酶活力的测定课件

酶活力的测定
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二、酶活力的测定
1.分光光度法
酶
活
2.荧光法
力
的
3.同位素测定法
测
定
4.电化学方法
方
法
5.其他方法
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二、酶活力的测定
1.分光光度法
分光光度法主要利用底物和产物在紫外光或可见光 部分的光吸收度的不同，选择一适当的波长，测定反 应过程中反应进行的情况。其优点是简便、节省时间 和样品，可检测到nmol/L水平的变化。该方法可以连 续地读出反应过程中光吸收的变化，已成为酶活力测 定中一种重要的方法之一。几乎所有的氧化还原酶都 可以用此法测定。
酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或 产物的增加量来表示。在实际酶活性测定中一般以测 定产物的增加量为准。
酶活力的测定就是测定酶促反应的初速率。
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一、酶活力
2.酶活力单位
酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示, 即酶单位(activity unit，U)。 酶单位的定义：在一定条件下，一定时间内将一定 量的底物转化为产物所需的酶量。这样酶的含量就可 以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表 示，即 “U/g” 或 “U/mL” 。 世界各地实际应用的酶活力单位的定义各不相同。 同一种酶往往有几种不同的单位。
第四章 酶活力的测定
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第四章 酶活力的测定
第一节 酶的结构与性质(略) 第二节 酶活力测定方法
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第二节 酶活力测定方 法
一、酶活力 二、酶活力的测定
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一、酶活力
1.概念
酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的 大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反 应速率来表示，两者呈线性关系。酶反应速率越大， 酶活力越高，反之越低。
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二、酶活力的测定
要求酶活力的测定方法：快速、简便、准确。
1.酶活力的测定步骤 酶活力测定均包括两个阶段：首先要在一定 的条件下，酶与其作用底物反应一段时间，然 后再测定反应液中底物或产物变化的量。
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二、酶活力的测定
选择底物 配制底物溶液
① 底物
确定酶促反应条件： pH、温度等
②反应条件：据资料或试验结果，确定酶促反应的温度、
pH等条件。温度可选在室温(25℃)、体温(37℃)、酶促
反应最适温度或其他选用的温度，一般在恒温装置内进
行。pH应是酶促反应的最适pH，采用一定浓度和一定
pH的缓冲溶液来保持。反应条件一经确定，在反应过程
中应尽量保持恒定不变。有些酶促反应要求激活剂等其
例如，1IU＝lμmol/min；1Kat = 1mol/s
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一、酶活力
酶活力的测定要在最适条件下进行，即最适温度、 最适pH、最适底物浓度和最适缓冲液离子强度等， 只有在最适条件下测定才能真实反映酶活力大小。
测定酶活力大小时，通常要求底物浓度足够大， 测定底物浓度的变化在起始浓度的5％以内的速率， 这样可以保证所测定的速率是最初速率。此结果能 比较可靠地反映酶的含量。
酶活力 的测定步骤
② 反应条件 ③ 反应时间
准确计时并终止反应
④ 底物或产物 变化量
运用各种检测技术， 快速、简便、准确的 测定变化量
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二、酶活力的测定
①底物：根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成 一定浓度的底物溶液。要求所使用的底物均匀一致，达 到一定的纯度。有些底物溶液要求新鲜配制，有些则可 预先配制后置冰箱保存备用。
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二、酶活力的测定
由于分光光度法有其独特的优点，因此可以把一些 原来没有光吸收变化的酶反应通过与一些能引起光吸 收变化的酶反应偶联，使第一个酶反应的产物转变成 为第二个酶的具有光吸收变化的产物来进行测量。这 种方法称为酶偶联测定法。
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二、酶活力的测定
2.荧光法
荧光法主要是根据底物或产物荧光性质的差别来进行测 定。由于荧光方法的灵敏度往往比分光光度法要高若干个 数量级，而且荧光强度和激光的光源有关，因此在酶学研 究中越来越多地被采用，特别是一些快速反应的测定方法。 该法缺点：易受其他物质干扰，有些物质如蛋白质能吸 收和发射荧光，这种干扰在紫外区尤为显著，故用荧光法 测定酶活力时，应尽可能选择可见光范围的荧光进行测定。
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3.同位素测定法
用带有放射性同位素标记的底物经酶作用后得到产 物，通过适当的分离，测定产物的脉冲数即可换算出 酶的活力单位。 已知六大类酶几乎都可以用此方法测定。 通常用于底物标记的同位素有3H、14C、32P、35S和 131I等。
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二、酶活力的测定
优点：反应灵敏度极高，可直接用于酶活力的测定， 也可用于体内酶活性测定。特别是适用于低浓度的酶 和底物的测定。 缺点：操作繁琐，样品需分离，反应过程无法连续 跟踪，且同位素对人体有损伤作用。辐射猝灭会引起 测定误差，如3HБайду номын сангаас射的射线很弱，甚至会被纸吸收。
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二、酶活力的测定
4.电化学方法
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一、酶活力
3.酶的比活力
酶的比活力代表酶的纯度，通常用下式表示： 酶比活力=[ 酶活力单位数(U) / 蛋白质量(mg) ]
有时也采用每克(g)酶制剂或每毫升(mL)酶制剂含 有多少个活力单位来表示。 比活力的大小可用来比较每单位质量蛋白质的催化 能力。比活力是酶学研究及生产中经常使用的指标。
他条件，应适量添加。
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二、酶活力的测定
③反应时间：在一定条件下，将一定量的酶液与底物溶 液混合均匀，适时记下反应开始的时间。反应到一定时 间及时终止反应。终止酶促反应的方法要根据酶的特性、 反应底物或产物的性质以及检测方法等加以选择。常用： 加热、添加酶变性剂、加入酸液或碱液、冰浴等。
④底物或产物的变化量：反应到一定时间，取出适量的 反应液，运用各种生化检测技术，测定产物增加量或底 物的减少量。为了准确地反应酶促反应的结果，应尽量 采用快速、简便、准确的方法测出结果。
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二、酶活力的测定
2.酶活力的测定方法
测定反应液中物质的变化量，可采用光学检测 法、化学检测法等生化检测技术。 一种酶可能有多种测定方法，要根据实际情况 选用。