微生物实验思考题(南京工业大学生物与制药工程学院)

实验一细菌的简单染色和细菌形态的观察一、实验原理简单染色采用一种染料对菌体进行染色，常用结晶紫、美蓝、碳酸复红等碱性染料。

染色后，菌体与背景形成鲜明对比，在显微镜下很容易被识别。

通过简单染色方法可以观察细菌的菌体形态特征和菌体的排列方式。

观察菌体形态简单染色（只用一种染料）观察菌体排列方式染色方法革兰氏染色鉴别鉴别染色抗酸性染色（利用两种染料）芽孢染色观察特殊结构荚膜染色鞭毛染色二、实验步骤：涂片干燥固定染色水洗干燥镜检三、思考题1、制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节？答；（1）涂片：开始所加无菌水液滴不要太大，否则不易干燥；取菌量要适宜且要涂抹均匀，避免过大造成堆积，而难以看清细胞个体形态同时也应避免取菌量太少而难以在显微镜视野中找到细胞。

（2）无菌操作取菌：一定要等接种换冷却后再取菌，以免高温使菌体变形；（3）干燥固定：干燥后加热固定，可避免加热时间过长，否则细胞会破裂或变形；（4）固定：菌膜一面朝上，通过酒精灯微火三次。

注意温度不宜过高，时间不宜太长，否则菌体形态则会发生改变。

（5）水洗：倾去染色液后，用水沿着菌膜四周冲洗，注意勿使水流直接冲洗菌膜部位，水流不宜过急，过大，至流出水无色为止；2、为什么要求制片完全干燥才能用油镜观察？答：使用油镜时，物镜与标本间的介质为香柏油（N=1.515），不仅增加了透明度，而且会若制片不完全干燥后，就用油镜观察，则N会减小，分辨率D也会变小。

而且还会造成油水两相不互溶，所以制片要求完全干燥后才能用油镜观察。

3、如果涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高，时间太长，又会怎样呢？答：加热固定的作用是使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态，而且还可增加细胞对染料亲和力。

（1）如果图涂片未经加热固定，则细胞无法固定在载玻片上，在染色水洗后会被水流冲走。

（2）如果加热温度过高，时间太长，则会使细菌形态发生变化甚至破裂。

4、为什么细菌染色常用碱性染料？什么情况下用酸性染料？答：（1）细菌染色常用碱性染料，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中通常带负电荷，而碱性染料电离后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色。

（2）当细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。

实验二细菌的革兰氏染色法一、实验原理革兰氏染色是细菌染色中重要的鉴别染色方法之一。

通过革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌(G-)。

G+和G-主要是由于细胞壁结构和化学成分的差异引起脱色能力的不同。

①结晶紫初染和碘液媒染:在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫与碘的化合物。

②乙醇脱色：细胞壁较厚结晶紫与碘液复合物留在细G+ 胞壁内，使其保持紫色。

肽聚网层次多和交联致密且不含类脂细胞壁较薄结晶紫与碘复合物溶出，细G- 胞壁退成无色肽聚网层薄和交联差，外膜层类脂含量高③番红染色：G-细菌呈现红色，而G+细菌则仍保留最初的紫色。

二、实验步骤立即水洗干燥结晶紫碘液G+G+：蓝色菌体紫初染媒染G-G-：红色1、涂片：“三区”涂片法，在一洁净的载玻片偏左和偏右各加一小滴。

用灭菌的接种环挑取少许枯草芽孢杆菌与右边的水滴充分混合，将左、右方的菌液延伸与玻片中央，使大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在玻片中间区域相互混合成含有两种菌的混合区。

