.31%，方法的重复性RSD为1.56%，检出限为0.059 mg/kg，定量限为0.2 mg/kg。
该方法前处理简便，定性定量准确，可用于茶饮料中咖啡因含量的批量快速检测。
关键词：咖啡因；茶饮料；高效液相色谱法Determination of Caffeine in Tea Drinks by HPLCNING Wei(Shanxi Inspection and Testing Center Shanxi Institute of Standard Measurement Technology, Taiyuan030012, China)Abstract: The method for the determination of caffeine in tea beverage by high performance liquid chromatography was established. After pretreatment, the sample passes 0.45 μm microporous aqueous phase filter membrane, separated by Promosil C18 chromatographic column, eluted with pure water and methanol as mobile phase, and detected by diode array detector. The results showed that caffeine ranged from 0.059～1.960 μg/mL and 4.91～196.30 μg/mL, the linear relationship within was good, the linear coefficients were greater than 0.999, the recovery was 96.43%～103.31%, the repeatability RSD of the method was 1.56%, the detection limit was 0.059 mg/kg, and the quantitative limit was 0.2 mg/kg. The method is simple in pretreatment, accurate in qualitative and quantitative analysis, and can be used for rapid batch determination of caffeine in tea drinks.Keywords: caffeine; tea drinks; high-performance liquid chromatography咖啡因，又称咖啡碱，是一种从咖啡或茶叶中提取的黄嘌呤生物碱化合物，具有使人体中枢神经系统兴奋的作用，适度使用可以祛除疲劳、振奋精神，然而长期或超剂量摄入会对人体肝肾功能造成损害，而且其具有成瘾性，停用后会出现身体疲乏、精神不振等症状[1-4]。
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实验一反相高效液相色谱法测定茶叶中咖啡因的含量
一．实验目的
1. 熟悉液相色谱仪的基本构造和操作方法
2. 学会利用外标法对物质进行色谱定量分析
二．仪器与试药
仪器：
高效液相色谱仪（日本岛津10AVP型）、溶剂过滤器、样品溶液过滤器、微量进样器
试药：甲醇、乙腈、超纯水、咖啡因对照品
三、色谱条件
色谱柱：C18（250×4.6，5um）
流动相：甲醇-乙腈-水=45：10：45 （v/v）
检测器及检测波长：紫外检测器280nm
流速：0.6ml/min
四、实验操作
1．对照品溶液的配制：准确称取咖啡因对照品适量，用乙腈：水（1:1）混合溶剂配制成1.0mg/mL 咖啡因储备液；分别移取10μL、20μL、30μL、40μL咖啡因储备液，用超纯水定容至5mL，配制成浓度为2.0μg/mL、4.0μg / mL、6.0μg /mL、8.0 μg/mL的一系列对照品溶液，备用。
2. 样品溶液的配制：准确称取0.035g茶叶, 加乙腈：水（1:1）混合溶剂8mL，超声提取10min，用超纯水定容至10mL，过滤并稀释20倍，备用。
3. 调用或创建咖啡因测定方法并运行方法
4. 测定：待基线平稳后，分别吸取25μL对照品溶液和样品溶液进样。
五、数据处理及计算
以对照品溶液峰面积与对应含量绘制工作曲线，根据样品溶液峰面积在曲线上查出其进样时含量，并计算得到茶叶中咖啡因的百分含量。
六、思考题
1．液相色谱与气相色谱相比较有哪些不同？
2. 如果用液相色谱法测定可乐中咖啡因，样品应该如何处理？
附：岛津10AVP型高效液相色谱仪操作
一、开机
1．打开计算机。
2．开启高效液相色谱仪各部件电源开关（脱气机→A泵→B泵→检测器→柱温箱→主控器）。
3．待高效液相色谱仪各部件自检完毕，在计算机上启动化学工作站ClassVP 并点击Instrument ，输入用户名和密码，点击确定。
二、实验参数的设置
在Method下，进行操作：
1．单击溶剂瓶图标，设置所用溶剂瓶中溶剂量后，点击OK；单击高压泵图标，设置泵流速0.6mL·min-1，梯度洗脱溶剂B（水）0%，最高柱压设为2.0×107 Pa。
2．单击色谱柱图标，设置柱温箱温度为25℃。
3．单击检测器图标，设置检测波长为280nm，，数据采集时间7min。
四、运行样品
1．打开Purge阀。
2．运行Instrument菜单下System On命令启动系统（或单击各图标的on图标启动系统）。
3．待废液管中无气泡流出，关闭Purge阀。
4．待基线稳定之后，单击single run, 进行样品信息编辑。
5. 用微量进样器进样后，扳动手动进样阀至Inject位置，仪器自动开始纪录。
6．待测物出峰完全后，按F8停止采集数据。
五、实验数据处理
1．定性、定量分析参数的设定
（1）一级校正表的建立
①在Data Analysis界面下，点击File菜单下的Load Signal，调用低浓度标样的实验结果。
②优化谱图：打开Graphics菜单，选择Signal Options选项，进入Signal Option编辑框，在Range选择中选择Use Range，输入适当的参数。
③优化积分：在Data Analysis 界面下，单击Integration菜单，选择Integration Event，选择适当的参数，编辑积分项目。
在积分事件表中，输入合适的积分参数，然后单击积分事件表左上角带对号的图标。
④建立一级校正表：单击Calibration菜单，选择New Calibration Table，选择默认参数，单击OK。
⑤在校正表中输入化合物名称及浓度。
在输入浓度之后，相应化合物的校正曲线会显现出来。
⑥单击OK键。
（2）二级校正表的建立
①调用第二个标样色谱图。
②按照一级校正表建立过程中所涉及的内容，优化谱图，优化积分参数。
③单击Calibration菜单，选择Add Level，编辑二级校正表，单击OK。
④在校正表中，输入第二个标样的浓度。
输入浓度后，相应化合物的校正曲线会显现出来。
⑤单击OK键，完成二级校正表的编辑。
（3）校正表参数及报告的设定
①校正表参数设定。
单击Calibration菜单，选择Calibration Setting，在Calibration Setting 编辑框中输入浓度单位、时间窗口、校正曲线类型。
②报告的设定。
单击Report菜单，选择Specify Report，进入Specify Report编辑框，输入打印目的地，选择定量方法ESTD。
2．未知样品的定性、定量分析
（1）调用未知样品数据文件。
（2）优化谱图显示，优化积分参数。
（3）点击报告图标，显示定性、定量分析结果。
（4）选择Report菜单下Print Report命令，打印定量结果。