2、干燥：涂片在空气中干燥3、固定：手持载玻片一端，有菌膜一面朝上，通过酒精灯微火三次。

注意用手指触摸载玻片反面为不烫为宜。

冷却。

4、染色：滴加结晶紫染色液于菌膜部位，覆盖菌膜，染色1~1.5min。

5、水洗：斜置玻片倾去染色液，用水自玻片上端缓慢冲洗。

注意勿使水流直接冲洗菌膜部位。

6、媒染：滴加碘液于菌膜部位，覆盖菌膜，放置1~2min。

7、水洗：同上8、脱色：斜置玻片，自标本的上端缓慢滴加95%乙醇脱色，直到留下的酒精无明显的紫色为止。

脱色是革兰氏染色中的关键一步，注意不要脱色过度。

9、水洗：同上10、复染：滴加番红染色液，染色1min.11、水洗并用吸水纸自载玻片边缘轻轻吸去多余水分。

12、镜检。

三、思考题1、什么是鉴别染色？有何优点？答：（1）鉴别染色是指至少使用两种不同颜色的染色剂进行染色。

（2）优点：可以区分不同类别的菌种；可以很好地观察菌体结构；2、革兰氏染色法中初染、媒染、脱色、复染的目的是什么？答：初染：利用结晶紫初染使所有细菌都着上蓝紫色。

媒染：利用碘液作为媒染剂，碘会与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强染料在菌体中的滞留能力脱色：用95%乙醇作为脱色剂，根据G+和G-细胞壁机构和化学组成的差异，G+的肽聚网孔会收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，而G-中原先滞留的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变无色。

复染：用番红作为复染剂把洗脱的G-染成红色，而G+仍为蓝紫色。

3、革兰氏染色反应的关键步骤是什么？为什么？答：革兰氏染色反应的关键步骤是脱色；①若脱色不够的话，则大肠杆菌中的碘-结晶紫复合物不能被洗脱下来，或无法完全被洗脱下来，那么之后用番红复染时不会变成红色，而是呈紫色，造成大肠杆菌的假阳性。

②若脱色过度的话，则金黄色葡萄球菌中的碘-结晶紫复合物也会被洗脱下来，那么之后用番红复染细胞呈红色，造成金黄色葡萄球菌的假阴性。

实验五酵母菌形态的观察一、实验原理（略）二、实验步骤1、酵母个体形态与出芽繁殖接种与培养制片观察2、假菌丝形态接种与培养制片3、酵母细胞的死活染色鉴别涂片、染色观察三、思考题1、显微镜下观察的酵母菌的个体形态特征与细菌个体形态特征有何不同?答：（1）细菌是一类细胞细短的原核生物，一般直径约为：0.5μm，长度约为：0.5~5μm。

显微镜下观察的细菌个体形态基本上是球状、杆状、螺旋状三大类，仅少数为其他形状，如丝状、三角形、方形和圆盘形等；（2）酵母菌的细胞直径约为细菌的10倍，是典型的真核生物，在显微镜下观察的酵母菌个体形态通常是有球状、卵圆状、椭圆状、柱状和香肠状等。

2、美蓝色染色液染色时间对酵母菌死活细胞数量有何影响？试对所得的结果进行分析和讨论。

答：美蓝染色液染色时间越长，酵母菌死细胞数量越多，而活细胞数量越少。

实验六霉菌形态的观察1、试分析Subouraud 琼脂培养基的优点？答：①pH偏酸性，适合霉菌生长；②氯霉素可抑制细菌的生长；2、载片培养法中“U”形玻璃棒和培养皿底部的滤纸上加入适量灭菌水的目的是什么？除了加灭菌水之外，还可以加入什么溶液？答：①目的是保证培养皿内适宜温湿度；②还可通过无菌操作在培养小室中园滤纸片上加3至5ml灭菌的20%的甘油。

3、载片培养还适宜哪些微生物进行形态观察？答：载片培养还适宜培养放线菌、假丝酵母等分枝丝状体进行形态观察。

4、为什么载片培养所用的材料均要灭菌？答：载片培养所用的材料如不灭菌，则极易引入杀菌，当接种到培养基上时，很有可能会影响霉菌的生长，而且也会影响到后期的显微观察。

实验七微生物测微技术一、实验原理显微测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺两个相互配合使用的部件。

镜台测微尺总长1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100 个小格，每一小格长度为0.01mm。

目镜测微尺分50小格和100小格两种。

二、实验方法和步骤目镜测微尺放置目镜测微尺的标定酵母菌大小的测定将镜台测微尺用擦镜纸擦拭干净，放进盒子里保存，同时正确清理和维护显微镜。

注：放置镜台测微尺时有刻度的一面朝上；目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行；使两尺左边某一区域内两线完全重合后找出右边另外相重合的线，分别数出两重和线。

目镜测微尺每格长度（um）=重合线间镜台测微尺格数*10/重合线间目镜测微尺格数三、思考题1、为什么使用不同放大倍数的目镜或者物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？答：因为目镜测微尺在不同放大倍数的目镜和物镜下的大小是不一样的，也就是比例不同，所以要重新校正。

2、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一菌体大小时，其测定结果是否相同？为什么？答：相同。

因为同一菌体的大小是一定的，不同放大倍数的物镜不会改变菌体的实际大小，但物镜的放大倍数越高，目镜测微尺的精确度越高，测量月准确。

3、测量菌体大小时对菌龄有无要求？为什么？答：有要求。

因为菌在不同生长时期细胞大小有时会有较大变化，若需自己制样进行细菌大小测定时，应注意选择处于对数生长期的菌体细胞材料。

实验八微生物技术技术-血球计数板法一、实验原理测定细胞数目的方法有直接计数法（如血球计数板计数计数）和间接计数法（如平板菌落计数法）显微镜计数的优点是直观、快速、操作简单，缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对活动性强的活菌进行计数。

其中血细胞计数板较厚，不能使用油镜，常用于个体相对较大的酵母细胞，霉菌孢子等计数。

二、实验方法和步骤1、镜检计数板的计数室（在加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物则需清洗）2、加样品(菌悬液需摇匀）3、计数(加样后静置5min）4、清洗血球计数板注：1、活细胞是透明的，因此在进行显微镜计数时应适当减低视野亮度以增大反差；2、进行显微计数是应先在低倍镜下寻找大方格的位置，找到计数室后将其移至视野中央，再换高倍镜观察计数。

3、酵母菌以每格5到10个菌体为宜。

三、思考题1、用血球计数板计数时，哪些步骤容易造成误差？应如何尽量减少误差力求准确？答：容易造成误差的步骤（1）计数室的清洗（2）加样时是否将菌液摇匀（3）计数尽量减少误差的措施：(1)加样前应先镜检计数室，若有污物则需清洗后镜检，直至计数室没有污物；(2)加样前先摇匀菌液，因为放置一段时间的菌液其浓度是不均匀的；(3)计数时先根据计数板的规格确定计数方法：记上不计下，记左不计右。

2、血球计数板计数有哪些缺点？答：优点是直观、快速、操作简单，可直接观察到微生物的总数，缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对活动性强的活菌进行计数。

3、利用血球计数板计数时，注入的菌液为什么不能过多？答：（1）注入菌液过多，会将盖玻片顶起而改变计数室的容积。

（2）注入菌液过多，也会使计数室中格线变得模糊，无法清楚的计数。

实验九培养基的制备与高压蒸汽灭菌一、实验原理培养基是人工配置的适合我微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。

含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等六大营养物质。

一般培养细菌的常用营养琼脂培养基，放线菌常用高氏一号培养基，酵母菌常用麦芽汁培养基，霉菌常用马铃薯培养基（PDA）。

高压蒸汽灭菌：121℃，15-30min。

二、思考题1、为什么分装于三角瓶中的培养基装量不能过多？答：①分装量太多，三角瓶内培养极易沾染瓶口及棉塞而造成污染；②分装量太多不利于震荡摇匀；③分装量太多会使培养基灭菌不彻底。